Primer Parcial Practico De Bacteriologia

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1  I PARCI PARCIAL AL DE BACTERI BACTERIOLO OLOGIA GIA  PRACTIC  PRACTICO O VALIDO VALIDO PARA LA  EVALUA  EVALUACIÓ CIÓN N TRIMEST TRIMESTRAL RAL COLABORACION DE LA CATEDRA  DE BACTER BACTERIOL IOLOG OGIA IA PRACTI PRACTICA CA  PARA LOS ESTUDIA ESTUDIANTE NTES  S   SIN COSTO COSTO ALGUN ALGUNO. O. ESTE DOCUMENTO PUEDE SER  REPROD  REPRODUC UCIDO IDO SIN NINGUN  NINGUN   PROBLE  PROBLEMA MA LEGAL LEGAL “  DIGALE  NO A LA CORRUPCIÓN Y   NO A LA COMPRA DE FOLLETOS A CAMBIO DE PUNTOS.”   Nota:  Nota: Cada Cada Presiden Presidente te de grupo grupo acercarse a la secretaria para sacar  copia y distribuir distribuir entre sus compañeros. 1 2  I N D I C E  • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • •  NTRODUCCION CION..  I  NTRODUC  B IOSEGURIDAD EN MICROBIOLOGIA. MICROBIOLOGIA.  I  NSTRUMNETOS UTILIZADOS EN BACTERIOLOGIA PRACTICA. T OMA OMA DE MUESTRAS.  E  STUDIO MICROBIOLOGICO MICROBIOLOGICO DE COLECCIONES SUPURATIVAS.  M UESTRAS UESTRAS ESPECIALES ESPECIALES PARA EL DIAGNOSTICO MICROBIOLOGICO. MICROBIOLOGICO. T  ECNICAS EN PREPARACION DE FROTIS Y SU FIJACION.  M  ETODOS FISIOLOGICOS DE IDENTIFICACION IDENTIFICACION BACTERIANA. T  ECNICAS DE COLORACION DE LAS BACTERIAS.  M  EDIOS DE CULTIVOS DE USOS FRECUENTES EN BACTERIOLOGIA. F  AMILIA MICROCOCACEAE. MICROCOCACEAE.  AUTOVACUNAS. F  AMILIA ESTREPTOCOCACEAE. F  AMILIA NEISERIACEAE. NEISERIACEAE.  E  NFERMEDADES DE TRANSMISION SEXUAL (E.T.S.) (E.T.S.) CHLAMYDIAS.  B ACTERIAS BACILARES. C OPROCULTIVO. OPROCULTIVO. F  AMILIA VIBRIOCEAE. VIBRIOCEAE. U  ROCULTIVO.  H  EMOCULTIVO.  A NTIBIOGRAMA.  NTIBIOGRAMA.  R EACCIONES INMUNOLOGICAS INMUNOLOGICAS BACTERIANAS   R EACCIONES BIOQUIMICAS BIOQUIMICAS DE LA ENTEROBACTERIAS.  D IAGNOSTICO DE BACTERIAS ANAEROBIAS. ANAEROBIAS. C ONTROL ONTROL DE CALIDAD EN MICROBIOLOGIA.  ESPIROQUE  ESPIROQUETAS TAS (TREPO (TREPONEM NEMAS,LE AS,LEPTOPI PTOPIRAS RAS Y BORRELIAS BORRELIAS)) 2 3 UNIVERSIDAD DE GUAYAQUIL FACULTAD DE CIENCIAS CIENCIAS MÉDICAS  “GUIA PRACTICA DE BACTERIOLOGIA”  BACTERIOLOGIA”   AUTORES:  AUTORES:  DR. MIGUEL VARGAS  DR. JUAN MORENO  DR. ERNESTO RONQUILLO  DR. EDMUNDO BUÑAY  DR. CARLOS MOSQUERA  DR. EDUARDO FLORENCIA  DR. ROBERTO VILLACIS. DRA. JOSEFINA RAMIREZ  DRA. HILDA ROSADO DRA. MARTHA GUEVARA( +) DRA. JANETT RECALDE  DR. JULIO ROMERO DR. JULIO GUZMAN  DR. GONZALO ZAVALA  DR: EDUARDO CHANCAY LOPEZ  " COORDINADOR COORDINADOR DE LA CATEDRA" GUAYAQUIL NOVIEMBRE 1995 REVISADO Y ACTUALIZADO EN JULIO 2002 POR EL DR : EDUARDO CHANCAY L . PROFESOR PRINCIPAL DE LA CATEDRA.  INTRODUCCION  3 4  Esta guía de trabajos prácticos de la Cátedra de Bacteriología Bacteriología de la Facultad Facultad de Ciencias Ciencias Médicas Médicas de la Universidad Estatal de Guayaquil, nace como una alternativa didáctica científica, a la propuesta del Rectorado de la referida Universidad de realiz realizar ar un traba trabajo jo mo monog nográf ráfico ico para el ascens ascensoo de Profe Profesor sores es Auxil Auxiliar iares es a  Profesores  Profesores Agregados, y la misma misma se propone propone los siguientes siguientes objetivos: objetivos: OBJETIVOS GENERALES: 1. - Aplicar los conocimientos teóricos-prácticos de la Asignatura. 2. - Ampliar los conocimientos actuales acerca de las Bacterias, y los variados métodos para su diagnóstico. 3. - Profundizar en las técnicas de Diagnóstico Bacteriológico. 4. - Describir algunos procedimientos fundamentales de d e la microscopía  Bacteriana.  Bacteriana. 5. - Utilizar adecuadamente los métodos métod os de aislamiento de d e los Cultivos  Bacterianos.  Bacterianos. 6. - Demostrar técnicas específicas de tinción General y especial de las  Bacterias.  Bacterias. 7. - Usar los instrumentos adecuados en Bacteriología. 8. - Estudiar la estructura y función de las células bacterianas. 9. - Dar instrucciones específicas sobre Bioseguridad. 10. - Seleccionar Material adecuado como: Audiovisuales, Gráficos y variadas  preguntas de de evaluación. evaluación. 11. - Describir técnicas actuales sobre Inmunología Bacteriana. 12. - Conocer e identificar los Diferentes Diferen tes Medios de Cultivos Utilizados en Bacteriología.  La referida referida guía contiene contiene varios varios procedimientos procedimientos y técnicas técnicas comunes. comunes. Además Además se ha incluido gráficos, dibujos y varias preguntas para evaluación formativa. Así mismo, al   final de cada capítulo capítulo se ha incluido incluido una una pequeña bibliografía bibliografía para el el estudiante estudiante que desee obtener una información adicional sobre los principios y fenómenos descritos.  Pretendemos  Pretendemos al mismo mismo tiempo tiempo la ambición ambición de aplicarlo aplicarlo a nuestra Facultad, Facultad, aún en las crisis económica que incide en la adquisición de los recursos materiales que se necesitan para desarrollar nuestro trabajo.  Intentamos  Intentamos por lo tanto tanto clarificar clarificar y difundir difundir un nuevo nuevo enfoque enfoque paradigmático paradigmático en en los  procesos de Enseñanza-Ap Enseñanza-Aprendizaje rendizaje en forma sencilla, sencilla, pero pero apoyados apoyados en el avance avance de la ciencia y la tecnología Educativa Superior.  Dr. Eduardo Chancay López  COORDINADOR DE LA CATEDRA DE   BACTERIOLOGIA  AUTOR:DR  AUTOR:DR EDUARDO EDUARDO CHANCAY L 4 5  BIOSEGUR  BIOSEGURIDAD IDAD EN MICRO MICROBIOLO BIOLOGIA GIA  La Facultad Facultad de CC.MM. CC.MM. No tiene tiene ningún ningún estudio acerca de las enfermedades ocasionadas por las prácticas que nuestros estudiantes y docentes realizan a diario en las diferentes cátedras en las que utilizamos materiales de alto riesgo, sea éste: Químico, Físico, Biológico, Humano e infeccioso.  Es por esta razón razón que que nuestra nuestra Cátedra Cátedra incorporará incorporará desde la presente presente  guía, éste capítulo capítulo de Bioseguri Bioseguridad dad en Microbio Microbiologí logía, a, con con el objeti objetivo vo de: de: 1. - Conocer y Aplicar el concepto y los principios de BIOSEGURIDAD  EN MICROBI MICROBIOLO OLOGIA. GIA. 2. - Dar una serie de normas para la manipulación correcta de agentes infecciosos, que los Profesores Auxiliares y estudiantes realizaremos durante todo el año lectivo.  DEFINICIO  DEFINICION.N. La Biosegurid Bioseguridad ad es la disciplin disciplinaa que se se ocupa de la Prevenci Prevención ón de Riesgo Riesgo  Biológico  Biológico en personas, personas, directa o indirectame indirectamente nte expuestos expuestos al mismo,  producto  producto de de un trabajo trabajo de manipul manipulación ación de agentes agentes infecciosos. infecciosos.  Las medidas medidas de Biosegurida Bioseguridadd recomendad recomendadaa para los que trabajan trabajan con  gérmenes  gérmenes patógenos patógenos están encomendadas encomendadas a la Seguridad Seguridad General y a la  Particular  Particular de nuestros nuestros estudiantes estudiantes y docentes. docentes.  PRINCIPIO  PRINCIPIOS S DE LA LA BIOSEGU BIOSEGURIDAD RIDAD.. La Biosegurida Bioseguridadd consta de tres principios principios básicos, básicos, para garantizar garantizar el  aislamiento o contención adecuada de los agentes infecciosos (Bacterias en nuestro caso). Las mismas son: a.- Técnicas y Prácticas correctas en el laboratorio. b.- Equipos de Seguridad. C.- Diseño adecuado de las instalaciones del Laboratorio. a.- TECNICAS Y PRACTICAS. Es el elemento elemento más importa importante nte para para la Biosegu Bioseguridad ridad y tiene el el mayor mayor peso en la Prev Preven enci ción ón Efic Eficie ient ntee de dell Ries Riesgo go Bio Biológi lógico co y reco recoge ge los los  procedimien  procedimientos tos básicos básicos del trabajo trabajo prácticas prácticas de Higiene Higiene Personal Personal y la conducta que deben observar los docentes y dicentes b.- EQUIPOS DE BIOSEGURIDAD.BIOSEGURIDAD. A los equipos equipos de seguridad seguridad se los denomina denomina también también “Barreras “Barreras  primarias”,  primarias”, ya que constituyen constituyen la barrera directa directa entre el personal y el material infeccioso. Por ej. : - Instrumento de pipeteo, 5 6 - Copas de seguridad para centrífugas, - Guantes - Mandil  - Máscara respiratorias o faciales - etc. c.- DISEÑO ADECUADO DE LAS INSTALACIONES. A las instalacione instalacioness se las denomina denomina “Barreras “Barreras Secundarias Secundarias”, ”, ya que garantiza la protección del personal que trabaja en el edificio y fuera del laboratorio así como de la comunidad, del posible escape accidental  de agentes infecciosos del laboratorio de Microbiología.  NORMAS  NORMAS PARA PARA LA LA BIOSEGU BIOSEGURIDAD RIDAD.. 1. - Usar mandil largo adecuado durante las prácticas y quitárselo antes de abandonar el laboratorio. 2. - No sacar jamás equipos, medios de cultivos con Bacterias fuera del  laboratorio. 3. - No pipetear con la boca. 4. - No comer, beber, fumar, guardar alimentos ni aplicar cosméticos en el laboratorio. 5. - Lavarse las manos después de manipular el material infeccioso así  como antes de abandonar el laboratorio. 6. - Mantener el laboratorio limpio, aseado y desinfectado. 7. - Todos los procedimientos y técnicas se practicarán de manera que se evite en lo posible la formación de aerosoles. 8. - Todo Todoss los los de derr rram amam amie ient ntos os,, ac acci cide dent ntes es y expo exposi sici cion ones es real reales es,,  potencialme  potencialmente nte de material material infeccioso infeccioso se notificarán notificarán de inmediato inmediato al  instructor - jefe. 9. - Cada Cada prácti práctica ca los materi materiale aless del vidrio vidrio contami contaminad nados os deb deben en ser  colocados en recipientes adecuados. 10. - Al comenzar las prácticas el instructor dará las pautas en forma oral  de la bioseguridad.  AUTOR  AUTOR :DR :DR GONZALO GONZALO ZABALA ZABALA VILLACIS  VILLACIS  6 7  INSTRUMENTOS  INSTRUMENTOS UTILIZADOS EN BACTERIOLOGIA BACTERIOLOGIA  PRACTICA OBJETIVOS ESPECIFICOS DE LA CLASE. 1. - Que el alumno al final de la clase sea capaz de seleccionar los instrumentos de acuerdo al examen bacteriológico a realizar. 2. - Que el alumno al final de la clase sea capaz de utilizar correctamente cada instrumento con la técnica apropiada. 3. - Que el alumno al final de la clase sea capaz de demostrar todos los materiales de vidrio que se utilizan en los diferentes exámenes. 4. - Diferenciar cada instrumento en las diferentes técnicas bacteriológicas.  MATERIALE  MATERIALES S Y METODO METODOS: S:  Entre los principa principales les instrume instrumentos ntos usados en Bacteriol Bacteriología ogía lo podemos podemos clasificar en: Materiales de vidrio, Instrumentos y Aparatos  PARATOS tenemos:  Entre los A PARATOS  tenemos:  Autoclave,  Autoclave, Horno, Horno, Estufa, Estufa, Centríf Centrífuga, uga, Microscopio Microscopio Fluorescente Fluorescente,, Microscop Microscopio io  Electrónico,  Electrónico, Baño María, María, Contador Contador de Colonias, Colonias, Balanza, Balanza, Peachím Peachímetro, etro,  Destilador  Destilador de Agua. Agua.  Entre los INSTR los INSTRUME UMENTO NTOSS tenemos:  Pinza portalámin portaláminas, as, Aguja Aguja de de inoculació inoculación, n, Asa de inoculac inoculación, ión, Bajalengua, Bajalengua,  Aplicadores  Aplicadores de madera, madera, Espátula, Espátula, Pinzas, Pinzas, Gradillas, Gradillas, Canastillas Canastillas,, Cinta Cinta indicadora de esterilización.  MATERIALE  MATERIALES S DE VIDRIO. VIDRIO. :  Pipetas,  Pipetas, Tubos Tubos de ensayo, ensayo, Caja Caja de petri, petri, Lámina Láminass porta porta objeto objeto y Cubre Cubre objeto, objeto,  Matraz Erlenmeyer Erlenmeyer de de cuello cuello estrecho estrecho y cuello cuello ancho, ancho, Matraz fondo plano,  Matraz aforado, aforado, Densímetr Densímetro, o, Probeta, Probeta, Termómetro, Termómetro, Cubeta Cubeta para para tinción, tinción, Vaso de Coplín, Vaso de precipitación, Agitador, Frascos goteros, Mecheros.  PIPETAS. PIPETAS. Es un utensilio utensilio de vidrio cilíndrico cilíndrico de gran gran utilidad utilidad que ofrecen ofrecen un máximo máximo nivel de exactitud y sirven para transferir de un recipiente a otro, cantidades específicas de líquido. Las pipetas son calibradas en 0.1, 0.2, 1, 2, 5, 10, 20 cc. etc.  Las pipetas pipetas graduadas graduadas a partir partir de 5ml. tienen una boca boca de aspiración aspiración conformada, que es adecuada para alojar un tapón de algodón. Los ttapones apones de algodón pueden prolongar el tiempo de vertido y por lo tanto influir en la exactitud de la medición. 7 8 ¡El pipeteado a boca está prohibido! Debido al alto riesgo de infección.  Resulta por lo tanto imprescindi imprescindible ble utilizar utilizar un auxilia auxiliarr de pipeteado, pipeteado, que son son excelentes en forma y función. Él más sencillo y frecuente son las Peras de Goma que son de caucho natural y se adaptan bien a la mano.  PIPETAS  PIPETAS AUTOM AUTOMATICA ATICAS.S.Con el advenimiento de la precisión, exactitud y además con el objeto de romper la comunicación con la boca del operador se crearon estas pipetas que  ya las tenemos tenemos en el mercado mercado y que van de de pequeñas pequeñas cantidades cantidades hasta cantidades mayores, las tenemos de: 1, 5, 20, 25, 50, 100, 200, 250, 500, 1.000 ul. TUBOS DE ENSAYOS. Los tubos tubos de de ensayo ensayo para para cultivo cultivo son de de vidrio. vidrio. Hay Hay con bordes rectos y con roscas resistentes a la esterilización por vapor (121 °C). Existen en diversas longitudes y diámetros. Los tubos con bordes rectos deben ser protegidos por  un tapón estéril de algodón revestidos de gasa, cuando contienen en su interior   sustancias  sustancias que que se desean mantener mantener estérile estériless tales como solución solución salina, salina, agua destilada, etc. o en su defecto medios de cultivo (sólidos, semisólidos, líquidos).  