Transcript
CURS 8 Enzime cu importanţă în industria alimentară
Oxidoreductazele Numeroase o x i d o r e d u c t a z e intervin în procesele metabolice, atât anaerobe cât şi aerobe: glicoliza, fermentaţii, ciclul acizilor tricarboxilici, catena de respiraţie celulară etc., care se desfăşoară în diversele materii prime alimentare şi în procesele fermentative de obţinere a unor produse alimentare.
Oxidoreductazele catalizează reacţiile de oxidoreducere prin diferite mecanisme: Transfer Transfer
de hidrogen (transhidrogenaze, dehidrogenaze); de electroni (transelectronaze);
Combinarea
directă a unui substrat cu oxigenul molecular (oxidaze).
• Activitatea Activitatea catalitic catalitică ă a acestor enzime enzime este exercitată exercitată prin intermediul unor c o e n z i m e , care se comportă ca acceptori
intermediari între substratul donor şi cel acceptor, care pot fi:
Nicotin-adenindinucleotidice NAD, NADP +;
Nucleotide flavinice : flavinmononucleotidul FMN
flavinadenindinucleotidul FAD
Oxidoreductaze FAD- dependente (flavinenzime sau dehidogenaze aerobe) • Au drept coenzime FAD sau FMN, derivaţi ai riboflavinei,
vitamina B2. Unele flavinenzime conţin în molecula lor şi ioni metalici (ca, de exemplu, Fe), care le conferă uneori şi funcţia de transportori electroni.
Denumite şi flavinenzime sau dehidrogenaze aerobe, au ca reprezentant g l u c o z o x i d a z a obţinută din Aspergillus niger şi Penicillium vitale. Aplicaţii. G l u c o z o x i d a z a se utilizează în reacţia oxidare a glucozei la acid gluconic, în tehnologia obţinere a albuşului de ou (praf). In acest produs trebuie să existe glucoza liberă, care ar participa, aminoacizii liberi la procesul de îmbrunare Maillard.
de de nu cu
Oxidoreductaze NAD - dependente (dehidogenaze anaerobe) Catalizează procesele reversibile de oxidoreducere caracterizate prin transfer de hidrogen de pe un substrat donor pe altul acceptor şi au un caracter anaerob, deoarece acceptorul de hidrogen este altul decât oxigenul: dehidrogenaze, transhidrogenaze şi dehidraze. Intervin în numeroase procese catabolice oxidative ale alcoolilor, aldehidelor, aminoacizilor. Catalizează mai ales procese anabolice reductive. Ele sunt in diverse organe şi ţesuturi animale şi vegetale, precum şi în diferite microorganisme.
Oxidoreductaze NAD+ sau NADP+ dependente Cei mai importanţi reprezentanţi şi aplicaţiile acestora sunt prezentaţi în cele ce urmează: • A l c o o l d e h i d r o g e n a z a catalizează transformarea alcoolului etilic în acetaldehidă (care apoi este transformată cu ajutorul a c e t a l d e h i d d e h i d r o g e n a z e i în acid acetic). Reacţie importantă în fenomenul de fermentaţie acetică, realizat de bacteriile acetice în biotehnologia obţinerii oţetului de vin ( Acetaldehiddehidrogenaza catalizează oxidarea aldehidei acetice în acid acetic, în procesul de oţetire). Lactatdehidrogenaza catalizează (în condiţii anaerobe) reducerea acidului piruvic cu formare de acid lactic. Acidul lactic reprezintă etapa finală a fermentaţiei lactice.
Oxidoreductaze: Oxidaze Oxidazele catalizează reacţiile diferitelor substraturi cu oxigenul molecular sau cu peroxizii, fiind caracterizate prin transfer de hidrogen de pe un donator pe un acceptor care este oxigenul molecular. Ca produs de reacţie se formează H2O2 sau H2O. Oxidazele, în funcţie de mecanismul de acţiune, se clasifică: •-oxigenaze (monooxigenaze şi dioxigenaze), •-oxidaze transportoare de electroni (citocromoxidaza, cupruoxidazele etc), •-hidroxiperoxidaze (catalaze şi peroxidaze). •L i p o x i g e n a z a (carotenoxidază), catalizează oxidarea acizilor graşi
polinesaturaţi cu ajutorul O2. Sunt oxidate şi gliceridele şi metilesterii acizilor graşi menţionaţi formându-se peroxizii respectivi. • Se găseşte în soia, mazăre, fasole, arahide, cartofi, ridichi. Temperaturile
scăzute nu inhibă activitatea enzimei, care este responsabilă de producerea mirosurilor nedorite din produsele vegetale. Lipoxigenaza din soia se utilizează la albirea fainii de grâu, prin distrugerea carotenilor.
