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AULA PRÁTICA 1: PREPARO DE SOLUÇÕES E MEIOS DE CULTIVOPREPARO DE SOLUÇÕES USADAS NA MICROBIOLOGIAa) Preparo da solução de lugol: ã Pesar 12,5 g de iodo metálico ã Pesar 20,0 g de iodeto de potássio ã Hidratar com 100 ml de água destilada ã Filtrar com auxílio de papel filtro para um frasco conta gotasNum copo de bécker transferir as 20g de iodeto de potássio e as 12,5g de iodo metálico. Hidratamos a misturacom 100 ml de água destilada; homogeneizamos a solução com bastão de vidro e - com papel filtro adaptado aum funil de vidro - filtramos a solução passando-a para recipientes com conta gotas (frasco escuro). b) Preparo do álcool etílico 70%: ã Medir em proveta de 1L, 700 mL de álcool etílico comercial; ã Acrescentar 300 mL de água destilada; ã Usar alcoômetro GL para verificar a concentração verdadeira do álcool na solução preparada, ou calcular considerando a porcentagem de hidratação do álcool comercial.- Guardar em frasco fechado. c) Preparo da solução de álcool iodado: ã 8 ml de lugol ã 300 ml de água destilada ã Álcool etílico 70% q.s.p. 1000 mlColocar os 8 ml de lugol e os 300 ml de água destilada num balão volumétrico de 1000 ml - com uma pipeta euma proveta respectivamente. Completar para o volume de 1000 ml com álcool 70%. PREPARO DE MEIOS DE CULTIVO DESIDRATADOSMeios Solidificados A técnica empregada para reidratar os meios desidratados tem decisiva importância na obtenção deum meio de boa qualidade. De maneira geral, convém:1.Dissolver o meio (quantidade especificada pelo fabricante e conforme a necessidade de uso), apenasnuma parte do volume total de água destilada;2.Homogeneizar, evitando a formação de bolhas e de espuma;3.Adicionar o restante da água destilada, lavando as paredes do recipiente;4.Dissolver o meio por aquecimento em banho-maria ou local adequado, sob constante agitação, demaneira a evitar a ebulição do meio de cultivo e/ou seu super-aquecimento. O meio apresenta-secompletamente dissolvido quando está translúcido e/ou quando as partículas de ágar ou demaisnutrientes não mais estiverem aderidas às paredes do recipiente;5.Resfriar sem permitir solidificação;6.Verificar o pH, ajustando-o caso necessário; UNIVERSIDADE TECNOLÓGICA FEDERAL DO PARANÁ PR Universidade Tecnológica Federal do Paraná Departamento Acadêmico de Química e BiologiaTecnologia em Processos Ambientais Disciplina: Microbiologia 7.Acondicionar corretamente em frascos e levar à esterilização em autoclave . 8. Resfriar a aproximadamente 45 o C e dispensar de maneira asséptica nos recipientes apropriados aouso. Caldos – meios líquidos 1.Dissolver o meio (quantidade especificada pelo fabricante e conforme a necessidade de uso), apenasnuma parte do volume total de água destilada;2.Homogeneizar, evitando a formação de bolhas e de espuma;3.Adicionar o restante da água destilada, lavando as paredes do frasco4.Verificar o pH, ajustando-o caso necessário;5.Acondicionar corretamente em frascos e levar à esterilização em autoclave. Armazenamento dos meios de cultivo Os meios após esterilização devem ser resfriados à temperatura ambiente e armazenados em geladeira,preferencialmente dentro de sacos plásticos para diminuir a desidratação. Podem ser conservados por 15 diasno refrigerador. ROTEIRO DA PRÁTICA 1. Preparar 1L de álcool 70% 2. Preparar 150 mL de ágar __________________: - Pesar a quantidade necessária de ágar - Colocar o meio desidratado e reidratar com a quantidade necessária de água destilada;- Aquecer até ferver para completa dissolução;- Esterilizar em autoclave por 15 min a 121 o C;- Guardar o meio na geladeira para posterior utilização ou distribuir em placas de Petri e armazenar na geladeira em sacos plásticos. 3. Preparar 150 mL de solução salina: - Pesar a quantidade necessária de NaCl- Dissolver em 50 mL de água destilada;- Pipetar em 5 tubos de ensaio médios 9 mL de água peptonada;- Colocar tampões de algodão nos tubos de ensaio;- Autoclavar por 15 min a 121 o C;- Guardar na geladeira para posterior utilização. 