El tapón tapón que que los protege protege permite permite el paso paso del aire necesari necesarioo para para el crecimi crecimiento ento de las Bacterias, pero impide el paso de las impurezas del medio ambiente, de tal forma que ejercen una función filtrante. CAJAS DE PETRI. Las hay hay de vidrio y de poliet polietileno. ileno. Las cajas cajas de petri de de vidrio vidrio borosili borosilicato cato ó vidrio de soda. Elevada calidad de vidrio y de acabado. Fondo y tapa planos tanto en el interior como el exterior. Las cajas de petri sirven para envasar los medios de cultivo sólidos, sobre los cuales se efectúan siembras en estrías para  permitir  permitir una mejor individuali individualización zación de las colonias. colonias.  LAMINAS  LAMINAS PORTA PORTA OBJET OBJETO.O.Son de vidrio óptico y sirven para realizar el frotis a observarse microscópicamente, ya sean estas preparaciones fijados y teñidos o en frescos, deben ser con bordes pulidos y antes de su uso deben estar completamente limpios, excepto de polvo y grasa. También hay porta objeto con cavidades, llamadas láminas excavadas.  LAMINILLA  LAMINILLAS S CUBRE CUBRE OBJETO OBJETO..Se emplean para cubrir las preparaciones en fresco a ser observadas microscópicamente. Las laminillas tienen por finalidad evitar cualquier  contaminación del manipulador, evitar que la preparación se mueva con la corriente de aire exterior y nos da también una mayor superficie de observación al microscopio.  MATRACES.  MATRACES.- Los hay hay de cuello ancho y cuello cuello estrecho estrecho de fondo fondo plano plano y matraces matraces aforad aforados. os. 8 9  MATRACES  MATRACES AFORA AFORADOS. DOS.- Los matrace matracess aforados aforados son recipien recipientes tes de de vidrio, vidrio, ofrecen ofrecen un máximo máximo nivel de exactitud. Los matraces aforados se suministran con tapón de PP. , Parte  superior  superior cuadrado, cuadrado, con punta punta de goteo. goteo. Este Este tapón tapón reduce notablemen notablemente te el   peligro  peligro de rotura en caso caso de vuelco vuelco y evita evita que el matraz matraz aforado aforado se caiga al  rodar por la mesa del Laboratorio.  MATRAZ  MATRAZ ERLENM ERLENMEYER EYER cuello estrecho.estrecho.Son recipientes de vidrio con reborde y graduación  MATRAZ  MATRAZ ERLENM ERLENMEYER EYER cuello ancho.ancho. Al igual igual que que el anterio anteriorr sino con la la particular particularidad idad como su nombre nombre lo lo indica indica es de cuello ancho. Ambos sirven para lectura del volumen aproximado y depositar medios de cultivo, fundir medios de cultivo en el autoclave.  DENSIMET  DENSIMETROS.ROS. Los densíme densímetros tros son son instrumen instrumentos tos de precisión precisión imprescindi imprescindible ble para para determin determinar  ar  la densidad de líquidos o la concentración de sustancias disueltas.  PROBETA.  PROBETA.Son Son recipientes de vidrio graduados y rotulados con pico y pie hexagonal que ofrecen un máximo nivel de exactitud. TERMOMETRO. Es un instrumento instrumento de vidrio vidrio impresci imprescindible ndible para la la medición medición de la temperatura temperatura en el laboratorio.  La alta alta duración duración de éstos éstos instrument instrumentos os de calidad calidad se obtienen obtienen de su característica de construcción “de una sola pieza”. CUBETA PARA TINCION, VASO DE COPLIN. Recipientes  Recipientes de vidrio vidrio sirven sirven para para mantene mantenerr en posición posición vertical vertical u horizontal horizontal las láminas porta objetos, ya sea para someterlos a la acción tintorial de los colorantes ó también para eliminar el aceite de inmersión del frotis teñidos después de haber sido observados. VASO DE PRECIPITACION.Son recipientes de vidrio de forma baja y de forma alta con graduaciones, reborde y pico sirven para mezclar y preparar soluciones.  AGITADOR  AGITADOR DE VIDRIO VIDRIO.. Los agitado agitadores res de vidrio son varillas varillas que vienen vienen con bordes bordes redondeado redondeadoss que  sirven para agitar y mezclar mezclar las las soluciones soluciones usadas en el laboratorio laboratorio y en las las  preparacione  preparacioness de los medios medios de cultivos cultivos.. FRASCOS GOTEROS.Sirven para almacenar diversas sustancias colorantes a ser utilizadas en los distintos métodos de tinción, como su nombre lo indica permiten vaciar su contenido gota a gota para lo cual debe hacerse coincidir la ranura que existe tanto en la tapa del frasco como la que existe en el cuello del mismo.  MECHEROS.  MECHEROS.-9 10  Existen de alcohol alcohol y de gas; gas; éstos éstos últimos últimos producen producen una una llama llama mas mas firme firme y  potente.  potente. Los Los mecheros mecheros en general general alreded alrededor or de la llama llama dan dan una una área dentro de la cual el material con el que se trabaja está libre de toda contaminación con las Bacterias del medio ambiente. La llama del mechero sirve también para  fijar el frotis frotis a ser ser teñidos teñidos y esterilizar esterilizar el asa de alambre alambre como como la aguja del  alambre antes y después de ser usadas, representando éstos una aplicación directa del calor seco (incineración). Debe recordarse que el máximo poder de la llama se encuentra en la punta de la misma.  INSTRUMENTOS   INSTRUMENTOS   PINZAS. PINZAS. Las hay hay con extremos extremos en puntas puntas,, redondead redondeados os y con extremos extremos cuadrangula cuadrangulares res de extraordinaria resistencia química y térmica, muy manejables.  En Bacteriol Bacteriología ogía las utilizam utilizamos os para para los antibiogra antibiogramas mas con con los los discos discos de  sensibilidad  sensibilidad y en las las tinciones tinciones de frotis; frotis; Que Que hay hay unas unas pinzas pinzas llamada llamadass  portalámina  portaláminass que sirven sirven para para sujetar sujetar las láminas láminas porta objeto objeto en el momento momento que efectuamos la tinción de frotis  ASA DE DE INOCULA INOCULACION CION.. El asa de inoculac inoculación ión consist consistee de un un alambre alambre cuyo cuyo extremo extremo distal termina termina en un aro de diámetro variable, dicho alambre está unido por su extremo proximal a un mango metálico. Tienen innumerables usos pero en general sirven para tomar el material con el que vamos a trabajar, ya sea éste una colonia a ser  estudiada, gotas de diferentes sustancias líquidas o especímenes tales como heces, sedimento urinario, etc.  AGUJA  AGUJA DE DE INOCULA INOCULACION CION..  Instrumento  Instrumento igual al anterior anterior con la la salvedad, salvedad, de que el alambre alambre en en vez de terminar el aro termina en punta. Sirve para efectuar inoculaciones en la  profundidad  profundidad de los medios medios de cultivo cultivo o tambié tambiénn cuando cuando queremos queremos individualizar colonia rodeada estrechamente de otras no deseables.  Actualmente  Actualmente existen asas y agujas agujas descartab descartables les de material material de polietileno polietileno,, la elevada flexibilidad del material permite una siembra suave sin dañar la  superficie  superficie del del medio medio de cultivo, cultivo, además además no es necesario necesario flamear flamear y enfriar enfriar tras tras cada proceso de trabajo. Por lo tanto ya no existe formación de aerosoles.  BAJALENG  BAJALENGUAS.UAS.Sirven para deprimir la lengua y facilitar la toma de una muestra de exudado  faríngeo.  faríngeo. Los Los hay de madera madera y metálicos, metálicos, rectos y ligerament ligeramentee curvos curvos con con extremos redondeados.  APLICADOR  APLICADORES ES DE MADERA MADERA ESTERI ESTERILES.LES.10 11 Sirven para efectuar hisopados faríngeos, vaginales, rectales, ópticos y desde cualquier lesión productiva o supurativa  ESPATULAS  ESPATULAS..Sirven para coger sustancias y pesarlas, terminan en extremo redondeado o en un extremo en forma de cuchara. CINTA INDICADORA DE ESTERILIZACION. Papel crepado, crepado, con con colorante colorantess sensibles sensibles al calor calor para para esterilizac esterilización ión al al vapor. vapor. APARATOS   AUTOCLAV  AUTOCLAVE  E .. Es un aparato aparato que consiste consiste de un caldero caldero cilíndric cilíndricoo de paredes paredes resistentes, resistentes, cerrado superiormente por una tapa que cierra herméticamente gracias a la interposición de un empaque apropiado y a la presión ejercida por una serie de tornillos que la apretan.  En el interior interior del cilindro cilindro existe existe un soporte sobre el cual se coloca coloca una una cesta cesta metálica conteniendo el material a esterilizar; entre el fondo de la cesta y el  caldero queda un espacio que se llena de agua.  De modo modo general general se puede puede consider considerar ar que que el vapor vapor saturado saturado bajo bajo presión presión de de 15 libras por pulgada cuadrada con una temperatura de 120 °C, es suficiente para esterilizar cualquier medio o instrumento de 15 a 30 minutos.  HORNO  HORNO O ESTER ESTERILIZAD ILIZADOR.OR. Es un aparato aparato que está constit constituido uido por un un recipiente recipiente que puede puede ser rectangul rectangular  ar  o cuadrado de paredes dobles, revestido exteriormente de amianto y calentado  por quemado quemadores res que pueden pueden ser eléctrico eléctricos, s, gas, gas, gasolina, gasolina, Kérex, etc.  En el interior interior del horno existen existen repisas repisas móviles móviles y en la la parte parte superior superior orificios orificios o chimeneas de ventilación y un orificio donde se coloca el termómetro  graduado  graduado hasta hasta 200 °C. °C. Generalmente se requiere para lograr la esterilización someter los materiales a una temperatura de 180 °C por una o dos horas.  En los laboratorio laboratorioss se utiliza utiliza el el horno horno para para esterilizar esterilizar el material material de vidrio vidrio tales como pipetas, fiolas, cajas de petri, etc. CONTADOR DE COLONIAS. Es un aparato aparato eléctrico eléctrico que registra registra la cantidad cantidad de colonias colonias que se encuentra encuentra en una muestra de cultivo de orina.  MICROPLA  MICROPLATOS.TOS.Son planos de polivinil, que se las utiliza especialmente en pruebas  serológicas:  serológicas: se usan en Pruebas Pruebas de Fijación Fijación del del Complem Complemento, ento, Inhibición Inhibición de 11 12  Hemoglutin  Hemoglutinacón acón,, etc. estas placas placas están constituida constituidass por 96 hoyos hoyos dividido divididoss en  filas 8 x12. BALANZAS   BALANZA  BALANZA ABIERT ABIERTA A DE DOS PLATILL PLATILLOS.OS. Esta balanza balanza cuenta con dos dos platillos platillos que reposan reposan en sendas sendas column columnas. as. Puede Puede estar constituida para usarse con pesos separados, o tener un astil graduado en que se coloca una pesa corrediza. Se emplea para pesar cantidades grandes. Su sensibilidad es 0.5gr. (500mg).  BALANZA  BALANZA ANALIT ANALITICA.ICA. Esta balanza balanza consta de dos platillos platillos suspendi suspendidos dos de una astil dentro de un estuche de vidrio. Se emplea para pesar cantidades pequeñas, cuando se requiere gran precisión. Su sensibilidad es de 0.5mg - 0.1mg.  PEACHIMET  PEACHIMETRO.RO. Es un aparato aparato eléctrico eléctrico que sirve sirve para para medir medir el pH de las solucion soluciones, es, medios medios de cultivo, etc.  ESTUFA  ESTUFA O INCUBAD INCUBADORA.ORA. Es un aparato aparato metálico metálico y eléctrico eléctrico suministra suministra la temperatur temperaturaa ideal ideal para para el  desarrollo de las Bacterias (generalmente de 35 a 37 grados) sembrados en los medios de cultivo. CENTRIFUGA. Es un aparato aparato metálico metálico que sirve sirve para para separar separar en en sedimento sedimento de la porción porción líquida de una sustancia. Se utiliza en los Urocultivos para centrifugar a una velocidad de 2500 r.p.m. durante 5 minutos.  MICROSCO  MICROSCOPIO PIO ELECT ELECTRONI RONICO.CO. Es aquel aquel que que proporcio proporciona na resoluci resoluciones ones (aumentos) (aumentos) de 700 mil diámetr diámetros os (700 (700 mm) o más en el cual un campo magnético permite enfocar los rayos característicos (electrones) y obtener una imagen en la pantalla fluorescente.  Existen dos tipos tipos de microscopio microscopio electrónico: electrónico: el de Barrido Barrido (Scanning) (Scanning) y el de de Transmisión.  El de Barrido permite permite observar observar pedazos pedazos de tejido tejido de de mayor mayor tamaño tamaño y nos da una imagen tridimensional.  El de Transmisión Transmisión permite permite observar observar cortes ultrafinos ultrafinos o tinciones tinciones negativas. negativas.  MICROSCO  MICROSCOPIO PIO FLUO FLUORESCE RESCENTE. NTE.-- 12 13  Es aquel aquel que que esté provisto provisto de filtros que permite permitenn observar observar con luz luz ultraviolet ultravioleta, a,  sustancias  sustancias teñida teñidass con colorantes colorantes fluorescentes fluorescentes.. Con éste aparato aparato se puede puede realizar dos tipos de pruebas: Fluorescencia Directa e Indirecta.  BAÑO MARIA.MARIA. Es un aparato aparato eléctrico eléctrico que se usa con con frecuencia frecuencia en los laboratorios laboratorios,, el mismo mismo que contiene agua y un termómetro para regular la temperatura. Sirve para incubar (inactivar) diferentes muestras: suero, autovacunas, autovacunas, una temperatura constante de 37 - 56 °C.  