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INMUNOLOGÍA II UNIDAD II METODOS INMUNOLÓGICOS ESPECIALES Prof. QFB José Alberto Piña Ibarra
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Reacciones Ag - Ac
Aglutinación y precipitación Fijación del Complemento Métodos Inmunológicos Especiales Combinadas con electroforesis Inmunoelectroforesis Inmunoelectrofore sis y Western Blot Inmunofluorescencia Inmunoensayo : ELISA y RIA Varias : Inmovilización, serotipos, neutralización, protección Inmunomicroscopía Electrónicos
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Reacciones Ag - Ac
Aglutinación y precipitación Fijación del Complemento Métodos Inmunológicos Especiales Combinadas con electroforesis Inmunoelectroforesis Inmunoelectrofore sis y Western Blot Inmunofluorescencia Inmunoensayo : ELISA y RIA Varias : Inmovilización, serotipos, neutralización, protección Inmunomicroscopía Electrónicos
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ELECTROFORESIS
En 1937 Tiselius descubre la electroforesis y aplica este nuevo método al fraccionamiento de proteínas plasmáticas, identificando así los anticuerpos como las proteínas del suero que se desplazan más lentamente. Esta fracción recibió el nombre de gamma-globulina , quedando así asociados temporalmente, los conceptos de anticuerpo y de gammaglobulina, como equivalentes.
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Fig. 1
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Posteriormente, se comprueba que no todos los anticuerpos migran electroforéticamente con las gammaglobulinas, sino que muchos de ellos lo hacen con las alpha y beta globulinas. Esto se observó analizando los niveles de las distintas fracciones de globulinas antes y después de la inmunización de animales con un antígeno. 5
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Se concluye entonces, que no todos los anticuerpos son gammaglobulinas, por lo que Hebermans propone el término de inmunoglobulinas para designar a todas las sustancias con capacidad de anticuerpo. Hoy se conocen cinco tipos de inmunoglobulinas: IgM, IgA, IgG, IgD e IgE, cada una de ellas con ciertas características distintas
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Combinadas con electroforesis Finalidad separación electroforética componentes Ag Inmunoelectroforesis (Grabar y Williams) Contrainmunoelectroforesis (Laurell 1ª) Inmunoelectroforesis en cohete (Laurell 2ª) Western Blot
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Significado clínico Es una técnica inmunoquímica basada en la precipitación que tiene lugar cuando una proteína reacciona con su antisuero específico, en condiciones bien determinadas. Es un método analítico que se desarrolla en dos etapas, en el que una mezcla de proteínas es sometida a separación electroforética y, posteriormente, al estudio inmunoquímico (inmunodifusión). Para su interpretación se compara las bandas de precipitación del suero problema con el suero testigo normal. 10
INMUNO ELECTROFORESIS
Nombres alternativos Electroforesis de inmunoglobulina en suero; electroforesis de gammaglobulina
Es una técnica de laboratorio en la que se emplea una combinación de electroforesis proteínica y una interacción antígeno-anticuerpo. La electroforesis de proteínas se refiere a las inmunoglobulinas como grupo. La inmunoelectroforesis aumenta la capacidad para identificar las inmunoglobulinas específicas mediante el uso de anticuerpos específicos para las proteínas de interés. 11
Separación por electroforesis + Identificación por Inmunodifusión doble
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DESARROLLO DE LA TECNICA
Se cubre un portaobjetos con agar o agarosa. Con un adminiculo adecuado se corta un pozo para el antígeno y un canal para el anticuerpo. La muestra de suero se coloca en el pozo y se separa en un campo eléctrico Se coloca el antisuero en el canal y se permite que el suero y los anticuerpos se difundan durante 18-24 HR. Las líneas resultantes pueden fotografiarse, o bien se puede lavar, y teñir la laminilla para un registro permanente. 15
Utilidad clínica
Diagnóstico
de gamapatías monoclonales por ej. mieloma y macroglobulinemia de Waldeström. Evaluación
de gamopatías monoclonales
Enfermedades
linfoproliferativas (linfomas
malignos) Diagnóstico
y caracterización de estados inmunodeficientes y disgamaglobulinemias 16
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INMUNOFLUORESCENCIA
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ANTECEDENTES HISTORICOS La inmunofluorescencia descrita por Coons en 1941, consiste en revelar motivos antigénicos presentes sobre la estructura celular o tisular mediante la aplicación sobre las moléculas de los tejidos de un antisuero especifico que previamente se vuelve fluorescente por la fijación de fluorocromo. 20
INMUNOFLUORESCENCIA
Conjunto de técnicas diagnósticas empleadas para la detección de un antígeno o un anticuerpo en células o tejidos, mediante el uso de sustancias fluorescentes denominadas fluorocromos. Se emplean, de manera habitual, en el diagnóstico de enfermedades autoinmunes.
