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La catalisi enzimatica
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Le proprietà generali degli enzimi
Concetti chiave • Gli enzimi si differenziano dai catalizzatori chimici di uso comune per velocità, condizioni, specificità e controllo della reazione. • Le proprietà fisiche e chimiche uniche del sito attivo limitano l'attività degli enzimi a substrati e reazioni specifiche. • Alcuni enzimi richiedono ioni metallici o cofattori organici.
Il fattore 1011
Fig. 8-1.jpg
Termodinamica e cinetica chimica
Velocità di Reazione
Catalisi Chimica vs Enzimatica
Le velocità delle reazioni catalizzate dagli enzimi sono elevate
Gli enzimi agiscono su substrati specifici
Interazioni stereospecifiche enzima-substrato
Gli enzimi sono macchine molecolari
Alcuni enzimi catalizzano reazioni altamente stereospecifiche
Alcuni enzimi sono più permissivi
Gli enzimi sono classificati in base al tipo di reazione che catalizzano
Classificazione degli Enzimi http://www.expasy.org/enzyme
Nome raccomandato e nome sistematico. Numero di Classificazione: Numero a quattro cifre preceduto da EC (Enzyme Commission: la prima cifra indica la classe, la seconda la sotto-classe, la terza la sotto-sotto-classe, la quarta il numero seriale).
Unità di attività enzimatica e dosaggio degli Enzimi Catal (kat, nel sistema SI): è la quantità di enzima che converte 1 mole di reagente nel prodotto in 1 secondo nelle condizioni di reazione standard (ottimali). L’Unità internazionale (U o UI): corrisponde alla quantità di enzima che converte 1 mole di reagente nel prodotto in 1 minuto, nelle condizioni di reazione standard (ottimali). Poiché 1 mole/min = 1,67 10-8 moli/s, 1U = 1,67 10-8 kat. L’attività specifica: è il rapporto tra il numero di U o di kat e il volume che la contiene (U/mL) o la quantità totale di proteina espressa in milligrammi (U/mg).
Effetto del pH L’attività enzimatica è influenzata dal pH. Ciò può derivare dai valori di pKa del substrato e/o dell’enzima. Perciò il pH scelto e la selezione di un tampone appropriato sono fondamentali per i saggi di attività enzimatica.
Amminoacidi nel sito catalitico o implicati nella stabilizzazione della conformazione nativa
Effetto della temperatura Le reazioni enzimatiche, come le reazioni chimiche, dipendono dalla temperatura; tuttavia, ad una determinata soglia, il moto di agitazione termica denatura l’enzima
Proprietà degli Enzimi Gli enzimi, come legenerali altre proteine, sono classificati come semplici (se costituite esclusivamente da amminoacidi) o coniugati (se contengono metalli o composti organici). Nel loro complesso, gli elementi non amminoacidici che si aggiungono alla porzione proteica di un enzima coniugato vengono detti cofattori. La maggior parte dei cofattori organici, i coenzimi, sono derivati di vitamine solubili in acqua. Gli ioni metallici sono i più comuni cofattori inorganici. Gli enzimi la cui forma attiva comprende uno o più metalli saldamente legati alla matrice proteica (Fe2+, Fe3+, Cu2+, Cu+, Zn2+, Mn2+, Co3+ o Mo3+) sono detti metalloenzimi (un terzo degli enzimi conosciuti). Gli enzimi attivati da metalli (Na+, K+, Mg2+ o Ca2+) richiedono solo un legame debole di questi.