RESTRICCIO  RESTRICCIONES NES DE DE LA TECNICA.TECNICA. No se puede emplear emplear los instrumentos instrumentos modernos modernos ejemplo ejemplo:: pipetas pipetas automáticas, densímetros por falta de materiales en la facultad que esperamos que se vayan obviando paulatinamente.  DR ERNESTO ERNESTO RONQUILLO RONQUILLO 13 14 CLASIFICACION DE LAS MUESTRAS CLINICAS.Según la posibilidad de que las muestras clínicas para el cultivo bacteriológico, estén contaminadas con la FLORA NORMAL se pueden dividir en tres áreas. Hay distintos procedimiento en cada caso para ACCEDER al PATOGENO.  A.- MUESTRAS DE AREAS PROFUNDAS Y CERRADAS DEL CUERPO (DIRECTAS).  La muestra muestra recogida contendrá solo solo el germen germen patógeno. patógeno. Debe atravesarse atravesarse la piel   para llegar llegar al patógeno patógeno utilizando utilizando medios medios quirúrgicos quirúrgicos o POR POR ASPIRACION ASPIRACION CON  CON   AGUJA.  AGUJA. Asepsia previa. previa. Ej. Sangre.  B.- MUESTRAS DE AREAS PROFUNDAS QUE COMUNICAN CON EL  EXTERIOR (INDIRECTAS). (INDIRECTAS).  La muestra muestra seguramente seguramente contendrá contendrá AMBOS AMBOS TIPOS DE DE GERMENES: GERMENES: Patógenos Patógenos y de la Flora normal, pues estos últimos están en "el paso" para acceder al patógeno. Ej. Orina por micción. C.- MUESTRAS DE AREAS SUPERFICIALES DEL CUERPO.  La flora patógena y la no-patógena no-patógena están están ASOCIADAS ASOCIADAS en el lugar de la la infección; infección; ambos tipos son recogidos en la muestra. Los gérmenes no patógenos no deben tomarse en cuenta al interpretar los resultados del cultivo. El instrumento mas útil en la recolección de estos especímenes especímenes es la TORUND TORUNDA, A, un aplicador con la punta envuelta en algodón, fibra de poliester, alginato de calcio, o dacrón.  Ej. : Piel Piel y membranas membranas mucosas. mucosas. OBTENCION DE LAS MUESTRAS. ORINA.  MATERIAL. - Frasco de vidrio o de plastico estéril   PROCEDIMIENTO. 1. - En la MUJER puede hacérselo en posición sentada o en cuclillas. a.- Apartar los labios uretrales con los dedos índice y anular, desde arriba. b.- Lavar cuidadosamente la vulva con una esponja mojada con una solución  jabonosa no no bactericida. bactericida. Un buen buen agente de limpieza limpieza es el jabón jabón de lavar lavar común. común.  Repetir 3 veces. Se eliminan eliminan los restos del del lavado con con una gasa estéril. estéril. c.- La micción se efectúa manteniendo los labios separados, recogiendo una muestra del chorro medio, en un recipiente estéril. 2. - En el  HOMBRE . a.- Retraer el prepucio y lavar el glande de igual forma. 3. - En el  INFANTE   INFANTE . 14 15 a.- Lavar los genitales de la misma manera. b.- Utilizar el Reflejo de Pérez. c.- Si fracasa esta maniobra, colocar una bolsita esterilizada sobre los genitales, para recoger espontáneamente la orina.  En estos casos casos deberá recogerse recogerse la primera muestra muestra de la la mañana. En los dos  primeros casos casos recoger recoger la parte intermedia intermedia de la micción. micción.  HECES   Las heces deberán deberán ser frescas, frescas, y si tienen tienen sangre o pus, éstas éstas deberán seleccionarse seleccionarse  para cultivo, cultivo, pues es allí allí donde abundan abundan los microorganismos microorganismos patógenos. patógenos.  PROCEDIMIENTO.- Se debe utilizar para la toma de muestra un bajalenguas, cuchillo o cucharilla estériles para transferir al recipiente adecuado estéril, una porción del excremento. - El material fecal deberá ser recién emitido. - De heces formadas se transfiere un pedazo del tamaño de una nuez, de heces  pastosas o líquidos: líquidos: 1 - 2 ml (una cucharilla cucharilla cafetera). cafetera). FARINGE Y NASOFARINGE.  PROCEDIMIENTO.- Se deberá tomar solo con una visión clara de la faringe, buena luz y utilizando un bajalengua. Se evitará rozar otras estructuras. Prevenir al paciente concurrir en ayunas sin lavarse los dientes con pasta dental. - Se dispondrá de dos hisopos, preferentemente humedecidos en tripticasa de soja. - Con los hisopos se tocará el fondo de la garganta, amígdalas, fosas tonsilares y cualquier otro lugar donde exista inflamación, exudado o ulceración. El frote debe ser  enérgico, de lo contrario será un espécimen deficiente para el cultivo. - Uno de los hisopos se usará para hacer tinciones, y el otro para hacer cultivo.  El estreptococo estreptococo del grupo A es la única causa bacteriana bacteriana común común de faringitis, faringitis, por por ello la estrategia diagnóstica en cultivos de garganta tiene por finalidad identificar en  forma selectiva selectiva este este agente.  ESPUTO.  PROCEDIMIENTO. - El material se recogerá en un frasco estéril de boca ancha. - Que la expectoración se efectúe, si el paciente está en condiciones de hacerlo después de cepillarse los dientes y enjuagarse concienzudamente. - Se recogerá una expectoración de la primera hora de la mañana, que está mas limpia, inmediatamente después de una tos profunda en que se expectoren secreciones de los pulmones. - La muestra se procesará enseguida.  En LACTANTE esputo se obtiene obtiene haciendo haciendo un frotis frotis de la garganta garganta o mejor  mejor   LACTANTES  S  , el esputo aún por lavado gástrico ya que los niños generalmente degluten su expectoración.  HEMOCULTIVOS.  El hemocultivo hemocultivo consiste consiste en cultivar cultivar una una cierta cantidad cantidad de sangre de un un paciente. paciente. Como la sangre es líquida orgánico estéril, el hallazgo de microorganismos en ella 15 16 indicará infección, generalmente de carácter grave. Es esencial un cumplimiento escrupuloso de las normas para la recogida aséptica de las muestras.  PROCEDIMIENTO. - La toma de la muestra se realiza en la vena superficial de la parte interna de la  flexura del del codo. Se limpia previamente previamente la zona desinfectándola desinfectándola con con yodo y alcohol. alcohol. Se repite el mismo procedimiento en el tapón de goma del frasco del hemocultivo, manteniendo su contacto por un minuto. - No palpar el sitio de punción luego de desinfectada la zona. La punción puede efectuarse con aguja y jeringa, o con los instrumentos de doble aguja que existen especialmente para este fin. - Inocular la sangre directamente en medio de cultivo a la cabecera de la cama. - Ante una bacteremia de origen desconocido es conveniente tomar dos muestras e incubarlas aeróbica y anaerobicamente. - Después de la extracción de sangre se taponará la herida con algodón y alcohol 70.  La cantidad cantidad de muestra muestra y el número número a tomar tomar dependerá dependerá de la edad edad y circunstancias circunstancias del  del   paciente.  EXUDADO OTICO  Las infecciones infecciones externas externas del oído oído frecuentemente frecuentemente son son secundarias secundarias a heridas heridas al  rascarse las partes externas, con algún objeto punzante, infecciones por virus que se infectan secundariamente, alergias, prácticas de natación. - La toma se realiza después de haber limpiado y desinfectado concienzudamente el   pabellón auricular. - Si hay supuración la toma se realiza con hisopo. Si existe forúnculo, se efectúa con aguja y jeringa. Se realizan las preparaciones microscópicas y se siembra en los medios adecuados.  EXUDADOS VAGINAL Y URETRAL.  Las enfermedades enfermedades de transmisión transmisión sexual (ETS) (ETS) pueden pueden causar con Exudado Vaginal Vaginal o con Ulceras y/o tumoraciones.  PROCEDIMIENTO. - Cuando hay sospecha de infección vaginal o uterina, se introducirá él especuló con el mínimo de lubricante que permita la comodidad de la paciente (a veces basta el  agua tibia), ya que la mayor parte de los lubricantes son bacteriostáticos. - Es útil el empleo y envío de dos hisopos con muestra del exudado vaginal, uno seco y otro introducido en un medio de transporte (Stuart, A o Cary-Blair). El primero se utilizará para el examen en fresco y tinciones, y el segundo para los cultivos. - Para investigar la presencia de Gonococo, nunca se tomarán muestras de vulva ni de vagina, pues difícilmente son positivas. La muestra se tomará con ayuda de un especuló, después de haber extraído el tapón mucoso que recubre el cérvix, de endocérvix, introduciendo la punta en un hisopo a través de un catéter de luz estrecha colocado en la abertura cervical. De este modo se evita tocar la mucosa cervical  reduciendo la posibilidad de contaminación. 16 17  En el caso de las niñas niñas en la pubertad pubertad que presentan epitelio epitelio vaginal apto apto para el  el  desarrollo del gonococo, se tomará la muestra de dicho sitio. - Casi la mitad de las mujeres afectadas de gonorrea alojan gonococos en el conducto anal; por lo tanto se hará un cultivo rectal.  En el caso de las infecciones infecciones genitales genitales en el hombre: hombre: Una suave suave presión del del pene  permite obtener una muestra útil útil para el cultivo cultivo y el frotis frotis coloreado coloreado con el Gram. Gram. TECNICAS DE SIEMBRA BACTERIANA. CONTENIDO Siembra o inoculación es extender una pequeña cantidad de muestra sobre la  superficie  superficie de la placa con agar, con un sistema de actuación actuación preestablecido preestablecido y con la ayuda de una asa de alambre fino o de plástico desechable. Este sistema de separación recibe el nombre de SIEMBRA POR AGOTAMIENTO EN SUPERFICIE. Las bacterias bien aisladas unas de otras crecerán como pequeñas masas de microorganismos, alcanzando unos 2 a 3 mm de diámetro al cabo de una incubación de 18 a 24 horas, denominadas COLONIAS, que a simple vista pueden verse en la superficie del agar. Cada colonia está formada por billones de gérmenes y constituyen todos los descendientes de un solo microorganismo que fue a parar a dicho lugar.  MATERIAL  MATERIAL A UTILIZAR: UTILIZAR: - Mechero de alcohol. - Tubo de ensayo con él inoculó o muestra. - Caja de petri con el medio de cultivo estéril. - Asa de inoculación  INOCULACION DE MEDIOS DE CULTIVO EN TUBOS. TUBOS.  Los medios medios se pueden distribuir distribuir en tubos ya ya sea como como caldos o en forma de de agar. El  agar puede ser semisólido o sólido, generalmente formando un plano inclinado. Para la inoculación de especímenes se emplea generalmente el asa; para la transferencia de cultivos puros de placas a tubos, la aguja es, habitualmente el instrumento elegido.  PROCEDIMIENTO. - Flamee el asa como se ha descrito anteriormente y déjela enfriar. - Quite el tapón de rosca (o el algodón) del tubo y tome con el asa una porción del  espécimen. - Vuelva a poner el tapón de rosca (o el algodón) en el tubo tubo que contiene el  espécimen. Quite el tapón del tubo que se va a inocular   RESIEMBRA BACTERIANA.  Es la TRANSFER TRANSFERENCIA ENCIA de colonias bacteriana bacterianass de la caja caja de petri a tubos tubos u otra otra caja que contienen medios de cultivo esterilizados. Con éste método las cepas que interesan se aíslan en CULTIVO PURO. Para ello tocamos la colonia seleccionada 17 18 con el extremo de una aguja esterilizada y transferimos los microorganismos adheridos a la aguja, al medio de cultivo deseado para su mejor proliferación.  MATERIAL. - Asa y aguja de inoculación - Caja de Petri con colonias a transferir. - Mechero de alcohol  - Caja de Petri o tubo (según el caso) con medio de cultivo estéril. CARACTERISTICAS MORFOLOGICAS DE LAS COLONIAS EN LOS MEDIOS   DE CULTIVO  Los microbiólogos microbiólogos utilizan utilizan diversas características características de las colonias colonias bacteriana bacterianass que se desarrollan en la superficie de los medios de cultivo de agar con dos finalidades: - Efectuar la IDENTIFICACION PRESUNTIVA BACTERIANA PRELIMINAR. - COMO GUIA EN LA SELECCION DE PRUEBAS a fin de determinar las características diferenciales para la identificación final. CRITERIOS UTLIZADOS. 1. - Tamaño (diámetro en mm.) 4. - Elevación. 7. - Superficie. 2. - Forma. 5. - Borde (margen). 8. - Densidad. 3. - Consistencia. 6. - Color. 9. - Olor. FORMA: Puntiforme, circular, filamentosa, irregular, rizoide, fusiforme.  BORDE de las colonias: Plano, elevado, convexa, acojinada, umbiliforme, umbilicada. COLOR: Blanco, amarillo, negro, naranja, .  SUPERFICIE : Brillante, mate, etc.  DENSIDAD: Opaca, translúcidas, transparentes, etc. CONSISTENCIA: Butirosa, viscosa, membranosa, quebradiza, mucoide.  MATERIAL. - Medios de cultivo con las distintas siembras bacterianas. - Fuente de luz. - Lupa.  RESTRICCIONES.  La interpretación interpretación de cultivos cultivos primarios primarios es es una habilidad habilidad especial especial que se debe adquirir trabajando con un microbiólogo bien capacitado y generalmente se logra dominar sólo luego de muchos meses o años de experiencia. Como ejemplo podemos cita las características característica s de las colonias en placas de agar de 3 bacilos Gram negativos distintos. Cada una de ellas es típica de su especie aunque son  frecuentes  frecuentes las variaciones: variaciones: - Las colonias E. Coli son planas con un borde recortado. - Las colonias de Klebsiella pneumoniae tienen un borde completamente liso y una  superficie  superficie elevada y mucoide. mucoide. 18 19 - Las colonias de P. Aeruginosa presentan una superficie irregular que recuerda una  superficie  superficie metálica metálica golpeada golpeada repetidamente repetidamente con con un martillo. martillo. Colonias en agar sangre que muestran zonas evidentes de hemólisis. El gran tamaño de las colonias comparado con las zonas de hemólisis sugiere una especie hemolítica de Staphylococcus. Colonias puntiformes B - hemolíticas: sugieren especies de Streptococcus. El reducido tamaño de las colonias bacterianas comparado con el gran tamaño de la zona de hemólisis B, es altamente sugestivo de esta especie. Colonias lisas diseminadas con pigmentación verde definida, sugieren la presencia de  pseudomonas  pseudomonas aeruginosa. aeruginosa.  