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INMUNOFLUORESCENCIA La
marcación de la Inmunoglobulina , que debe respetar la actividad anticuerpo, se obtiene poniendo en contacto anticuerpos purificados con el fluorocromo, y después se elimina el exceso de fluorocromo por diálisis o filtración sobre gel Sephadex.
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Fluoróforos: hidrocarburos poliaromáticos o heterociclos), llamados fluoróforos o colorantes fluorescentes. O
HO
O
O C OH R2
Fluoresceína
Los fluorocromos mas empleados : Son el isotiocianato de fluoresceína, que da una fluorescencia verde, y el isotiocianato de rodamina, que da una fluorescencia de color naranja.
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Técnicas de Inmunofluorescencia: a) Directa b) Indirecta c) De sándwich d) Complemento
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Fluorescencia 1944, A. Coons Acs conjugados fluorocromos
Fluorescencia Directa Indirecta 27
INMUNOFLUORESCENCIA
INMUNOFluorescencia directa: Modalidad de inmunofluorescencia en la cual los anticuerpos marcados con fluorocromos se unen directamente al antígeno. INMUNOFluorescencia indirecta: Modalidad de inmunofluorescencia en la cual los anticuerpos específicos no marcados se unen, en una primera etapa, al antígeno y, en una segunda etapa, al anticuerpo marcado con fluorocromo. Se denomina también inmunofluorescencia tipo sándwich, y su principal ventaja, frente a la inmunofluorescencia directa, es su mayor sensibilidad. 28
Inmunofluorescencia directa: La que mas se emplea para los cortes de tejido. Es por lo general, una prueba inmunohistoquímica ya que se utilizan anticuerpos marcados con especificidades conocidas para hacer visibles los antígenos correspondientes en frotis o en cortes de una sola capa de los materiales que llevan el antígeno. 29
Inmunofluorescencia indirecta: Sirve comúnmente para detectar anticuerpos en sueros humanos y de animales. Estas emplean antígenos conocidos, sueros de referencia y conjugados IgG anti-humanos.
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Inmunofluorescencia directa (presencia de antígeno en la muestra de una mujer con herpes genital) a virus Herpes simplex tipo 2 en una muestra genital. Se observa la presencia de células infectadas por el virus, teñidas en verde, acompañadas de hematíes teñidos en rojo con el contracolorante (IF013). 31
Inmunofluorescencia directa positiva (presencia de antígeno en la aspirado nasal de un niño con bronquiolitis) a virus respiratorio sincitial. Se observa la presencia de células infectadas con el citoplasma teñido de verde fluorescente. 32
http://www.facmed.unam.mx/deptos/microbiologia/parasito/protozoa/amibaslibres.htm 33
Fluoresceína, Rodamina, Ficoeritrina
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Inmunofluorescencia indirecta positiva (presencia de anticuerpos en el suero de un paciente con paludismo) a Plasmodium falciparum. Se observa la presencia de trofozoitos de Plasmodium falciparum, en el interior de los hematíes, teñidos de color verde fluorescente. 35
Inmunofluorescencia indirecta (FTA) positiva (presencia de anticuerpos en el suero) de un paciente con sífilis) sobre Treponema pallidum. Se observa la morfología de la espiroqueta con sus espiras regulares, de la misma longitud de onda, características del Género, teñida en verde con los anticuerpos fluorescentes. 36
Técnica de inmunofluorescencia indirecta. Células MS infectadas con el virus de la Peste porcina africana. Se puede observar como los anticuerpos se han unido a la células infectadas, destacándose en el citoplasma unas zonas con una intensidad mayor, que corresponden a zonas de mayor replicación viral, y por tanto mayor fijación de anticuerpos. 37
http://www2.cbm.uam.es/confocal/manosidasa.htm 38
Inmunofluorescencia de sándwich En este se descubren anticuerpos específicos, por ejemplo en células plasmáticas, con el tratamiento inicial de cortes congelados con antígeno específico no marcado, después con anticuerpo marcado de la misma especificidad que los de la célula plasmática y de aquí el nombre de “técnica del emparedado ”.
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Inmunofluorescencia del Complemento Supone un procedimiento en tres pasos. Primero se usan anticuerpos no marcados, como en la tinción indirecta. El segundo paso consiste en el complemento de un especie (suero fresco total) y el tercero, en un conjugado que es especifico para un componente del complemento de esa especie. 40
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INMUNOENSAYOS ENZIMATICOS LA TÉCNICA ELISA INMUNOELECTROTRANSFERENCIA O WESTERBLOT
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Ensayos con marca enzimática • •
• • • • •
Las más utilizadas son: peroxidasa (horseradish peroxidase, HRP), PM 44 kdal fosfatasa alcalina(AP), PM 80-84,5 kDal Ventajas disponibles comercialmente se pueden conjugar por técnicas simples tienen varios sustratos.