I cofattori ampliano il range delle reazioni enzimatiche
APOENZIMA (Enzima – cofattore) OLOENZIMA (Enzima + cofattore)
Coenzimi e Gruppi prostetici Se i cofattori organici si legano reversibilmente all’enzima, sono detti coenzimi (p.e., NAD, FAD). Se i cofattori organici sono legati permanentemente all’enzima, sono indicati come gruppi prostetici (p.e., eme)
Esempi di enzimi e loro cofattori Beriberi
Pellagra
Anemia perniciosa
COFATTORI organici (e vitamine) NAD(P) niacina (o vit B3) FAD e FMN riboflavina (o vit B2) Ubichinone (o CoQ) CoA pantotenato (o vit B5) Eme NTP TPP tiamina THF folato PLP piridossina (o vit B6) Biotina Cobalammina vit B1 Cofattori.pdf
Scheda riassuntiva dei principali coenzimi
Struttura e reazione del NAD(P)+
Le proprietà generali degli enzimi
Punto di verifica • Quali proprietà consentono di distinguere gli enzimi dagli altri catalizzatori? • Descrivete come sono classificati e nominati i diversi enzimi. • Quali sono i fattori che influenzano la specificità per il substrato di un enzima? • Per quale motivo i cofattori sono necessari per determinate reazioni enzimatiche? • Qual è la correlazione tra cofattori, coenzimi e gruppi prostetici?
L'energia di attivazione e la coordinata di reazione
Concetti chiave • Un enzima fornisce un percorso a bassa energia per convertire un substrato in prodotto, ma non influenza la variazione di energia libera complessiva della reazione.
Catalisi
Diagrammi dello stato di transizione
°
Perché due molecole possano reagire devono scontrarsi e rompere i legami che tengono uniti i loro atomi; per far questo necessitano di sufficiente energia cinetica, tale da portarsi in stretta vicinanza l’una con l’altra superando la repulsione tra i rispettivi gusci elettronici. Lo stato di massima energia di un sistema di molecole reagenti è detto complesso attivato o stato di transizione. La barriera energetica che separa i reagenti dallo stato di transizione prende il nome di energia di attivazione (ΔG≠). Non si confonda ΔG con ΔG≠; il ΔG° (variazione di energia libera standard di reazione) è invece una misura della stabilità termodinamica relativa tra reagenti e prodotti. In altre parole, il ΔG° indica il punto di equilibrio della reazione.
Diagramma dello stato di transizione di una reazione a due tappe
Effetto di un catalizzatore sul diagramma dello stato di transizione
L'energia di attivazione e la coordinata di reazione Punto di verifica • Disegnate e identificate le varie parti dei diagrammi di transizione di stato per una reazione con e senza il catalizzatore. • Qual è la relazione tra ΔG e ΔG‡?
I meccanismi di catalisi Concetti chiave • Le catene laterali degli amminoacidi in grado di donare o accettare protoni possono prendere parte alle reazioni chimiche come catalizzatori acidi o basici. • I gruppi nucleofili possono catalizzare le reazioni tramite la formazione di legami covalenti transitori con il substrato. • Nella catalisi da ioni metallici le proprietà elettroniche tipiche dello ione metallico favoriscono la reazione. • Gli enzimi accelerano le reazioni avvicinando i gruppi reagenti e orientandoli correttamente. • La stabilizzazione dello stato di transizione può diminuire significativamente l'energia di attivazione di una reazione.
Catalisi Acida Generale Accelera la velocità della reazione mediante il trasferimento temporaneo di un protone da un acido di Bronsted al substrato. Es., His 57 nel sito catalitico della chimotripsina (primo stadio); His 119 nel sito catalitico della RNAsi A
Catalisi Basica Generale Accelera la velocità della reazione mediante il trasferimento temporaneo di un protone dal substrato ad una base di Bronsted. Es., l’His 12 nel sito catalitico della RNAsi A e l’His 57 nel sito catalitico delle serina proteasi (secondo stadio)
Catalisi Acido-Base Generale Prevede l’azione simultanea di un catalizzatore acido generale e di un catalizzatore basico generale sul substrato. Es., le due istidine nel sito catalitico dell’RNAsi A.