El desarrollo desarrollo colonial colonial profuso profuso y en ondas ondas de dispersión, dispersión, es característic característicoo de Proteus Proteus vulgaris o Proteus mirabilis. MUESTRAS IMPORTANTES DE VARIAS ZONAS Y TIPOS DE INFECCIÓN  Zona/tipo de infección tipo de muestra Líquido Tejido 19 Torunda otros 20 Tracto urinario Vejiga Riñón Tracto gastrointestinal  Intestino Boca Hígado Tracto biliar   Abdomen  Abdomen Orina orina Biopsia renal Torunda rectal heces Lavados Biopsia hepática Bilis Pus  Aspirado peritoneal peritoneal Líquido ascítico Tracto respiratorio Nariz Nasofaringe Faringe Pulmón Lavados (V) Esputo Lavado alveolar  Líquido pleural Espacio pleural Oído Ojo Torunda nasal Torunda pernasal Torunda faríngea Biopsia pulmonar  Torunda auricular  Torunda ocular  Sistema nervioso central  Líquido cefalorra quídeo(L CR) Meninges Encefalitis (herpes)  Absceso cerebral cerebral “placa de tos”: el paciente tose directamente en una placa de agar  inoculación directa de placas de cultivo a la cabecera de la cama Biopsia cerebral Pus, LCR Tracto genital  Uretra Vagina Cerviz endometrio Piel y tejidos blandos Piel Torunda uretral Torunda vaginal alta Torunda cervical Microscopia directa y cultivo en la clínica Torunda cutánea (portador) torunda de herida Placas de impresión Biopsia endometrial Herida Hueso y articulación Osteomielitis articulación Septicemia Líquido vesicular  (V) Pus Biopsia cutánea(M) Raspados(H) Pus aspirado Sangre Hueso* Fiebre de origen desconocido Sangre Endocarditis *recogido en la operación microbacterias Sangre Válvula cardíaca* (V) muestras para virología (H)muestras para hongos CLASIFICACIÓN DE MUESTRAS CLÍNICAS  20 Extensión de sangre para parásitos palúdicos (M)muestras para 21  A. A.- MUESTRAS OBTENIDAS DIRECTAMENTE Sitios profundos sin comunicación: Teji Tejido doss u órga órgano noss Líquidos orgánicos: Sangre, linfa, pleural Peritoneal, articular Pericárdico, etc. Absceso profundo TÉCNICAS PARA ADECUADA RECOLECCIÓN DE MUESTRAS: Asep Asepsi siaa de la piel piel Aspiración con aguja VENTAJAS Y RESTRICCIONES DE LA TÉCNICA: Normal Norm alme ment ntee esté estéri rile less Los resultados (+): Son diagnósticos Biopsia quirúrgica Los resultados (-) Excluyen la infección. Pueden entrañar  cierto riesgo para el  paciente. B. B. MUESTRAS OBTENIDAS INDIRECTAMENTE: SITIOS PROFUNDOS CON COMUNICACIÓN -Exudados inflamatorios -Esputo, orina. TÉCNICAS PARA RECOLECCIÓN ADECUADA DE MUESTRAS: -Eludir las áreas Contaminantes -Pruebas cuantitativas -Aspiración: 21 VENTAJAS Y RESTRICCIONES DE LA TÉCNICA: -Pueden estar  contaminadas con F.N -Más cómodas de obtener. 22 -Endocervix, vesícula -Fístulas. Suprapúbica, transtraqueal. -Correlación de hallazgos clínicos y microbiológicos. C. C. MUESTRAS DE ZONAS DE PIEL Y MUCOSAS: -Piel: Lesiones, heridas, absesos. -Membranas mucosas: Orificios del cuerpo (faringe, intestino), uretas, oído, etc. -Material de colostomia TÉCNICAS PARA RECOLECCIÓN ADECUADA DE MUESTRAS: VENTAJAS Y RESTRICCIONES DE LA TEORÍA -Utilizar medios de cultivos selectivos -Investigar agentes etiológicos específicos. Ej: estreptococo B.H GA.(Faringe) Tifoidea (heces) conocido (exud.uretal) -Ignorar la F.N. -Zonas usualmente contaminadas. -Restringir la búsqueda a gérmenes patógenos que no se hallan en el sitio infectado. -No apropiado para cultivos anoeróbicos. 1. Flamear el asa y tomar con ella una porción delgada de la muestra. Colocarla en el agar y distribuirla en el 1/4 superior. 2. Luego de flamear el asa, se repite el procedimiento previo, giro de 90° a la izq en el 1/4 siguiente, partiendo 22 23 de la zona última anteriormente sembrada. 3. El proceso se repite por tercera vez como en 2 hasta cubrir la superficie de la placa. TRANSFERENCIAS DE UN CULTIVO PURO 23 24 INOCULACIÓN DE MEDIOS EN TUBO MEDIOS LÍQUIDOS Caldo de Tioglocolato MEDIOS INCLINADOS 24 Agar de Soya, Trypticase O en agar nutritivo base inclinada 25 MEDIOS ESPECIALES INCLINADOS MEDIOS SEMISÓLIDOS Agar TSI Medio CTA 25 26 D 26 27  AUTOR:DRA  AUTOR:DRA JOSEFINA JOSEFINA RAMIREZ  RAMIREZ   ESTUDIO MICROBIOLOGICO MICROBIOLOGICO DE COLECCIONES  COLECCIONES   SUPURATIVAS  OBJETIVO:  Al finalizar finalizar la clase clase práctica práctica el alumno alumno será será capaz capaz de: de: 1. - Seleccionar que medio de cultivo se necesita para el estudio de las colecciones supurativas. 2. - Escoger el medio de cultivo para realizar el estudio de las colecciones  supurativas.  supurativas. 3. - Interpretar los resultados.  MATERIALE  MATERIALES. S. - Muestra del material supurativo a estudiarse. - Medio de transporte, el cual se escogerá dependiendo de la cepa que se va a estudiar. - Lámina porta objeto. - Asa de inoculación - Mechero. - Solución salina o agua destilada. - Colorantes. - Microscopio. - Medios de Cultivo, uno sólido (agar Sangre) y otro líquido (caldo de Thioglicolato). CONTENIDOS: OBTENCION DE LA MUESTRA:  Este párrafo párrafo está indicad indicadoo en el capitulo capitulo de toma toma de muestra muestra  MEDIO  MEDIO DE TRANSPOR TRANSPORTE.TE.Si la muestra no puede ser sembrada inmediatamente, o hay que mandarla a un laboratorio distante , esta debe colocársela en un medio de transporte como el de Staurt o el de Amies, así como también si se  sospecha  sospecha de la presencia presencia de anaerobi anaerobios os sería sería mejor mejor utilizar utilizar el medio medio de de Cary Blair.  METODOLO  METODOLOGIA GIA OBSERVACION MACROSCOPICA:. Al llegar llegar la muestra muestra al laboratorio, laboratorio, se observa observa macrosc macroscópica ópicament mente, e, pues pues esto nos sirve para orientarnos en el diagnóstico. Así un pus común compuesto por gránulos blancos-grisáceos es sugestivo de actinomyces; 27 28 una coloración verde azulada azulada recuerda a pseudomonas, y un olor fétido  se relacionar relacionaría ía con con anaerobi anaerobios os o coliformes. coliformes. OBSERVACION MICROSCOPICA:. Es indispensa indispensable ble para realiza realizarr una extensión extensión fina fina y homog homogénea énea del pus pus y teñirla con el método de Gram o de Ziehl-Neelsen, pues su observación microscópica nos dirá los pasos a seguir y los medios de cultivo a utilizar.  SIEMBRA  SIEMBRA DE DE LAS MUESTRAS: MUESTRAS: . Los principa principales les product productores ores de de pus son los microorgan microorganismos ismos que crecen crecen bien en casi todos los medios ordinarios; por lo tanto , el plan sintetizador  bastará con sembrar el producto patológico en dos medios de cultivo, uno  sólido (que puede puede ser agar agar sangre, sangre, el mismo que permite permite aislar la mayoría mayoría de las bacterias aerobias y anaerobias anaerobias o el medio de Lowenstein- Jensen  si se sospecha sospecha una Etiolog Etiología ía tubercu tuberculosa), losa), y uno líquido líquido como como es el caldo de tioglicolato que tiene funciones de enriquecer el crecimiento de anaerobios estrictos y facultativos. A las 24 horas de incubación a 35 °C   se efectuaran efectuaran las oportuna oportunass resiembras resiembras en medios medios sólidos sólidos.. VENTAJAS   Este examen examen es el que que nos nos permite permite en en poco poco tiempo tiempo y con una una simple simple observación obtener una orientación diagnóstica  DESVENTA  DESVENTAJAS  JAS   La de contar con todo todo el material material requerid requerido. o. como como por por ejemplo: ejemplo: un medio medio de transporte.  INTERPRET  INTERPRETACION ACION DE RESULT RESULTADOS: ADOS: OBSERVACION DE LAS COLONIAS:.Colonias gamma hemolíticas de 4,5 mm. Blancas, opacas de bordes rizados en agar sangre (Bacillus antracis). Colonias gamma hemolíticas de 1 a 2 mm. En agar sangre (streptococos no hemolíticos)) Colonias gamma hemolíticas pequeñas transparentes, relucientes de margen ondulado ondulado en agar sangre (yersinia pestis) Colonias puntiformes ( 24 24 horas) En el medio de Francis (Francisella talurensis) Colonias rugosas pálidas (Aspecto cerebroide) en agar de Lowestein Jensen (Mycobacter (Mycobacterium ium tuberculosis) tuberculosis)  AUTOR:DR  AUTOR:DR CARLOS CARLOS MOSQU MOSQUERA ERA 28 29  MUESTRAS ESPECIALES ESPECIALES PARA EL  DIAGNOSTICO  DIAGNOSTICO BACTERIOLOGICO BACTERIOLOGICO  INTROD  INTRODUCC UCCION ION::  El establecim establecimiento iento del diagnós diagnóstico tico en las enfermedade enfermedadess infeccios infecciosas as dependen en gran parte de la selección de la muestra, del tiempo en que  se colecta colecta y del cuidado cuidado que en ello ello se pone. pone. Estos factore factoress son con  frecuencia  frecuencia de importan importancia cia para para el el éxito éxito en el el diagnóstic diagnósticoo etiológi etiológico co de las enfermedades infecciosas. OBJETIVOS:  Al finalizar finalizar la clase clase el alumno alumno estará en capacida capacidadd de: 1.- Demostrar como se toman correctamente las muestras para su estudio bacteriológico. 2.- Identificar las características morfológicas de las Bacterias.  Predecir  Predecir cómo cómo y cuándo cuándo solicitar solicitar un examen para su estudio estudio bacteri bacteriano. ano. 3.- Demostrar la acción patógena de las Bacterias sobre el organismo. 4.- Explicar las condiciones de como preservar y enviar las muestras  para su estudio estudio bacteri bacteriológi ológico. co.  LIQUIDO  LIQUIDO CEFAL CEFALORR ORRAQUI AQUIDEO DEO (LCR).  Los principa principales les agentes agentes etiológicos etiológicos que podemo podemoss encontrar encontrar en un LCR son son los siguientes:  Neisseria  Neisseria meningi meningitidis, tidis, Haemophilu Haemophiluss influenza influenzae, e, Estreptoc Estreptococos ocos neumoniae, Estafilococos áureas, Enterobacterias, Mycobacterium tuberculosis.  MATERIALE  MATERIALES: S: Se requiere el siguiente material: - Tubos de ensayo estériles. - Equipo para punción punción lumbar. - Asa de inoculación.  PROCEDIM  PROCEDIMIENTO IENTO::  La muestra muestra se obtiene obtiene por por punción punción lumbar lumbar previa previa desinfec desinfección ción del área y debe ser enviada inmediatamente al laboratorio , la muestra no debe ser  refrigerada , si ni se la procesa en el momento debe ser incubada o dejada a temperatura ambiente .  El LCR para su estudio estudio bacteri bacteriológic ológicoo se centrifuga centrifuga a 2500 2500 r.p.m. r.p.m. x 10! 10! con el sedimento obtenido obtenido se hace un frotis para teñir con Gram que  sirve para para orientar orientar hacia el tipo tipo de tratami tratamiento ento a establecer establecer e indica indica los los medios de cultivo a utilizar si se busca bacilo tuberculoso se realiza tinción Ziehl Neelsen y se siembra en medio de Lowenstein Jensen . 29 30  En el caso de de Neisseria Neisseria meningitidi meningitidis, s, se siembra en agar agar Chocolate Chocolate o Tayer Martin a 35 °C en atmósfera de 5 a 10% de CO2, para luego realizar la reacción bioquímica en agar CTA (Cisteína trípticasa) adicionado de los respectivos carbohidratos.  LIQUIDO  LIQUIDO SINOV SINOVIAL IAL  El estafiloco estafilococo co aureus aureus es el agente agente etiológico etiológico más común común de la artritis artritis  séptica,  séptica, sin embargo embargo pueden pueden aislarse aislarse otros otros agentes agentes como como el Haemophil Haemophilus us influenzae, Estreptococos viridans, etc.  MATERIALE  MATERIALES: S: - Jeringa estéril. - Tubo de ensayo estéril.  PROCEDIM  PROCEDIMIENTO IENTO::  La muestra muestra se obtiene obtiene por por aspiració aspiraciónn con con una jeringa estéril, la muestra muestra debe ser colocada en frascos para transporte en anaerobios para  preservar  preservar la viabilidad viabilidad de los anaerobios. anaerobios.  Puede ser útil útil inocular inocular un frasco frasco para para hemocul hemocultivo tivo con parte parte de de la muestra , sobre todo si el especimen no puede ser llevado inmediatamente al laboratorio.  Las muestra muestra muy purule purulentas ntas se inoculan inoculan directament directamentee en diversas diversas placas placas de agar, incluyendo alguno que permita el desarrollo de microorganismos exigentes como: A. Chocolate, A. Sangre, y en un medio enriquecido como el caldo de thioglicolato. Si se sospecha de tuberculosis se inoculará en el medio de Lowenstein  Jensen.  Jensen.  LIQUIDO  LIQUIDO ASCITI ASCITICO CO  La E. coli es la bacteri bacteriaa que se encuentra encuentra con mayor mayor frecuencia frecuencia seguida seguida  por el Estreptococo Estreptococo neumoniae neumoniae y otros otros Estreptococ Estreptococos os del del grupo grupo A. Aunque Aunque también pueden aislarse Enterobacterias, Estafilococos, etc.  MATERIALE  MATERIALES  S  - Equipo para paracentesis. - Tubos de ensayo estériles. - Asa de Inoculación. PROCEDIMIENTO  La muestra muestra se obtiene obtiene por por aspiració aspiraciónn percutáne percutáneaa (paracentesi (paracentesis) s) o en el  momento de una cirugía y se envía al laboratorio para examen directo y cultivo.  El transporte transporte debe realizarse realizarse en un frasco frasco para para anaerobi anaerobiosis, osis, por lo  general  general de 1 - 5 ml de líquido líquido son suficien suficientes tes para para el diagnóstico diagnóstico de una una  peritonitis.  peritonitis. Como en todo todo material material que se presume presume que contiene contiene anaerobios, éstas muestras deben ser inoculadas lo más rápido posible.  