Oxidoreductaze: Oxidaze • Peroxidazele catalizează
reacţiile de oxidoreducere în prezenţa peroxizilor (de hidrogen sau alt peroxid organic). Peroxidazele sunt larg distribuite în microorganisme (bacterii, drojdii), în
plante (napi, gulii, cartofi, smochine) şi diferite alte legume şi fructe, în ţesuturi şi lichide biologice animale ca, de exemplu, ficat, lapte, salivă, în leucocite etc. • Dintre peroxidaze, cea mai bine studiată şi caracterizată este peroxidaza din hrean. Proprietăţi asemănătoare s-au găsit şi în cazul altor peroxidaze ca, de exemplu, peroxidaza din ficat, lactoperoxidaza din lapte etc. Datorită termostabilităţii lor, determinarea activităţii peroxidazice din diferite legume şi fructe este folosită ca un indice al eficienţei tratamentelor termice aplicate în procesele de sterilizare. • Determinarea activităţii lactoperoxidazei este folosită la urmărirea eficienţei
pasteurizării în industria laptelui.
• Diferitele peroxidaze intervin în degradarea fructelor şi legumelor, fiind
implicate în modificarea mirosului şi gustului (mai ales la mazăre, fasole etc.) în procesele de îmbrunare enzimatică.
Oxidoreductaze: Oxidaze • Catalază reprezintă o peroxidaza specială care oxidează
o moleculă de H2O2 la oxigen, cu reducerea simultană a celei de a doua molecule la H 2O. catalaza
2H2O2
2H20+l/202
Surse comerciale de catalază sunt ficatul de bovine, Aspergillus niger, Micrococcus lysodeikticus (enzima este eliberată prin liza peretelui bacterian). • Aplicaţii: catalază este utilizată la descompunerea apei
oxigenate reziduale, când este folosită pentru sterilizarea la rece a laptelui la fermă sau dacă laptele este utilizat la fabricarea brânzeturilor.
Evidenţierea enzimelor bacteriene Testul catalazei
- e videnţierea catalazei
catalaza
descompune apa oxigenată în apă şi oxigen oxigenul eliberat se evidenţiază prin formarea bulelor de gaz metoda: cultura de cercetat se suspendă pe o lamă într -o pic. de H2O2 Pe o lama de microscop se depune 1-2 picaturi de H 2O2 , peste picatura de reactiv se adauga coloniile testate.
Se urmăreşte: producerea de catalază de către bacterii (staphylococi, streptococi ). Interpretare: test pozitiv - eliberare de oxigen (efervescenţă) în prezenţa apei oxigenate test negativ - lipsa efervescenţei
stânga - bacterii catalazo-negative dreapta - bacterii catalazo-pozitive
bacterii catalazo-pozitive
HIDROLAZELE Aceste enzime scindează hidrolitic substraturile, acţionând asupra legăturilor C-O, C-N, C-S, C-C etc. Principalele hidrolaze de interes pentru biotehnologiile alimentare sunt: Lipazele,
esterazele şi fosfolipazele;
Amilazele; Celulazele Enzimele
şi hemicelulazele
pectolitice
Peptidhidrolazele
HIDROLAZELE - Lipazele, esterazele şi fosfolipazele Lipazele, esterazele şi fosfolipazele (Enzimele lipolitice) – sunt importante în metabolismul şi degradarea lipidelor. Lipazele sunt utilizate în industria alimentară, în diferite etape tehnologice, cum ar fi: Hidroliza
controlată a lipidelor din unele alimente (brânzeturi, salamuri crude), în faza de finisare (maturare), când acizii graşi rezultaţi pot participa la aroma produsului;
Unele
preparate enzimatice se utilizează la maturarea brânzeturilor:
Lipaza
gastrică;
Lipaza
pancreatică;
Esteraze
pregastrice;
Esteraze
obţinute din unele mucegaiuri: Penicillium caseicolum, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Mucor miehei; bacteriene produse de Pseudomonas fluorescens şi Pseudomonas fragilis.