Struttura dell'RNasi S pancreatica bovina
Il meccanismo dell'RNasi A
Il meccanismo dell'RNasi A
Il meccanismo dell'RNasi A
Catalisi covalente Accelera la velocità edlla reazione attraverso la formazione temporanea di legami covalenti tra enzima e substrato. Prevede due tappe: òa prima, la tappa nucleofila serve per formare un legame covalente tra enzima e substrato; la seconda è la tappa elettrofila in cui si ha la perdita di elettroni dal centro della reazione verso un sito elettrofilo. Es., chimotripsina
Gruppi nucleofili ed elettrofili di rilevanza biologica
Gruppi nucleofili di rilevanza biologica
Esempio di catalisi covalente (tappa nucleofila: formazione legame E-S)
Gruppi elettrofili di rilevanza biologica
Esempio di catalisi covalente (fasse elettrofila: rottura del legame E-S)
Catalisi da effetto di prossimità e di orientamento
Aumenta la velocità della reazione mediante la vicinanza e l’immobilizzazione nel corretto orientamento dei gruppi reattivi all’interno del sito catalitico. L’energia libera necessaria per compiere questo lavoro è data dall’energia di legame del substrato all’enzima.
La catalisi per vicinanza e orientamento
Catalisi da metallo 1. Stabilizzazione di cariche, tramite interazioni elettrostatiche favorevoli tra metallo e gruppi reattivi del substrato 2. Promozione del corretto orientamento del substrato 3. Promozione delle reazioni redox 4. Catalisi elettrofila 5. Promozione della catalisi nucleofila mediante un aumento della ionizzazione dell’acqua
Ruolo dello ione Zn2+ nell'anidrasi carbonica
Anidrasi carbonica PDBid 1HCB
Ruolo dello ione Zn2+ nell'anidrasi carbonica
La catalisi attraverso il legame preferenziale dello stato di transizione
La catalisi attraverso il legame preferenziale dello stato di transizione
I meccanismi di catalisi Punto di verifica • Descrivete come i gruppi funzionali delle proteine agiscono da catalizzatori acido-base. Come è possibile per una singola catena laterale di un amminoacido comportarsi da acido e da base? • Spiegate in che modo i nucleofili funzionano da catalizzatori covalenti. Quali sono gli amminoacidi adatti a fare ciò? • Elencate i modi in cui gli ioni metallici prendono parte alla catalisi. • Quali sono i ruoli della vicinanza e dell'orientamento nella catalisi enzimatica? • Perché è improbabile che i catalizzatori non enzimatici agiscano legando preferenzialmente lo stato di transizione?
Le serina proteasi
Concetti chiave • I residui cataliticamente attivi di Ser, His e Asp delle serina proteasi sono stati identificati tramite marcatura chimica e analisi strutturale. • La tasca di legame determina la specificità del substrato delle diverse serina proteasi. • Le serina proteasi catalizzano l'idrolisi del legame peptidico per effetti di vicinanza e orientamento, catalisi acido-base, catalisi covalente, catalisi elettrostatica e stabilizzazione dello stato di transizione. • Gli zimogeni sono i precursori inattivi degli enzimi.
Le serina proteasi
Concetti chiave • I residui cataliticamente attivi di Ser, His e Asp delle serina proteasi sono stati identificati tramite marcatura chimica e analisi strutturale. • La tasca di legame determina la specificità del substrato delle diverse serina proteasi. • Le serina proteasi catalizzano l'idrolisi del legame peptidico per effetti di vicinanza e orientamento, catalisi acido-base, catalisi covalente, catalisi elettrostatica e stabilizzazione dello stato di transizione. • Gli zimogeni sono i precursori inattivi degli enzimi.
Tripsina di bovino con il suo inibitore leupeptina
Complesso covalente leupeptina-tripsina PDBid 2AGI
I residui del sito attivo della chimotripsina
Chimotripsina PDBid 2AGI
Organofosfati: I veleni per il sistema nervoso diisopropilfluorofosfato (DFP)
Target: enzimi con serina attivata Target vitale: acetilcolinesterasi
Il meccanismo di catalisi delle serina proteasi
Il meccanismo di catalisi delle serina proteasi
Il meccanismo di catalisi delle serina proteasi
Il meccanismo di catalisi delle serina proteasi
Il meccanismo di catalisi delle serina proteasi
Il meccanismo di catalisi delle serina proteasi
Stabilizzazione TS nelle serina proteasi
Tasche di specificità di serina proteasi
Il complesso tripsina-BPTI