LIQUIDO  LIQUIDO PLEUR PLEURAL AL 30 31  Las Bacteria Bacteriass que pueden pueden ser aisladas aisladas del del líquido líquido pleural pleural incluyen incluyen aquellas relacionadas con neumonías, como Estreptococos neumoniae,  Estafilococo  Estafilococoss aureus. aureus. H. H. influenzae influenzae,, Enterobac Enterobacterias terias,, bacilo bacilo tubercul tuberculosos osos  y anaerobios anaerobios..  MATERIALE  MATERIALES  S  - Tubos de ensayo estériles. - Jeringuilla estéril. - Equipo para toraconcentesis. - Asa de inoculación.  PROCEDIM  PROCEDIMIENTO IENTO  La muestra muestra se recoge recoge por aspiración aspiración (toraconcent (toraconcentesis) esis) y transporta transportada da al  al  laboratorio lo mas pronto posible.  Para el el aislamien aislamiento to de la mayoría mayoría de las Bacterias Bacterias es suficiente suficiente una una muestra de 1 - 5 ml, pero cuanto sea mayor el volumen habrá mejores  probabilida  probabilidades des de de aislamien aislamiento to de de algunos algunos patóge patógenos nos como como el   Mycobacteri  Mycobacterium um tuberculosis. tuberculosis.  Las muestra muestrass que se reciben reciben en en frascos frascos para para transport transportes es de anaerobios anaerobios o  jeringas  jeringas deben ser inoculad inoculadas as tan tan pronto pronto como como sea sea posible posible en en los medios medios de cultivo para aerobios y anaerobios de rutina.  Además deben examinarse examinarse frotis frotis teñidos teñidos con Gram y Ziehl Ziehl Neelsen Neelsen  LAVADO  LAVADO GASTRIC GASTRICO O (HELICO (HELICOBACTE BACTER R PYLORI) PYLORI)  MATERIALE  MATERIALES  S  - Tubos de ensayo estériles. - Asa de inoculación. - Colorantes para tinción de Gram.  PROCEDIM  PROCEDIMIENTO IENTO  La muestra muestra se obtendrá obtendrá a través través de endosco endoscopía pía digestiva digestiva para para obtener obtener la  secreción  secreción gástrica gástrica , una vez obtenid obtenidaa la muestra muestra debe debe ser enviada enviada al  laboratorio inmediatamente para poder neutralizar la acidez.  De la secreción secreción se hará frotis directo directo para para ser teñidos teñidos con Gram a fin de identificar bacilos Gram negativos curvos, para posteriormente realizar  la prueba de la ureasa.  LAVADO  LAVADO BRONQ BRONQUIAL UIAL  Las bacterias bacterias que con con mayor mayor frecuenc frecuencia ia podemo podemoss encontra encontrarr en el el lavado lavado bronquial tenemos: Mycobacterium tuberculoso, H. influenzae,  Estreptococo  Estreptococo neumoniae. neumoniae.  MATERIALE  MATERIALES  S  Tubos de ensayo estériles. 31 32  Asa calibrad calibrada. a. Cepillo bronquial   PROCEDIM  PROCEDIMIENTO IENTO  La muestra muestra se obtiene obtiene a través de un cepillo cepillo bronquia bronquiall protegido protegido por un un catéter. Se coloca dentro de una cánula doble un cepillo pequeño que recoge 0.01 a 0.001mg de secreciones. El extremo extremo de la cánula exterior se obtura con un tapón de polietilenglicol, una vez que la cánula se ha insertado en el  área apropiada, se empuja la cánula interior que desaloja al tapón a medida que es extraída, luego se extiende el cepillo hacia el exterior de la cánula interna.  La muestra muestra obtenida obtenida se suspende suspende en 1 ml de caldo caldo agitand agitandoo en un vortex vortex y luego se inocula en los medios de cultivo usando una asa calibrada de 0.01 ml. TEJIDOS   Entre las Bacteria Bacteriass que podemos podemos aislar aislar de material material de biopsia biopsia o de de tejido tejido tenemos: Mycobacterium tuberculoso, Brucella, Listeria monocytogenes.  MATERIALE  MATERIALES  S  - Frasco plástico con boca ancha y tapa de rosca. - Solución salina estéril.  PROCEDIM  PROCEDIMIENTO IENTO  Las muestra muestrass del tejido deben ser obtenida obtenidass luego luego de una cuidad cuidadosa osa  preparación  preparación de la piel, ya ya que es important importantee que las biopsias biopsias se extraigan extraigan en condiciones asépticas. Se recomienda un envase plástico de boca ancha y tapa de rosca. Los microorganismos anaerobios sobrevivirán en los tejidos el tiempo  suficiente  suficiente para para ser ser recuperado recuperadoss luego luego en el cultivo. cultivo. Para mantener mantener la humedad de la muestra conviene agregar un pequeño volumen de solución  salina,  salina, no usar formol formol en las las muestras muestras para para estudio estudio bacteriológ bacteriológico. ico.  AUTOR: DR DR JUAN MORENO MORENO PINCAY  32 33 TECNICAS DE PREPARACION DEL FROTIS Y   SU FIJACION  OBJETIVOS: - Elaborar el frotis. - Reconocer los pasos ordenados para la realización de un frotis. - Utilizar adecuadamente el asa de inoculación. - Aprender a flamear el asa de inoculación y la lamina portaobjeto. portaobjeto. - Usar adecuadamente los dedos de la mano para coger el asa y par a taponar el tubo de ensayo. - Sostener adecuadamente el tubo de ensayo en el momento de tomar la muestra bacteriana. CONTENIDO. Antes de realizar realizar cualquier cualquier tipo de tinción tinción bacteriana bacteriana  previamente  previamente debemos debemos realizar realizar un un frotis . Pero -Qué -Qué es un frotis?, No es otra cosa que el extendido de una suspensión bacteriana en una lámina  portaobjeto  portaobjeto limpia de tal forma que se forme una pelícu película la uniforme uniforme y fina en el tercio medio de la placa.  Los frotis preferenteme preferentemente nte deben realizarse realizarse tomando tomando muestras muestras de cultivos frescos o directamente directamente de los focos infecciosos. El frotis se lo  puede realizar realizar con el asa de inoculaci inoculación ón o con un un hisopo, hisopo, para para realizar realizar un  frotis es necesario necesario que el estudiante estudiante tenga conocimient conocimientos os previos previos de los materiales utilizados en bacteriología, este frotis dejaría de ser  importante sino se continúa con el procedimiento procedimiento de tinción. tinción.  Es importan importante te recordar recordar que para para efectuar efectuar un buen buen frotis frotis este debe debe quedar  quedar  del mas fino espesor posible para poder individualizar microscópicamente una célula bacteriana de otra.  MATERIALE  MATERIALES S A UTILIZA UTILIZAR. R. -Cultivos, caldos y agares - Asa de inoculación - Hisopos - Mechero - Solución salina o fisiológica - Una tubera o gradilla - Papel filtro -Pinza porta lámina- Lámina portaobjeto TECNICA 1.- Limpiar un portaobjeto aplicando la llama a una de las superficies, colocarlo sobre la mesa con el lado tratado hacia arriba. 33 34 2.- Tomar el asa de transferencia o de inoculación como si fuera un lápiz con el pulgar y el índice. 3.- Insertar el asa de inoculación en un ángulo de 60° en la punta de llama del mechero de Bunsen o del alcohol, calentar al rojo toda el asa. 4.- Tomar el tubo de ensayo que contiene solución salina con la mano libre, quitar el tapón de algodón ó tapa con los dedos de la mano que  sujeta el asa de inocular inocular y que está libre. 5.- Calentar el borde del tubo haciéndolo pasar por el cono superior de la llama. 6.- Insertar el asa esterilizada dentro de la solución salina y extraer 2 o 3 asadas y llevarlas al centro de la lámina porta objeto. 7.- Esterilizar el asa nuevamente y tomar una muestra de colonias bacteriana siguiendo el procedimiento anterior tratando en lo posible coger el tubo de ensayo del fondo. 8.- Llevar las muestras de colonias bacterianas al centro de la lámina donde previamente estaba la solución salina ,sin olvidar de tapar los tubos de ensayo. 9.- Hacer un extendido con el asa de inoculación realizando movimientos circulares que abarquen el tercio medio de la placa, dejar que el frotis  seque al aire. aire. 10.- Pasar varias veces el frotis por el mechero para fijarlo. 11.- Esterilizar el asa de inoculación antes y después de utilizarla. 12.- El frotis también se puede fijar con fijador de Schaudinn de 5 minutos a 50°C o una hora a temperatura ambiente sin sufrir daños el   frotis.  El estudiant estudiantee durante durante la ejecución ejecución de la técnica utilizará utilizará correctam correctamente ente los cinco dedos de la mano; el meñique y el anular para el tapón, el índice  y pulgar pulgar para para el asa y el dedo dedo medio medio de de apoyo. apoyo. VENTAJAS Y DESVENTAJAS   La realizaci realización ón de un frotis frotis tiene tiene la ventaja ventaja de favorecer favorecer a las técnicas técnicas de tinción para ellos es importante que el espesor sea lo mas fino posible. Una de las desventajas es que al fijar la placa ciertas proteínas  plasmáticas  plasmáticas se coagula coagula y se adhiere adhiere al porta porta objeto. objeto. Cuando la fijación se hace con alcohol metílico; en 2o3 minutos está lista la placa. Cuando se fija con el alcohol es cuando el extendido es generalmente rico en materiales hísticos.  La realizaci realización ón de un frotis frotis tiene tiene importanc importancia ia si si se realiza realiza la la tinción; tinción; cuando se observa al microscopio las Bacterias están muertas ya sea por  la fijación o por los mismos colorantes que se vayan a utilizar. 34 35 Si el medio de cultivo donde se toma la muestra es líquido la extensión que se consigue es fina y homogénea, si la muestra es tomada de un medio de cultivo sólido la calidad calidad del frotis dependerá mucho de la habilidad  del estudiante al realizar la suspensión y posteriormente el frotis.  RESTRICCIO  RESTRICCIONES NES DEL DEL METOD METODO O  En realidad realidad la única única restricci restricción ón que que tiene tiene el método método en la clase de  práctica  práctica de Bacteriologí Bacteriologíaa es cuando cuando se quiere quiere utilizar utilizar fijadores fijadores como como el el de Schaudinn o alcohol metílico que no hay en stock de nuestro laboratorio,  pero la la fijación fijación la hacemos hacemos a fuego fuego lento lento con con el mechero mechero  METOD  METODOS OS FISIO FISIOLOG LOGICO ICOS S DE IDENTI IDENTIFICA FICACION CIONDE DE LA LA  MOTILI  MOTILIDAD DAD BACTER BACTERIANA IANA BACTER BACTERIAN IANA A OBJETIVOS: 1.- Discriminar el movimiento bacteriano del Browmiano mediante la observación microscópica . 2.- Reconocer la motilidad bacteriana producido en un medio de cultivo. 3.- Realizar una suspensión bacteriana . 4.- Ejecutar la técnica de lámina y laminilla, gota pendiente y en tubo capilar cerrado. CONTENIDO:  La motilida motilidadd o movilid movilidad ad bacteri bacteriana ana es es una de las propiedade propiedadess o características de muchas especies bacterianas de avanzar mediante  propulsión  propulsión por flagelo flageloss (filament (filamento, o, gancho gancho y complejo complejo basal de la compleja estructura de un flagelo).  El filamento filamento helicoidal helicoidal lo tenemos tenemos como una hélice, hélice, el gancho gancho como como una una unión , y el cuerpo basal como un cilindro o anillo de un motor.  Las Bacteria Bacteriass mótiles mótiles se mueven en pequeñas pequeñas carreras carreras interrumpi interrumpidas das  sobre periodos periodos de rotación rotación sobre sí mismo. mismo. A diferencia diferencia del del movimien movimiento to  Browmiano  Browmiano que son son movimien movimientos tos de partículas partículas de polvo polvo suspendi suspendida da en en agua que tiene un movimiento irregular en zig-zag y refleja los impactos recibidos constantemente al chocar las partículas de polvo con las moléculas de agua y aire que se mueve constantemente, este movimiento  se lo puede puede comparar comparar como como el de migas migas de de pan en una una pecera pecera producid producidaa  por el mordisco mordisco de los peces. peces.  La motilida motilidadd bacteria bacteriana na es una prueba prueba presuncial presuncial de que las Bacterias Bacterias  poseen flagelos flagelos aunque aunque no indica indica número número ni disposició disposiciónn de los mismos. mismos.  Estos movimiento movimientoss flagelares flagelares son en látigos, látigos, circular circular y en rotació rotaciónn a un un  promedio  promedio de de 40 revoluciones revoluciones por segundo segundo.. 35 36  El examen examen directo de los organismos organismos vivos (Bacterias) (Bacterias) pueden pueden tener tener gran gran utilidad para determinar relaciones de tamaño, forma, movilidad y reacciones. TIPOS DE MOTILIDAD BACTERIANA Tenemos la que se realiza en fresco para una observación microscópica y la que se observa en medios de cultivos macroscópicamente.  En fresco fresco tenemos tenemos tres tres métodos: métodos: a) El de lamina y laminilla. b) El de gota pendiente. c) En tubo capilar cerrado.  En medios medios de de cultivos cultivos tenemos tenemos:: a) En agar Motilidad. b) En agar Mac Conkey. y agar sangre c) En agar Edwars-Ewing.  MATERIALE  MATERIALES: S: - 4 Láminas porta objeto excavada. - 4 Láminas porta objeto. - 4 Laminillas cubre objeto. objeto. - 1 Recipiente con vaselina . - 1 Recipiente con xilol. - Plastilina . - 1 Tubo de ensayo con solución salina. - Aplicadores de madera. - Asa y aguja de inoculación. - 2 Tubos capilares. - Mechero. - Medios de cultivo sembrado y estériles. -  Microscopi  Microscopio. o. - TECNICA: OBSERVACION MICROSCOPICA:  ENTRE  ENTRE LAMINA LAMINA Y LAMINILLA LAMINILLA..