Competitivo- Captura de anticuerpos
E
E
+ E
Competitivo- Captura de antígeno
No competitivo- “sandwich” de anticuerpos Exceso de antígeno eliminado por lavado bloqueante
+
Ag
E E
Sustrato
Señal
Curva standard
Señal
[Ag]
Ensayos con marca enzimática • •
• •
•
•
Generación de la señal La última parte de un inmunoensayo en que la marca es enzimática es la cuantificación de la enzima. Métodos de detección: a) Espectrofotométrico o colorimétrico. Se mide la aparición de un cromóforo. b)Fluorométrico- Se mide la aparición de un producto fluorescente c)Quimioluminiscente- Se mide la aparición de un producto luminiscente.
Ensayos con marca enzimática: límites de detección (zeptomoles, 10-21 moles) AP:
HRP:
quimioluminiscencia
1
25000
fluorescencia
100
--
color
50000
2000000
LA TÉCNICA ELISA
La técnica de Elisa es un procedimiento de ensayo inmunoenzimático cuyo nombre resulta de la asociación de las iniciales de su denominación inglesa ( enzyme linked inmuno sorbent assay ). Como todo ensayo inmunoenzimático, la prueba recurre al empleo de inmunógenos, haptenos ó anticuerpos marcados con una enzima, para revelar el reactivo complementario a nivel de distintos fluidos biológicos. 49
LA TÉCNICA ELISA
El método ELISA está recomendado fundamentalmente para el estudio de poblaciones. Es una técnica altamente sensible y de gran especificidad, que permite realizar en un corto espacio de tiempo estudios sobre grandes poblaciones, de manera sencilla y económica.
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LA TÉCNICA ELISA
Esta técnica presenta además una buena reproducibilidad y facilidad en la interpretación de los resultados.
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LA TÉCNICA ELISA
Fue concebida independientemente en 1971 en Suecia y Holanda, siendo aplicada posteriormente a la revelación y a la cuantificación de los más diversos tipos de sustancias presentes en líquidos orgánicos (antígenos, anticuerpos, hormonas, fármacos , etc.).
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LA TÉCNICA ELISA
El área de sus aplicaciones médicas se ha expandido en forma sostenida, siendo utilizada como el primer sustituto de la técnica de Radioinmunoensayo en la medición de hormonas, inmunoglobulinas, antígenos y anticuerpos en infecciones bacterianas, micósicas, parasitarias o virósicas.
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TIPOS DE TÉCNICAS ELISA: Técnicas cualitativas: Son técnicas Elisa que nos indican la
ausencia ó presencia de un antígeno o anticuerpo determinando . Los kits
incluyen controles positivos y negativos para poder determinar esta presencia o ausencia de antígenos. Ejemplo: HIV, Hepatitis, etc. 54
Técnicas cuantitativas:
Son técnicas Elisa que nos indican la cantidad de antígeno ó anticuerpo presente en la muestra. Los kits incluyen +/-6 estándares
(sueros de diferentes concentraciones del antígeno objetivo) con los cuales se realiza una curva para así poder determinar la concentración de la muestra. Ejemplo: Hormonas, Marcadores tumorales, etc. 55
LA TÉCNICA ELISA PROCEDIMIENTO: De un modo general se procede a la fijación de uno de los componentes de la reacción inmunológica (antígeno Ag o anticuerpo Ac) a un soporte sólido , poniendo luego ese sistema
en contacto con una fase fluida que contiene el reactivo complementario. El complejo inmunológico formado es enfrentado luego a las moléculas capaces de reconocer a su componente más superficial,
marcadas con una enzima (peroxidasa de rábano picante); agregándose posteriormente un sustrato cromogénico de la enzima marcadora. 56
LA TÉCNICA ELISA La existencia de una reacción inmunológica se demuestra y se cuantifica midiendo por medio de espectrofotometría cantidad de producto enzimático resultante.
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PROCEDIMIENTOS GENERALES DE UNA TÉCNICA ELISA:
Dispensar muestras Dispensar conjugado Incubar a 37ºC o a temperatura ambiente Lavar los pozos Dispensar cromógeno/sustrato Incubar a 37ºC o a temperatura ambiente Dispensar solución de parada Leer en lector de tiras ó placas de ELISA 58
En la primera línea se observa el suero control positivo y en la segunda el negativo. Los sueros problema por duplicado han sido colocados en el resto de la placa, se observan positivos (azul) y negativos (sin color).