Esteraze
Hidrolaze - Lipazele, esterazele şi fosfolipazele Mecanisme de acţiune: Lipazele
acţionează asupra trigliceridelor, având afinitate pentru acizii graşi cu catenă lungă; Esterazele
acţionează faţă de gliceridele ce conţin acizi graşi cu catenă
scurtă; Fosfolipazele
(lecitinazele) sunt de mai multe tipuri, în funcţie de legătura asupra căreia acţionează din cadrul mo leculei de fosfolipide. Fosfolipazele sunt activate de Ca2+ şi de sărurile care menţin lipidele în stare de emulsie.
Degradarea necontrolată a lipidelor din unele alimente cu conţinut ridicat în grăsimi, conduce la acumularea de acizi graşi liberi, ceea ce determină creşterea acidităţii produsului şi apariţia gustului de rânced. Pentru a diminua lipoliza necontrolată, se recomandă: reducerea
conţinutului de apă liberă a materiei prime,
reducerea
timpului de conservare,
asigurarea
produselor.
unei temperaturi scăzute pe parcursul depozitării materiei prime şi a
Hidrolaze: enzime oligozidazice Importante pentru industria alimentară sunt βglucozidaza, β-D-galactozidaza, α-D-galactozidaza şi α-Dfructofuranozidaza. β-Glucozidaza denumită şi emulsină - scindează legătura -glucozidică din -glucozii răspândiţi în plante cum ar fi amigdalina, prunazina, naringina, dar şi din celobioză şi genţiobioză. • Această enzimă este produsă şi de unele microorganisme: Alcaligenes faecalis, Botryodiplodia theobromae, Aspergillus niger, Saccharomyces lactis etc. •Aplicaţii: este utilizată pentru îndepărtarea gustului amar al sucului de grapefruit.
Hidrolaze: enzime oligozidazice α - Galactozidaza este
elaborată de Bacillus stearothermophilus, Penicillium duponti, Absidia griseola, Mortierella vinaceae, Aspergillus awamori.
• mecanism de acţiune: Substratul natural al acestei enzime este rafinoza
(descompune rafinoza în galactoză şi zaharoză). • • Aplicaţii: este utilizată în industria zahărului şi anume pentru extragerea
zahărului din melasă, respectiv pentru hidroliza rafinozei din melasă, în zaharoză şi galactoză. -Galactozidaza cunoscută şi sub numele de lactază hidrolizează lactoza in glucoză şi galactoză. Este găsită în unele plante, microorganisme şi în mucoasa intestinală a mamiferelor. Este obţinută din tulpini de mucegaiuri ( Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Aspergillus foetidis), din drojdii (Kluyveromyces fragilis, Kluyveromices lactis, Candida pseudotropicalis, T orulopsis lactis) şi bacterii (Lactobacillus bulgaricus, Streptcoccus thermophillis, Escherichia coli). • • Aplicaţii: se utilizează ca preparate enzimatice în industria laptelui, în special
la obţinerea laptelui şi a produselor lactate delactozate, destinate copiilor cu intoleranţă la lactoza; • laptele tratat cu lactază este mai dulce şi pentru obţinerea unor băuturi lactate
aromate nu mai necesită să se adauge zahăr.
Hidrolaze: amilazele Amilazele descompun amidonul, care este alcătuit din amiloză
şi amilopectină. După tipul de legături hidrolizate, amilazele se clasifică astfel: •Enzime care hidrolizează legăturile glucozidice α -1,4 (α - amilaza şi β-
amilaza); •Enzime care hidrolizează legăturile glucozidice α -1,6 (pullulanaza şi
izoamilaza); • -amilazele pot fi de origine animală (amilaza produsă de glanda salivară şi pancreas), de origine vegetală (cereale încolţite în special malţ) cu importanţă în industria berii, spirtului şi panificaţiei şi de origine microbiană (bacterii, mucegaiuri şi mai puţin drojdii), cele de origine bacteriană fiind mai stabile la căldură decât cele de origine fungică. Surse importante de -amilază sunt orzul, grâul, secara, cartofii dulci şi soia. Recent s-a dovedit că este produsă şi de unele microorganisme (Bacillus, Streptomyces), având pH-ul optim la 5-6 şi temperatura optimă la 60 °C.