- (entre (entre porta porta y cubre cubre objeto) objeto)  Depositar  Depositar una una gota gota de cultivo cultivo líquido, líquido, o la suspensi suspensión ón de una coloni coloniaa en  solución  solución salina salina o en suero suero fisiológic fisiológicoo sobre sobre el centro de la lámina lámina porta porta objeto, colocar una laminilla cubriendo la suspensión, a continuación observar en el microscopio utilizando objetivos secos de gran aumento como (10X) o (40X). Esta técnica puede ser utilizada para observación microscópica de anaerobios siempre y cuando se observe con rapidez la  parte central central del montaje. montaje. GOTA PENDIENTE.36 37 Untar una capa débil de vaselina en los bordes de la concavidad de la lámina excavada, colocar una gota gota de suspensión bacteriana en el centro de la laminilla cubre objeto, luego invertir cuidadosamente la lámina  porta objeto excavada excavada sobre sobre la la laminilla laminilla de tal modo que en en el centro centro de la concavidad concavidad corresponda a l de la gota .  Luego observar observar con objetivo objetivo seco seco el borde borde de la gota y a continu continuación ación todo el campo.  EN TUBO TUBO CAPILAR CAPILAR CERRADO. CERRADO.-Con ésta técnica podemos observar Bacterias mótiles anaerobias  principalme  principalmente. nte. Se llena un tubo capilar con una suspensión bacteriana, cerrando inmediatamente los dos extremos con plastilina, luego se observa al  microscopio con el objetivo de 40X  OBSERVACION MACROSCOPICA MACROSCOPICA  MOTILIDAD  MOTILIDAD EN MEDIO MEDIOS S DE CULTI CULTIVO: VO:  EN AGAR MOTILIDA MOTILIDAD.D.Técnica.- Se siembra con la aguja de inoculación en medio de cultivo  semisólido  semisólido tanto en picadura picadura como en profundid profundidad, ad, tratando tratando en lo posible posible que la aguja no penetre mas mas de 1 cm del fondo del tubo. Incubar por 24 horas a una temperatura de 35 - 37 °C, luego se realiza la interpretación de los resultados.  La motilida motilidadd es positi positiva va cuando cuando hay crecimie crecimiento nto de Bacterias Bacterias mótiles mótiles lo que permite que el sitio de picadura se ensanche y se deforme y el medio de cultivo se torna turbio.  La motilida motilidadd es negati negativa va cuando cuando el medio medio de cultivo está claro claro y el sitio sitio de la picadura no ha sufrido transformación.  EN AGAR AGAR MAC MAC CONKE CONKEY, Y, O AGAR AGAR SANGRE SANGRE(FENO (FENOMENO MENO DE   SWARMING  SWARMING)) Técnica.- Sembramos punteando la parte central del agar Mac Conkey, incubamos por 24 horas a una temperatura de 35 - 37 °C.  Hacemos  Hacemos la lectura lectura y observam observamos os si ha habido habido o no crecimi crecimiento ento de  Bacterias  Bacterias (Proteus (Proteus)con )con gran motilidad motilidad en la superficie superficie del del medio. medio. Si hay crecimiento bacteriano con estas características las colonias en la  superficie  superficie del del medio medio no permanecen permanecen compactas compactas y separadas separadas por el  contrario el desarrollo bacteriano se difunde rápidamente sobre toda la  superficie  superficie forman formando do anillos anillos concéntricos concéntricos de dispersión dispersión con ondula ondulacione cioness características en el medio(fenómeno conocido como el de Swarming). 37 38 VENTAJAS Y DESVENTAJAS  VENTAJAS DE LA OBSERVACION EN FRESCO.Se observa la bacteria viva y en movimiento, la forma y posibles alteraciones morfológicas ocurridas al moverse la bacteria; no se expone a observar deformaciones deformaciones causadas por por la fijación y los colorantes.  DESVENTA  DESVENTAJAS JAS DE DE LA OBSERVACI OBSERVACION ON EN EN FRESCOS FRESCOS.. La rápida rápida desecación desecación nos impide impide una observa observación ción prolongada prolongada,, también también nos impide ver ciertas estructuras como cápsulas, flagelos esporas que  solo es es posible posible observar observarlos los con con métodos métodos de tinción tinción especial. especial. En cuanto cuanto a la observación en medios de cultivo si bien es cierto que podem podemos os observar las distintas reacciones que se producen en el medio lo que nos hace sospechar de acuerdo a las características que hay motilidad  bacteriana tiene la desventaja que no podemos observar directamente la bacteria.  RESTRICCIO  RESTRICCIONES NES DEL DEL METOD METODO O  En un tubo capilar capilar aunque aunque es es un método sencillo sencillo de realizar realizar no disponemos de stock en el laboratorio lo mismo que sucede con el medio de Edwars-Ewing probablemente en un futuro no muy lejano estaremos en condiciones de realizar éstos métodos y técnicas para un mejor  conocimiento.  AUTOR  AUTOR JUAN JUAN MORENO MORENO 38 39 TECNICAS DE COLORACION DE BACTERIAS  OBJETIVOS:  Elaborar  Elaborar diferentes diferentes tincio tinciones nes correcta correctamente. mente.  Reconocer  Reconocer los los pasos pasos ordenado ordenadoss para para la realiza realización ción de cualquie cualquierr método método de tinción tinción enseñado. Seleccionar una técnica específica para la tinción de esporas cápsulas.  Identificar  Identificar Bacterias Bacterias ácido ácido resisten resistentes tes y no ácido ácido resistent resistentes. es. CONTENIDO:  Las Bacteria Bacteriass poseen la propieda propiedadd de fijar ciertas ciertas sustancias sustancias colorantes, colorantes, de ahí ahí que cuando éstas se tiñen podemos observar algunas de las estructuras bacterianas que no se observaban en fresco, como por ejemplo cápsulas, esporas, flagelos, membranas, etc.  Hay alguno algunoss tipos tipos de colora colorantes ntes químico químicoss como: como: los los ácidos, ácidos, básicos básicos y neutros. neutros.  Los colorant colorantes es ácidos ácidos tienen tienen carga iónica negativa negativa no tiñen a la célula célula bacteriana bacteriana y  son usados usados para impart impartir ir el fondo de contraste contraste al frotis, frotis, por por ejemplo: ejemplo: la eosina. eosina.  Los colorant colorantes es básicos básicos tienen tienen ión de de carga carga positiva positiva y tiñen las células células bacterianas bacterianas uniformemente, por ejemplo: violeta de genciana, azul de metileno.  Los coloran colorantes tes neutros neutros son sales sales compleja complejass que poseen poseen ambas ambas cargas cargas iónicas iónicas como el eosinato de azul de metileno. Todo procedimiento de tinción parte de un frotis las sustancias químicas que se usan  para teñir Bacteria Bacteriass se la conoce conoce como como colorant colorante. e. Se cree que la bacteria se tiñe debido a un intercambio iónico entre colorantes y elementos activos de la superficie o del interior de la célula bacteriana.  Hay alguna algunass hipótesis hipótesis que sugieren sugieren que las las Bacterias Bacterias Gram positivas positivas contien contienen en un complejo proteínico ribonucleasa-Mg ribonucleasa-Mg en su pared y que el mismo forma un un complejo insoluble con el cristal violeta yodo que no es decolorado con el alcohol. Otros autores refiriéndose a la tinción de Gram que es universalmente conocida,  sugiere  sugiere que los organism organismos os Gram Gram positiv positivos os tienen tienen un punto isoeléctrico isoeléctrico (pH) más bajo y por lo tanto se combina más firmemente con los colorantes básicos y,  finalmente,  finalmente, otra explica explicación ción más reciente reciente y quizás quizás la la más acertada acertada se fundamenta fundamenta en que las paredes de las Bacterias Gram negativas son muy ricas en contenido graso, el mismo que es extraído al ser tratada con alcohol aumentando de ésta forma la  porosidad  porosidad de de la pared celular celular y por por lo tanto tanto la salida salida fácil fácil del del complejo complejo cristal  violeta-yodo. En cambio las Bacterias Gram positivas por la composición química  propia de su pared al ser tratada tratada con con el alcohol alcohol se deshidrat deshidrataa reduciend reduciendoo por por lo tanto la permeabilidad y por ende el complejo cristal violeta-yodo no es extraído. 39 40 Todas las bacterias Gram negativas son constantes en su reacción: las Gram  positivas  positivas son son variables, variables, dependiend dependiendoo de algunos algunos factores factores (Cultivos (Cultivos jóvenes jóvenes,, Cultivos Cultivos viejos, y técnicas). CLASIFICACION DE LOS METODOS DE TINCION. Se clasifican en simples, compuestos y especiales .  Los métodos métodos de tinción tinción simples simples son aquellos aquellos en los que que se utiliza un solo solo colorant colorante. e.  Métodos  Métodos de tinción compuestos compuestos son aquello aquelloss en los que que se utilizan utilizan más de de un colorante.  Los métodos métodos de tinción tinción especiales especiales son aquellos aquellos donde se utilizan utilizan colorantes colorantes o reactivos para estudiar ciertas estructuras específicas de las Bacterias como por  ejemplo gránulos metacromáticos, flagelos, cápsulas, esporas, membranas.  METODOS  METODOS DE DE TINCION TINCION SIMPLE: SIMPLE: Tenemos el método de Violeta de Genciana, el de Azul de Metileno, el de Fucsina  fenicada  fenicada básica, básica, y el Azul Azul de Metilen Metilenoo alcalino alcalino de Loeffler. Loeffler.  METODOS  METODOS DE DE TINCION TINCION COMPUEST COMPUESTA: A: Tenemos el método de Gram, el método de Preston-Morrel, el método de Ziehl Neelsen,  Neelsen, el método método de Kinyoun, Kinyoun, método método Albert.  METODOS  METODOS DE DE TINCION TINCIONES ES ESPECIAL ESPECIALES: ES:  Método  Método de Wirtz-Conkl Wirtz-Conklin, in, método método de Tinta Tinta China, China, método método de Hiss, método método de tinción de Fontana tribondeau, método de Fleming-modificado, F leming-modificado, método de Leifson ;rojo congo para leptopiras.  MATERIALE  MATERIALES  S  - Colorantes. - Láminas porta objetos. - Laminillas cubre objetos. - Medios de cultivos con colonias bacterianas. - Papel filtro. - Vaso de Coplín. - Pinza porta lámina. - Asa de inoculación. - Tubo de ensayo con solución salina. - Tinta china. - Mechero - Reactivos. - Microscopio. - Tubera.  METODO  METODO DE DE VIOLETA VIOLETA DE GENCIA GENCIANA: NA: TECNICA: 40 41 1.- Realizar un frotis y cubrir la preparación con violeta de genciana por un minuto, lavar con agua destilada, luego de secar al medio ambiente o con papel filtro y queda lista para ser observada con objetivo de inmersión.  Las Bacteria Bacteriass con este método método se van a observar observar en en el microsc microscopio opio de color color violeta violeta o morada.  METODO  METODO DE DE AZUL AZUL DE METILENO METILENO:: TECNICA: 1.- Realizar un frotis y cubrir la preparación con azul de metileno durante un minuto, lavar con agua agua destilada, luego secar al medio ambiente o con papel filtro y queda lista para ser observada con el lente de inmersión.  Las Bacteria Bacteriass con éste método método se van a observar observar de de color color azul. azul.  METODO  METODO DE DE FUCSINA FUCSINA FENICADA FENICADA BASICA: BASICA: TECNICA: 1.- Realizar un frotis y cubrir la la preparación con fucsina fenicada basica durante un minuto lavar con agua destilada, luego secar al medio ambiente o con papel   filtro y queda lista para para ser ser observada observada con el lente de inmersión inmersión..  Las Bacteria Bacteriass con éste método método se van a observar observar de de color color rosado rosado  METODO  METODO DE DE AZUL AZUL DE METILENO METILENO ALCALINO ALCALINO DE LOEFLE LOEFLER: R: TECNICA: 1.- Realizar un frotis y cubrir la preparación con azul de metileno alcalino de  Loffler  Loffler durante durante un un minuto, minuto, lavar con agua agua destila destilada, da, luego luego secar secar al al medio medio ambiente ambiente o con papel filtro y queda lista para ser observada con el lente de inmersión.  Las Bacteria Bacteriass con éste método método se van a teñir teñir de color color azul, azul, es importante importante señalar  que con éste método se tiñe bien el bacilo DIFTERICO, las granulaciomnes metacromáticas del bacilo se observan en el microscopio de una coloración azul  oscuro y el cuerpo del bacilo en un azul pálido.  METODO  METODO DE DE GRAM. GRAM. 1.- Realizar un frotis y cubrir la preparación con violeta de genciana durante un minuto luego lavar con agua. 2.- Cubrir la preparación con Licor de Gram que actúa como mordiente, mordiente, durante un minuto, luego lavar con agua. 3.- Decolorar la preparación con alcohol 70° ó alcohol cetona hasta eliminar el  exceso de violeta genciana, luego lavar. 4.- Cubrir el frotis con fuscina fenicada o safranina; si se usa fuscina fenicada diez  segundos  segundos es suficiente, suficiente, si si se utiliza utiliza safranina safranina de de 30 a 60 segund segundos. os. Luego Luego lavamo lavamoss con agua secamos con papel filtro y queda lista para ser observada con el lente de inmersión .  Las Bacteria Bacteriass que aparecen aparecen teñidas teñidas de un color MORADO MORADO se denomina denominann GRAM  GRAM   POSITIVAS,  POSITIVAS, es decir decir han captado captado el colorante colorante de violeta violeta de gencian gencianaa y no han sido 41 42 decoloradas por el alcohol. Las Bacterias que aparecen teñidas de color ROSADO ROSADO  se denomina denominann GRAM GRAM NEGATI NEGATIVAS, VAS, es decir decir que no han fijado el violeta violeta de  genciana,  genciana, siendo decoloradas decoloradas por el alcohol alcohol y en en cambio cambio han han captado captado la safranina safranina o la fucsina fenicada dependiendo del colorante que se haya utilizado.  METODO  METODO DE DE ZIEHL-NEEL ZIEHL-NEELSEN: SEN: TECNICA: 1.- Realizar un frotis, cubrirlo con papel filtro y luego colocar fucsina. Calentar en el mechero la lámina portaobjeto durante 5 minutos, separándola cada vez que emita vapores, luego lavar con agua. 2.- Decolorar el frotis hasta eliminar el exceso de fuscina fenicada con alcohol  ácido unos segundos lavar con agua luego. Cubrir elfrotis con azul de metileno metileno un minuto. Lavar con agua, secar con papel   filtro y queda listo para para observa observarr con el lente lente de inmersión. inmersión.  