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El procedimiento se efectúa de dos formas principalmente:
Método directo:
También conocido como método Sándwich (Anticuerpo-antígenoanticuerpo), se basa en la fijación de un anticuerpo a la fase sólida, el cual atrapa los antígenos homólogos en la muestras que posteriormente son identificados con un anticuerpo específico marcado con una enzima. En estos casos la cantidad de antígeno es directamente proporcional a la cantidad de producto enzimático formado. 60
La modalidad más frecuente del método ELISA para la determinación de antígenos es el modelo ELISA "Sándwich".
En esta forma, la placa suele ya venir con un anticuerpo fijado (monoclonal ó policlonal) frente al antígeno problema, sobre el que se añadirá el macerado del órgano sospechoso, que en caso de reaccionar con el anticuerpo de la placa, será puesto en evidencia tras la adición del segundo anticuerpo marcado con la enzima. Por último, se añade el substrato para revelar la reacción.
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Fases de la técnica Elisa Sándwich. (1) Un anticuerpo monoclonal o policlonal anti antígeno suele estar ya unido a la placa. (2) se incuba con la muestra problema. (3) se añade el conjugado. (4) por último el sustrato. Todos los pasos van precedidos de incubaciones y lavados. 62
ELISA INDIRECTO Es el método más utilizado para la determinación de anticuerpos. Básicamente, consiste en la inmovilización a la placa de ELISA del antígeno (en los Kits ya viene fijado) del que queremos conocer si en el suero problema existen anticuerpos específicos. Se pueden utilizar como antígenos, proteínas virales o bacterianas e incluso virus completos.
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Fase de la técnica Elisa indirecto. (1) El antígeno se pega a la placa (2) Se añade el suero problema. (3) posteriormente, el conjugado. (4) y por último, el sustrato.
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LA TÉCNICA ELISA
Método competitivo: Se basa en la competencia que se establece entre un antígeno marcado enzimáticamente y el mismo antígeno sin marcar (muestra objetivo) al ser colocados frente a una cantidad limitada del anticuerpo homólogo fijado a la fase sólida. La cantidad de antígeno es indirectamente proporcional a la cantidad de producto enzimático formado.
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ELISA DE COMPETICIÓN
En este sistema también es muy utilizado para la detección de anticuerpos específicos. Se parte de un anticuerpo (monoclonal o policlonal), frente a un antígeno conocido, que previamente ha sido inmovilizado en la placa. Se denomina de competición ya que el suero problema es incubado previamente con el antígeno, antes de incubarlo con el antisuero fijado en la placa, y por tanto compite con él.
Los pasos siguientes es la adición e incubación del conjugado, lavado y finalización con el sustrato y lectura. 66
Técnica Elisa de competición. (1) Se incuba el suero problema con el antígeno. (2) La mezcla anterior se deposita sobre los pocillos donde previamente se ha fijado un suero anti antígeno (3) se añade el conjugado. (4) después, el sustrato. En este caso la ausencia de color sería positivo. 67
E L I S A
Quimioluminiscencia: Substrato luxogénico Sensibilidad (5. 10 –18 M Ag) 68
INMUNOELECTROTRANSFERENCIA O WESTERBLOT
La inmunoelectrotransferencia "westerblot" o "Immunoblotting" es una técnica inmunoenzimática que se utiliza para la detección de anticuerpos específicos.
Se recomienda cuando no hay que estudiar un gran número de sueros o para analizar sueros dudosos por otras técnicas . Este método utiliza
como soporte antigénico filtros de nitrocelulosa, donde las proteínas del antígeno han sido previamente transferidas, manteniendo total o parcialmente sus propiedades antigénicas.
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Western Blotting
Identificar proteína: Ag
Ac
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Material necesario para la realización de la inmunotransferencia: Tiras de nitrocelulosa antigenadas, Tampon PBS, sueros de referencia positivo y negativo, conjugado, solución sustrato y soporte plástico para realizar todos los procesos. 71
PIPETAS
LAVADOR DE PLACAS
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LECTOR DE TIRAS ELISA
LECTOR DE PLACAS ELISA
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FIJACION DE COMPLEMENTO Detectar Ag o Ac (suero) utilizando una fuente de C' y un sistema indicador indicador (GR carnero sensibilizados) sensibilizados)
Controles: .- Suero + No hemólisis .- Suero Neg. Hemólisis .- Gr solos Lisis espontánea .- Suero en estudio – Ag + C' + GR: Lisis .- Ag – Suero en estudio + C' + GR Lisis •
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Radioinmunoensayos ( RIA ) Técnica muy sensible para detectar Ag o Ac . Unión competitiva entre Ag* y Ag por Ac de alta afinidad
Desventajas: pérdida de sensibilidad durante el almacenamiento radioactividad, deterioro marcaje y precausiones exposición humana a radioactividad 75
Microscopía Inmunoelectrónica: Componentes intracelulares Acs conjugados a marcadores electrodensos
Oro
Oro Ferritina Radio E’s
DAB
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