Hidrolaze: celulaze Celulazele sunt folosite pentru hidroliza celulozei de provenienţă vegetală, până la glucoză care, la rândul ei, este folosită ca sursă de carbon pentru procese de biosinteză (de exemplu, acizi organici); producţia de alcool etilic prin fermentaţie; producerea de biomasă cu ajutorul microorganismelor. •Aplicatii: se utilizează şi în industria sucurilor de fructe împreună cu hemicelulazele şi enzimele pectolitice, precum şi în industria berii, împreună cu hemicelulazele, pentru îndepărtarea celulozei.
Hidrolaze: enzime pectolitice Enzimele din această grupă hidrolizează substanţele pectice (acţionează asupra substanţelor pectice) din unele produse vegetale, în special din mere şi citrice. Substanţele pectice au caracter gelifiant şi sunt reprezentate de polimeri ai acidului galacturonic. Aplicatii: Aceste enzime sunt utilizate în industria sucurilor de fructe şi legume şi la obţinerea mustului de struguri (optimizarea gradului de extracţie, limpezire etc) sunt utilizate pentru ameliorarea extracţiei sucului celular din fructe şi legume (prin degradarea pereţilor celulari), pentru macerarea fructelor şi legumelor în vederea obţinerii de nectaruri (prin degradarea substanţelor pectice ale lamelelor mijlocii care asigură legătura dintre celule, fără a se distruge pereţii celulelor parenchimatoase) şi pentru limpezirea (clarificarea) diferitelor categorii de sucuri.
Hidrolaze: peptidhidrolazele Aceste hidrolaze (enzime proteolitice) scindează legăturile p e p t i d i c e din proteine, oligopeptide, având ca rezultat obţinerea de peptide cu masă moleculară mai mică şi aminoacizi. Peptidhidrolazele pot fi de provenienţă: •vegetală, •animală, •microbiană.
Se subdivid în endo- şi exo-peptidhidrolaze. - E n d o - p e p t i d h i d r o l a z e l e, denumite şi proteinaze hidrolizează legăturile peptidice din interiorul catenelor polipeptidice ale proteidelor şi proteinelor cu masă moleculară mare, producând catene polipeptidice de masă moleculară mai mică, iar exo-peptidhidrolazele , peptidazele sau exopeptidazele catalizează desfacerea hidrolitică a legaturilor peptidice de la extremităţile catenelor polipeptidice sau oligopeptidice, conducând, în general, la eliberarea de aminoacizi.
Hidrolaze: peptidhidrolaze vegetale Peptidhidrolazele de origine vegetală sunt proteinazele alcaline (tiolice), utilizate în special în industria cărnii, la procesul de frăgezire. •Ex: bromelina (obţinută din sucul de ananas), •papaina (din latexul fructelor Caryca Papaia, cu puţin înainte de
coacerea acestora) şi •ficina (din latexul fructului de smochin).
Peptidhidrolazele de origine animală sunt: c h i m o z i n a şi p e p s i n a cu acţiune coagulantă , t r ip s i n a cu acţiune proteolitică. •Chimozina - cheagul sau labfermentul este obţinută din stomacul
glandular de rumegătoare (viţel, miel, ied); Unele microorganisme sintetizează proteinaze asemănătoare chimozinei: Mucor pusillus, Endothia parasitica, Aspergillus oryzae, Irpex lactis. In legătură cu chimozina menţionăm următoarele:
Hidrolaze: de origine animala • chimozina, pepsina şi tripsina, cărora li se adaugă chimotripsina,
elastaza şi carboxipeptidazele, aminopeptidazele şi dipeptidazele, produse de diferite glande digestive. Cu excepţia ultimelor două tipuri de exo-peptidaze, celelalte peptidhidrolaze sunt produse de glandele digestive sub formă de proenzime (preenzime sau zimogene) inactive, care devin active numai în urma scindării hidrolitice a unor porţiuni din structura lor, ce blochează activitatea lor enzimatică. Conversia proenzimelor în enzime active se realizează pe cale autocatalitică, care conduc la enzima activă şi fragmente polipeptidice inactive enzimatic.