4. Preparar 200 mL de caldo BHI e distribuir 6 mL em tubos de ensaio. Seguir asrecomendações do fabricante. Acondicionar adequadamente. Esterilizar. 5. Preparo da Cabine de fluxo laminar (CSB) para distribuição de meios de cultivo emplacas Seguir as normas de procedimento recomendadas para limpeza e desinfecção (fixado noequipamento) 6. Preparo de pipetas graduadas para esterilização: 1mL, 2mL; 5mL e 10mL. 7. Preparo de placas de Petri para esterilização. QUESTÕES 1. Quais os cuidados que se devem ter ao preparar meios de cultivo?2. Por que se deve autoclavar o meio de cultura após o seu preparo?3. Porque se deve guardar o meio de cultura na geladeira?4. Qual a diferença na preparação do meio sólido para o meio líquido?5. Como se sabe se um meio sólido está totalmente dissolvido?6. Para que serve a água peptonada e a solução salina?7. Para que serve o Agar-Agar? Qual é a sua constituição básica?Porque o Agar-Agar é um dos melhores agentes solidificante de meios de cultura?9. Fale sobre os extratos usados na microbiologia.10. Fale sobre as peptonas.11. Fale sobre os meios de cultura desidratados.12. Qual a temperatura em que o agar se liquefaz?13. Porque se deve evitar a fervura do meio de cultivo?14. Ao se retirar um meio de cultivo da geladeira é necessário sua prévia ambientação a temperaturado laboratório, antes do uso. Porque?15. Porque todo o trabalho deverá ser feito ao redor do bico de Bunsen ou em Câmara de fluxolaminar?16. O que é teste de esterilidade do meio de cultura e qual a importância deste procedimento?17. Porque as placas de Petri devem ser guardadas invertidas na geladeira? COMPOSIÇÃO DE MEIOS DE CULTIVOSPRÁTICA 1-CALDO SINTÉTICO – preparar 50 mL e distribuir em tubos pequenos (mínimo 6)Glucose2gSulfato de amônio4,8 gCloreto de sódio5gFosfato ácido de potássio 0,2 N100mLÁgua destilada q.s.p.1000 mLpH final72-MEIO ISENTO DE CARBONOBase:preparar 60 mL e distribuir em 2 placas de petri estéreis Este é base para os itens 2.2 e 2.1Sulfato de amônio4,8 gCloreto de sódio5gFosfato ácido de potássio 0,2 N100mLAgar15gÁgua destilada q.s.p.1000 mLpH final72.1 – adicionar glicose 2g/L - preparar 60 mL e distribuir em 2 placas de petri estéreis2.2 – adicionar citrato de sódio2g/L - preparar 60 mL e distribuir em 2 placas de petri estéreis 3- AGAR ENDO – meio seletivo para Escherichia coli Preparar 60 mL, conforme especificado na embalagem, e distribuir em 2 placas de petriestéreis. 4-CALDO SIMPLES ADICIONADO DE EXTRATO DE LEVEDURA - preparar 50 mL e distribuir em 6 tubos pequenos.Extrato de levedura 5gCaldo simples q.s.p1000mLpH final6.65-CALDO SIMPLES:Extrato de carne3gPeptona5gÁgua destilada q.s.p.1000 mLpH final 6,8 6- AGAR CETRIMIDE – meio seletivo para Pseudomonas .Preparar 60 mL, conforme especificado na embalagem, e distribuir em 2 placas de petri estéreis.7-AGAR GELATINA. - Preparar 60 mL e distribuir em tubos de ensaio pequenos (mínimo 6).Peptona de carne 5gExtrato de carne3gGelatina120 gAgar 10gÁgua destilada q.s.p.1000 mLpH final7,08-MEIO BASE DE VERMELHO FENOL - este serve de base para os itens8.1 e 8.2.Peptona10gExtrato de carne1gCloreto de sódio5gVermelho de fenol2 mLÁgua destilada q.s.p.1LpH 7,48.1- Teste da lactose : Lactose10g/L Preparar 80 mL e distribuir em tubos de ensaio grandes (mínimo 6).8.2- Teste da glicose: Glicose10g/L Preparar 80 mL e distribuir em tubos de ensaio grandes. Adicionar tubosde Durhan (mínimo 6 tubos grandes).9-MEIO PARA TESTE PRODUÇÃO DE ÁCIDO SULFÍDRICO - preparar 50 mL e distribuir em 6tubos pequenos.Peptona30gExtrato de carne3gSulfato férrico0,2gTiossulfato de sódio0,025gAgar20gÁgua destiladaq.s.p.1L10-MEIO ISENTO DE NITROGÊNIO – este serve de base para os itens 10.1 e 10.2Base:preparar 60 mL e distribuir em 2 placas de petri estéreisGlicose2gCloreto de sódio5gFosfato ácido de potássio 0,2 N100mLAgar30gÁgua destilada q.s.p.1000 mLpH final7