Los bacilos bacilos tuberculoso tuberculososs y leprosos leprosos denominado denominadoss alcoholalcohol-ácido ácidoresiste resistente nte (por  (por  resistir la decoloración con el alcohol y el ácido), se tiñen de color rojo , es decir  han captado la fuscina fenicada. Estos bacilos resaltan su coloración roja sobre el   fondo azul oscuro oscuro el azul metileno; metileno; ambos bacilos bacilos aparecen aparecen como bastones bastones finos finos rectos y ligeramente curvos.  En conclusió conclusión, n, las las Bacterias Bacterias que se se observan observan de de color color rojo se denomina denominarán rán alcohol  alcohol  ácidos resistentes y las que se observan de color azul no ácido resistentes.  METODO  METODO DE DE ALBERT. ALBERT. TECNICA: 1.- Realizar un frotis, cubrir la preparación con colorante de Albert durante cuatro minutos luego lavar con agua. 2.- Cubrir el frotis con lugol durante dos minutos, luego lavar lavar con agua, secar con  papel filtro y queda queda lista lista para para la observación observación con el el objetivo objetivo de inmersión inmersión.. Si bien es cierto este método es compuesto por haberse utilizado mas de un colorante no es menos cierto que también podrían encasillarse dentro de los métodos de tinciones especiales ya que con este método podemos observar las  granulacion  granulaciones es metacro metacromátic máticas as del del bacilo bacilo diftérico diftérico las mismas mismas que se observa de una coloración verde oscura y su cuerpo de una coloración verde pálida. Cuando la bacteria teñida no es el diftérico no se observará estas granulaciones granulaciones y únicamente nos limitaremos a ver las Bacterias teñidas de color verde.  METODO  METODO DE DE PRESTON PRESTON-MORR -MORREL. EL. 42 43 TECNICA: 1.- Cubrir la preparación con oxalato de cristal violeta 30 segundos lavar con yodo lugol durante 30 segundos. 2.- Lavar yodo acetona durante 30 segundos. 3.- Lavar con agua unos segundos. 4.- Cubrir la preparación con carbolfucsina diluida 30 segundos se lava con agua  y se seca seca queda queda lista lista para para la observación observación con objetiv objetivoo de inmersión. inmersión.  Este método método es una variante variante de la tinción tinción de Gram, Gram, nos nos da un mejor mejor contras contraste te para para la placa de control. TINCION DE KINYOUN. TECNICA: 1.- Extraer y secar la preparación 2.- Fijar con alcohol metílico de 99° hasta la evaporación del mismo. 3.- Cubrir la preparación con la solución de fucsina y dejar actuar 2 minutos. No es necesario calentar. 4.- Lavar con agua. 5.- Decolorar con la mezcla ácido-alcohol hasta que no se desprenda mas colorante. 6.- Lavar con agua. 7.- Cubrir la preparación con azul de metileno y dejar actuar de 20a 30 segundos. 8.- Lavar con agua. 9.- Secar y observar con el objetivo de inmersión.  Los microor microorganis ganismos mos ácidoácido-alcoho alcoholl resistente resistentess se colorea coloreann de rosa los los que no, se observan de color azul.  METODOS DE TINCIONES TINCIONES ESPECIALES   METODO  METODO DE DE WIRTZ WIRTZ CONKLIN CONKLIN:: (ESPORAS). (ESPORAS). TECNICA: 1.- Haga una suspensión de los organismos en 0,25 ml. de agua destilada. 2.- Haga un frotis delgado con esta suspensión y fíjelo a la llama. llama. 3.- Cubra el frotis con una solución acuosa con el 5% de verde malaquita y calientelo hasta emitir vapores de 3 a 6 minutos. 4.- Lave con agua destilada. 5.- Tiña con una solución acuosa al 5% 5% de safranina por 1 minuto 6.- Lave con agua destilada. 7.- Seque y examine.  Las esporas esporas se tiñe de verde, verde, el cuerpo cuerpo de la la bacteria bacteria es rosado. rosado.  METODO  METODO DE DE TINTA TINTA CHINA CHINA (CAPSUL (CAPSULAS). AS). TECNICA: 1.- Realizar un frotis y fijarlo. 43 44 2.-Depositar sobre el frotis seco y fijado una gota de tinta china y extenderlo con laminilla. 3.- Dejar secar. 4.- Colocar safranina durante 1 minuto. 5.- Lavar con agua y observar con el lente inmersión. La cápsula aparece como espacio claro alrededor del cuerpo bacteriano que se tiñe de rojo pálido sobre un  fondo negro dado por la tinta china. china.  METODO  METODO DE DE HISS (CAPSULAS): (CAPSULAS): TECNICA: 1.- Mezcle el material a ser teñido con igual cantidad de suero. Haga un frotis delgado. 2.- Déjelo secar al aire. 3.- Fíjelo ya sea a la llama o en formalina comercial diluida al 10% (1:10). 4.- Cubra el frotis con el colorante de Hiss o con solución acuosa al 1% de cristal  violeta hasta emitir vapores por unos pocos segundos. 5.- Lave el colorante con una solución acuosa al 20% de sulfato de cobre. 6.- Seque al aire y examine.  El cuerpo cuerpo bacteri bacteriano,cé ano,células lulas y fondo fondo de la preparaci preparación ón se tiñen de púrpura. púrpura.  Las cápsula cápsulass son incoloras incoloras o lavanda lavanda pálida. pálida. TINCION DE PARED CELULAR. 1.- Se utiliza cultivos jóvenes de 18 a 20 horas de B. subtilis. 2.- Realizar un frotis grueso, con el frotis húmedo se coloca el ácido fosfomolíbdico 1% por 4 minutos. 3.- Escurrir el ácido fosfomolíbdico y agregar verde de metilo 1% por 5 minutos. 4.- Lavar.  Este método método se fundament fundamentaa en que el el ácido ácido fosfomolí fosfomolíbdico bdico hidroliza hidroliza el el citoplasma citoplasma,,  pero respeta respeta la pared pared que que aparece aparece de de color color verde. verde.  METODO  METODO DE DE FLEMING FLEMING MODIFICAD MODIFICADO. O. (ESPORA (ESPORAS): S): 1.- Carbol fucsina de Ziehl - 5 minutos calentando. 2.- Lavar. 3.- Decolorar con etanol 30 segundos. 4.- Lavar. 5.- Extendido de una gota de tinta china y dejar secar.  Es importan importante te reconoce reconocerr que cuando cuando no se usa métodos métodos especiales especiales de de tinción tinción de de esporas y se utiliza el método de Gram las esporas aparecen como un espacio claro no teñido y el cuerpo de la bacteria de color violeta. TINCION DE FONTANA TRIBAONDEAU. TRIBAONDEAU. (FLAGELOS): ( FLAGELOS): 44 45  Es una coloración coloración de impregna impregnación ción argéntica argéntica que permite permite la observaci observación ón de ciertos ciertos microorganismos (espiroquetas) o de estructuras muy finas (flagelos). TECNICA: 1.- Extraer y secar a temperatura ambiente. 2.- - Cubrir la preparación con el fijador y dejar actuar 90 segundos. 3.- Lavar con alcohol etílico de 95°. 4.- Cubrir la preparación con el mordiente, calentando hasta el desprendimiento de vapores y dejar actuar durante 30 segundos. 5.-- Lavar con agua. 6.- Cubrir la preparación con solución de nitrato de plata, calentando hasta el  desprendimiento de vapores . Mantenerlo de 15 a 20 segundos. 7.-- Lavar con agua. 8.-- Secar a temperatura ambiente y observar con objetivo de inmersión.  Las espiroqu espiroquetas etas se observan observan de color color castaño. castaño. TINCION DE LEIFSON: (FLAGELOS):  Para realizar realizar la tinción tinción de de flagelos flagelos se se debe partir de un cultivo cultivo líquido líquido adecua adecuado do de de 18 a 24 horas, incubado a temperatura ambiente.  REACTIVOS  REACTIVOS::  Preparar  Preparar tres soluciones soluciones por por separado. separado. a.- Cloruro sódico: 1,5g.  Agua destilada destilada 10ml. 10ml. b.- Acido tánico 10g.  Agua destilada destilada 100ml. 100ml. c.- Acetato de p-rosanilina 0,9g.  p-rosanilina  p-rosanilina ClH: 0,3 g. g.  Alcohol  Alcohol etílico etílico de de 95 °: 100ml. 100ml.  Dejar en reposo reposo 12 horas a temperatu temperatura ra ambiente ambiente.. Tomar Tomar volúme volúmenes nes iguales iguales de A,  B, C, agitar y dejar dejar 2 horas horas en reposo. reposo. TECNICA: 1.- Sobre 4 ml de cultivo añadir 0,25 ml de formol al 5%. 2.- Dejar reposar 15 minutos. 3.- Añadir agua destilada mezcla y centrifugar retirando el sobrenadante. Repetir 2 veces.. 4.- Resuspender en 1-2 ml. de agua destilada debe quedar suspensión bacteriana ligeramente turbia. 5.- Flamear un portaobjeto limpio y dejar enfriar. 6.- Depositar unas gotas de la suspensión , con asa o pipeta, en un extremo del   portaobjetos  portaobjetos inclinado, inclinado, de forma forma que que las gotas se extiendan extiendan a lo largo largo del del cristal. cristal. 45 46 7.- Dejar secar a temperatura ambiente y no fijar por el calor. 8.- Cubrir la preparación con 1 ml. de colorante. 9.- Dejar de 5 a 15 minutos hasta que el alcohol se evapore. 10- Una vez formado el precipitado lavar con agua. 11.- Secar a temperatura ambiente y observar con objetivo de inmersión.  Los flagelos flagelos se tiñen tiñen de color rojo oscuro o azul negro.  Además de este este método, método, tenemos tenemos el método método de Gray Gray que también también sirve sirve para para teñir  teñir   flagelos.  flagelos. VENTAJAS Y DESVENTAJAS.  Las ventajas ventajas de los métodos métodos de tinción tinción escriba en que podemos podemos observar observar algunas algunas estructuras de las Bacterias que no podían ser observadas en la observación en  fresco, es así como un método método univer universal sal de Gram podemos podemos determinar determinar rápidamente rápidamente  si una bacteria bacteria es Gram positiva positiva o Gram negativa. negativa. Con Con el método método de Zielh-Neelsen Zielh-Neelsen  podíamos  podíamos determ determinar inar si si una bacteria bacteria era ácido resistente resistente o no y si queremos queremos ir más adelante nos hemos dado cuenta que con los métodos de tinciones especiales  podemos  podemos observar observar en el microscopio microscopio estructuras estructuras como como cápsulas, cápsulas, esporas, esporas, pared,  flagelos  flagelos gránulos gránulos .  Las desventa desventajas jas serían serían que no no observamo observamoss a la la bacteria bacteria viva y que con con los colorantes las Bacterias podrían sufrir una discreta deformación de sus estructuras.  RESTRICCIO  RESTRICCIONES  NES   La mayoría mayoría de los métodos métodos de tinción tinción aquí aquí estudiado estudiados, s, año año a año año se han venido venido realizando en la práctica de bacteriología. Lo ideal sería que todos los métodos sean estudiados, pero ésto no ha sido posible debido a la carencia de colorantes y reactivos en el departamento de bacteriología. En otros casos, como en el de la tinción de flagelos que se necesita de un mayor tiempo para la preparación de la tinción. Pero ésto no sería inconveniente si nosotros con antelación a la práctica llevamos preparado parte del material.  AUTOR:DR  AUTOR:DR GONZALO GONZALO ZABALA ZABALA VILLACIS  VILLACIS  46 47  MEDIOS DE CULTIVO CULTIVO DE USO FRECUENTE EN   BACTERIOLOGIA  BACTERIOLOGIA OBJETIVO ESPECIFICO DE LA CLASE  1.- Al final de la clase el alumno estará en la capacidad de DISTINGUIR los diferentes medios de cultivos por sus nombres. 2.- Estará en capacidad de EXPLICAR los usos de los medios de cultivo. 3.- Estará en capacidad de SELECCIONAR el medio de cultivo de acuerdo a la especie bacteriana a cultivarse. 4.- Estará en capacidad de VALORAR la importancia de los medios de cultivo y su utilidad en la industria o fabricación de antibióticos, vacunas, etc. CONCEPTO DE MEDIOS DE CULTIVOS.Se denomina medios de cultivos a las sustancias o mezcla de  sustancias  sustancias que que proporci proporcionan onan en forma forma asimila asimilable ble todo todo los los elementos elementos necesarios para que las Bacterias puedan crecer y multiplicarse dando dando lugar a la formación de colonias. CONDICIONES CONDICIONES O FACTORES FACTORES QUE DEBEN DEBEN REUNIR REUNIR UN MEDIO  DE CULTIV CULTIVO.O. El desarrollo desarrollo de una bacteria bacteria en un medio medio de cultivo cultivo depend dependee de una serie de factores o condiciones, las principales son: a.-CONTENIDO NUTRITIVO ADECUADO ( Composición Composición ). Es decir decir los elementos elementos indispensabl indispensables es para para que las Bacteria Bacteriass  puedan desarrollar desarrollar y multiplica multiplicarse. rse. Al respecto respecto las las necesidad necesidades es de las  Bacterias  Bacterias son son extremada extremadamente mente variables. variables. Como principales principales nutrien nutrientes tes se  pueden mencionar mencionar los siguient siguientes: es: - FUENTES DE CARBONO.Como los azúcares, ácido acético,de echo el Carbono es necesario para todas las Bacterias ( ninguna puede multiplicarse desprovista de CO2). - FUENTES DE NITROGENO.Como los nitratos y sales de amonio. - FUENTES DE AZUFRE. Prácticamen  Prácticamente te todos todos los los microorgan microorganismos ismos,, utilizan utilizan el azufre azufre de los  sulfatos,  sulfatos, sulfuros sulfuros y tiosulfato tiosulfatoss - FUENTES DE FOSFORO.Todas la Bacterias utilizan el fósforo de los fosfatos. - FUENTES DE OXIGENO E HIDROGENO. Procedentes  Procedentes del agua.agua.- Minerales Minerales como Potasio, Potasio, Magnesi Magnesio, o, Calcio, Calcio,  Hierro,  Hierro, Zinc, Zinc, Cobalto, Cobalto, Cobre,etc. Cobre,etc. 47 48 Otras sustancias importantes son las denominadas factores de crecimiento que están constituida por las vitaminas (A, B, C, D,) y principalmente los aminoácidos y las bases púricas y pirimidínicas. Son sustancias, que las  Bacterias,  Bacterias, por por sí solas solas son son incapaces incapaces de sintetiza sintetizar. r. b.- pH. Las Bacteria Bacteriass se desarro desarrollan llan habitualmen habitualmente te a pH próximo próximo a la neutral neutralidad  idad  (6.8 a 7.6) salvo excepciones, porque algunas Bacterias pueden crecer a  pH muy muy ácidos ácidos o muy alcali alcalinos. nos. Para Para ajustar ajustar el pH de los los medios medios se utiliza sobretodo sustancias indicadoras o bien en comparación con una  serie de de soluciones soluciones patrón de un indicador indicador coloreado coloreado c.