Hidrolaze: de origine animala C h i m o z i n a - este elaborată sub formă de prochimozină (forma
inactivă), care se transformă în chimozina la pH 2,0 şi pe cale autocatalitică la pH 5,0. -
are pH-ul optim de acţiune de aproximativ 5 şi este inactivată în 15 minute, la 50°C; -
are acţiune coagulantă asupra laptelui şi proteolitică asemănătoare pepsinei şi este utilizată la prepararea brânzeturilor; -
diferite laboratoare au clonat gena care codifică sinteza prochimozinei bovine, la E. coli. Enzimă sintetizată de bacterie are proprietăţi identice cu cea naturală. La investigaţii prin imunodifuzie în gel de agar cele două enzime au fost identice, însă testul ELISA a evidenţiat unele mici deosebiri. Ulterior gena a fost clonată şi la Saccharomyces cerevisiae (Stroh W.H., 1998).
Hidrolaze: de origine animala • P e p s i n a este o endo-peptidază produsă sub formă de p e p s i n o g e n de glandele stomacale ale mamiferelor inclusiv ale
omului şi care se găseşte şi în sucul gastric al păsărilor, reptilelor şi peştilor. Se transformă în pepsină activă la pH<5, în prezenţa ionilor de H+ sau autocatalitic (în prezenţa pepsinei formate anterior). Pepsina se caracterizează prin următoarele: - are acţiune proteolitică, prin scindarea hidrolitică a legăturilor peptidice, acţionând de preferinţă la nivelul legăturilor peptidice mai ales la nivelul aminoacizilor aromatici (triptofan, tirozină, fenilalanină) şi dicarboxilici (acizii aspartic şi glutamic); -
are pH-ul optim de actiune 1,5 – 2,5. Pepsina este folosită la
precipitarea cazeinei, obţinerea de peptone, în unele ţări pentru limpezirea berii la rece, ca adjuvant digestiv şi este inclusă în reţeta de preparare a unor băuturi tonice.
Hidrolaze: de origine animala T r i p s i n a este tot o endo-
peptidază, care desface hidrolitic legăturile peptidice în interiorul catenelor polipeptidice, de preferinţă cele constituite între gruparea carboxil a unui aminoacid diaminic (arginina, lizina) şi gruparea aminică a altui rest de aminoacid. Este produsă de pancreas sub formă de tripsinogen, forma inactivă, care se transformă în tripsină activă în intestinul subţire sub acţiunea enterochinazei (o enzimă intestinală) sau pe cale autocatalitică (în prezenţa tripsinei formate anterior).
Hidrolaze: de origine animala • Catepsinele sunt peptidhidrolaze localizate intracelular,
la nivelul lizozomilor, în ţesutul muscular, ficat, splină, rinichi, pulmoni etc. Sunt mai multe tipuri de catepsine (A, B, C, D, E) şi acţionează hidrolitic asupra proteinelor tisulare în procesele autolitice.
Hidrolaze: de origine microbiana Peptidhidrolazele de origine microbiană sunt sintetizate de mai multe microorganisme, însă sunt utilizate in Industria alimentară numai tulpinile nepatogene şi netoxigene, aparţinând speciilor: Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Streptomyces sp., Rhizopus sp., Mucor miehei, Mucor pusillus etc. Proteinazele microbiene sunt asemănătoare celor vegetale sau animale. Dintre aceste amintim: subtilizina, metaloproteinazele microbiene, proteinazele acide microbiene etc.
Izomeraze catalizează aranjăril e r e Reprezintă enzime care i n t r a m o l e c u l a r e , în structurile asupra cărora acţionează. •Exemplu: glucozizomeraza, care determină conversia D-glucozei în
D-fructoză şi este folosită în industria amidonului, pentru obţinerea siropului de glucoza cu conţinut ridicat de fructoză.
Pentru producerea industrială de glucozizomeraza se utilizează diferite tulpini microbiene de Streptomyces olivaceus, Streptomyces olivochromogenes, Streptomyces rubiginosus, Bacillus coagulans etc. In această clasă de enzime mai sunt grupate racemazele şi epimerazele, cis-trans izomerazele, oxidoreductazele intramoleculare, transferazele intramoleculare, liazele intramoleculare etc., care intervin în diferitele procese ale metabolismului glucidelor, lipidelor şi proteidelor din organismele vegetale şi animale.