- PRESION OSMOTICA. Debido a la compos composición ición de la pared celular celular bacterian bacterianaa los gérmenes gérmenes se adaptan bien a las variaciones de la presión osmótica, sin embargo “in vitro”, los medios de cultivo se preparan en condiciones de isotonía. d.- EL POTENCIAL REDOX. Está en en relación relación con el tipo respira respiratorio torio de cada cada bacteria, bacteria, que puede puede ser  anaerobia estricta, aerobia y anaerobia facultativa, aerobia estricta y microaerófila. e.- LA HIDRATACION. La presencia presencia del agua agua es indispensab indispensable le para para el crecimiento crecimiento bacteriano bacteriano  por lo que deberá deberá estar present presentee en los los medios medios de de cultivo cultivo en en cantidade cantidadess  suficientes.  suficientes.  f.- LA TEMPERATU TEMPERATURA.RA. En caso caso de las Bacterias Bacterias los medios medios de los cultivos cultivos se incuba incuba de 35 -37 °C. °C.  g.- LA ATMOSFER ATMOSFERA.A. Algunas  Algunas Bacterias Bacterias,, especialme especialmente nte aerobia aerobiass y faculta facultativas, tivas, necesitan necesitan para para  su óptimo óptimo desarrollo desarrollo la presencia presencia de ciertos ciertos ambientes ambientes gaseosos. gaseosos. El mas utilizado es el CO2 que varían del 3 - 10% h.- DEBEN SER DISTRIBUIDOS EN RECIPIENTES. Adecuados  Adecuados en los cuales cuales son esterili esterilizados zados y mantenid mantenidos os al abrigo abrigo de contaminaciones externas tanto antes de sembrados como en lo posterior.  PRINCIPAL  PRINCIPALES ES OBJETIV OBJETIVOS OS DE UN MEDIO MEDIO DE CULTIV CULTIVO O a.a.- Obtener cultivos puros para estudiar las Bacterias y mantenerla viva inde indefi fini nida dame ment nte. e. Excep Excepto to algu alguna nass raras raras exce excepc pcio ione nes, s, todo todo exam examen en bacteriológi bacteriológico co debe debe terminar terminar con el cultivo cultivo del producto producto a examinar. examinar.  Efectivamen  Efectivamente, te, este este cultivo cultivo es es a 48 49 menudo necesario para la evidencia de Bacterias (siempre que su número  sea demasiad demasiadoo pequeño pequeño para que podamos podamos descubrirla descubrirla por el simple simple examen microscópico). b.b.- Facilitar el hallazgo, aislamiento y separación de las distintas especies bacterianas presentes en un producto patológico. c.- Observar el aspecto de las colonias a simple vista o con pequeños aumentos (lupa) con diagnósticos. d.- Obtener Obtener cantidades cantidades apreciables apreciables de Bacterias Bacterias para fines industriales, industriales, como en la elaboración de vacunas y autovacunas. e.- Estudiar la fisiología de la bacteria.  f.- Estudiar la toxigénesis y las cualidades de las toxinas.  g. g.- Es ne nece cesa sari rioo pa para ra los los estu estudi dios os co comp mple lem men enta tari rios os,, co como mo los los de  sensibilidad  sensibilidad de las Bacterias Bacterias a los distintos distintos antibiótico antibióticoss (antibiog (antibiogramas ramas). ). CLASIFICACION DE LOS MEDIOS DE CULTIVO  Debido a la aparici aparición ón de nuevos nuevos medios medios de cultivo, cultivo, cada cada día se torna torna mas difícil encasillarlos dentro de las clasificaciones tradicionales, por lo tanto nos limitaremos a mencionar muy someramente las definiciones que  se han dado a ciertos ciertos grupos grupos de de medios medios de de cultivos. cultivos. 1.- DE ACUERDO A SU PROCEDENCIA O PREPARACION.PREPARACION. a.- MEDIOS NATURALES O EMPIRICOS.Son aquellos que están constituidos por sustancias o productos naturales ya sea de origen animal o vegetal, es decir que no han sido creados artificialmente por el hombre. Ejemplo: gelatina, huevo, leche,  papa, levadura, levadura, sueros, sueros, líquido líquido ascítico, ascítico, pleural, pleural, sinovial, sinovial, peritoneal. peritoneal. b.- MEDIOS ARTIFICALES.Son aquellos elaborados por el hombre, que contiene químicas de la naturaleza y proporciones conocidas, junto a productos de origen natural.  Actualmente  Actualmente son los los mas utilizados. utilizados. En el comercio comercio existen existen infinidad infinidad de medios de cultivo deshidratados que facilitan en gran manera la labor de los laboratorios de Microbiología y que garantizan una buena calidad de  funcionami  funcionamiento. ento. 2.-DE ACUERDO A CONSISTENCIA O ESTADO FISICO.a.- MEDIOS LIQUIDOS  ,como los caldos:N caldos:Nutriti utritivo,tio vo,tioglico glicolato lato etc. b.- MEDIOS SEMISOLIDOS.49 50 Son aquellos que cumplen poca cantidad de agar agar 5% y que generalmente  se utilizan utilizan para estudiar estudiar la movilidad movilidad de los microorganis microorganismos mos o para estudios zimográficos, o para su conservación , Ejemplo: agar motilidad,  Medio de Flecher, Flecher, etc. c.- MEDIOS SOLIDOS.Son agares, ejemplo: agar citrato, agar urea, agar bismuto, etc. 3.- DE ACUERDO A SU CALIDAD O SU UTILIZACION.a.- MEDIOS SELECTIVOS O INHIBITORIOS.Son aquellos en los que se desarrolla una especie bacteriana o un grupo de ellas, porque contienen sustancias que inhiben el desarrollo de las demás y que están presentes en la muestra. La selectividad del medio se consigue por la adición de sustancias como las sales biliares, que inhiben a las formas cocáce cocáceas as Gram+, Gram+, o la Azida sódica sódica,, que solo permite permite el  crecimiento de los cocos Gram+. Los antibióticos son otras sustancias que transforman los medios de cultivo en selectivos. b.-MEDIOS DIFERENCIALES O DE DIFERENCIACIO DIFERENCIACION.N.Son aquellos que se utilizan para poner de manifiesto a las Bacterias que dan positiva alguna propiedad bioquímica y que están presentes en la mezcla. Pueden tener indicadores del ph, entre las cuales tenemos el rojo  fenol y azul de bromo timol, los cuales cuales confieren confieren al medio de cultivo cultivo distintos colores según la reacción sea ácida o sea alcalina. La mayoría de los los med edio ioss de dest stin inad ados os a las las reac reacci cion ones es bioq bioquí uími mica cass de las las  Enterobacteri  Enterobacterias as son medios diferenciales diferenciales.. Ejemplo.: Ejemplo.: agar urea de Christiansen, agar citrato de Simmons, etc. c.- MEDIOS ENRIQUECIDOS.ENRIQUECIDOS.Son aquellos que favorecen el crecimiento de algún tipo de Bacterias que  se encuentran encuentran en forma minoritaria minoritaria en una mezcla de varios grupos bacter bac terian ianos. os. Son medios medios básale básaless a los que se les ha agregad agregadoo ciertos ciertos nutrientes como vitaminas, proteínas, sangre desfibrinada. Ejemplo.: agar   sangre,  sangre, agar chocolate, chocolate, agar Thayer Thayer Martín, Martín, agar agar Muller Muller Hinton, Hinton, etc . d.- MEDIOS DE ENRIQUECIMIENTO.Son aquellos medios de cultivo a los cuales se les ha añadido sustancias inhibitorias, lo que da como resultado medios de cultivo que permiten el  desarrollo de Bacterias, pero dentro de un estrecho margen. Ejemplo.: Caldo de Tetrationato, Caldo Selenito, Thayer Martin modificado,etc. e.-MEDIOS DE IDENTIFICACION.IDENTIFICACION.50 51 Son aquellos que se utilizan para estudiar la acción de un solo tipo de  Bacterias  Bacterias frente frente a un determina determinado do sustrato sustrato.. Se diferencia diferencia de de los Medios Medios  Diferenciale  Diferenciales, s, en que se siembran siembran con con Bacterias Bacterias pertenecient pertenecientes es a un un solo solo clon. Se utiliza para los estudios de identificación de las Bacterias.  f.- MEDIOS MEDIOS DE DE CULTIVO CULTIVO BASICOS.BASICOS.Son aquellos medios cuya fórmula contiene los nutrientes necesarios para el desarrollo de la mayoría de los microorganismos no fastidiosos, entre estos nutrientes tenemos: Infusión de carne, peptona, agua, sal,etc.  Ejemplo:  Ejemplo: Caldo Caldo nutritivo, nutritivo, Caldo de peptona, peptona, Caldo de triptona triptona de soya, soya, agar nutritivo inclinado, agar nutritivo en base profunda.  g.- MEDIO MEDIOS S DE MULTIP MULTIPLICAC LICACION. ION.-Son aquellos que poseen una composición composición determinada y óptima para el   grupo de Bacterias Bacterias a las que va destinado, destinado, y que permitirá permitirá un máximo máximo de aumento celular bacteriano en un mínimo tiempo. Son medios utilizados en la industria, en la preparación de vacunas, de antibióticos, etc. h.- MEDIOS DE CONSERVACION.CONSERVACION.Son aquellos cuya composición favorecen el mantenimiento de los microorganismos que en él se siembran y que posteriormente se incuban a +2, +4 °C. Algunos medios de conservación incluyen glicerol y se  guardan  guardan en congelador congelador a -20 °C. Estos Estos medios medios de conserva conservación ción han sido sido  prácticamen  prácticamente te desplaza desplazados dos por por la liofilización liofilización..  Existe una variació variaciónn de medios medios de conserv conservación ación que son son los MEDIOS MEDIOS DE  DE  TRANSPORTE, cuya finalidad es mantener en estado viable, aunque sin  producción  producción ( o mínima mínimamente mente), ), microor microorganism ganismos os presentes presentes en una una muestra, permitiendo con posterioridad recuperar incluso a los que están minoritariamente presentes. Actualmente los medios de transporte utilizados son: el medio de Stuart, el de Amies y el medio de Cary-Blair.  PRINCIPAL  PRINCIPALES ES MEDIO MEDIOS S DE CULTIV CULTIVO O UTILIZAD UTILIZADOS OS EN  EN   BACTERIO  BACTERIOLOG LOGIA. IA. CALDO NUTRITIVO.Son medios de cultivo líquidos constituidos por agua, peptona y extracto de ca carn rne. e. Sirv Sirvee pa para ra el cu cult ltiv ivoo de micr microo oorg rgan anis ism mos de esca escaso soss requerimientos nutricionales; tales como la E.coli, estafilococos. 51 52  AGARES  AGARES NUTRITIVO NUTRITIVOS.S.Sonn ca So cald ldos os nu nutr trit itiv ivos os a los los qu quee se les les ha ag agre rega gado do ag agar ar pa para ra su  solidificaci  solidificación. ón. Contiene Contiene cloruro cloruro de sodio. Pueden Pueden ser utilizados utilizados para el  cultivo cultivo de microorganismo microorganismoss de escasos requerimien requerimientos tos nutritivos, nutritivos, para  pruebas  pruebas de hemólisis hemólisis cuando cuando se emplea emplea adicionado adicionado de sangre, sangre, puede  servir para el el cultivo cultivo y recuento recuento de microorgani microorganismos smos en las aguas, aguas, heces heces u orina y cualquier otro producto. Ejemplo.:Tenemos el agar nutritivo inclinado y el agar nutritivo profundo.  AGAR  AGAR SANGRE.SANGRE. El agar sangre es un medio enriquecido enriquecido sólido que nos permite permite ver las  propiedades  propiedades hemolíticas hemolíticas de ciertas ciertas Bacterias Bacterias tales como Estreptococos Estreptococos,,  Estafilococo  Estafilococos, s, de diversos diversos materiales. materiales. El agar sangre se puede preparar  con sangre desfibrinada de conejo o de borrego adicionada a un agar que contenga infusión de carne. Este agar contiene de 5 al 10% de sangre estéril.  AGAR  AGAR T.S.I..T.S.I..- (KLIGER (KLIGER MODIF MODIFICADO ICADO).). Es un medio sólido diferencial diferencial que se recomienda recomienda para la identificac identificación ión de los bacilos entéricos Gram negativos en base a la fermentación de dextrosa, lactosa y sucrosa, y por la producción de Sulfuro de Hidrógeno que los utiliza en los coprocultivos.  AGAR  AGAR S. S. . El agar S. S. es un medio diferencial diferencial y selectivo selectivo utilizado utilizado para el  aislamiento de Salmonella y Shigellas a partir de heces y otros materiales en que se sospeche su presencia, además inhibe el desarrollo de todas las  Bacterias  Bacterias Gram(+) Gram(+) y algunas algunas Gram (-) no deseables, deseables, las mismas que están inhibidas por el verde brillante de las sales biliares y las elevadas concentraciones de tiosulfato y citrato.  AGAR  AGAR CITRATO CITRATO de de SIMMON SIMMONS.S. Es un medio diferencial diferencial empleado para la investigació investigaciónn de la utilización utilización del citrato como única fuente de Carbono, produciendo alcalinidad. Este medio es una modificación del de Koser, al cual se le ha agregado agar y un indicador del pH azul de bromo timol. Se lo emplea en los test  bioquímicos.  AGAR  AGAR UREA UREA DE CHRISTIANS CHRISTIANSEN.EN. Es un medio sólido diferencial diferencial empleado empleado para para la investigaci investigación ón de la  Bacterias  Bacterias que que utilizan utilizan urea como como única fuente de Nitrógeno Nitrógeno y  particularme  particularmente nte para diferen diferenciar ciar algunos algunos miembros miembros de la familia familia  Enterobacteri  Enterobacteriaceae aceae.. Se lo emplea emplea en los test test bioquímic bioquímicos. os.  AGAR  AGAR MAC CONKEY.CONKEY.52 53  Es un medio selectivo selectivo y diferen diferencial cial utilizado utilizado para para el cultivo cultivo de enterobacterias Gram (-) e impide el crecimiento de las bacterias Gram (+) que es inhibida por las sales biliares y por el cristal violeta que contiene. Se lo utiliza preferentemente en los urocultivos y coprocultivos donde abunda la flora Gram (-).  AGAR  AGAR BISMUTO BISMUTO SULFITO.SULFITO. Es un medio de cultivo cultivo sólido sólido selectivo selectivo que que sigue sigue especialm especialmente ente para el  aislamiento de Salmonella tifosa a partir de heces, en agua servidas, alimentos, etc. Se recomienda, en particular después de un enriquecimiento preliminar del espécimen en caldo de tetrationato u otro caldo de enriquecimiento. El efecto selectivo de este medio de basa en su contenido de verde brillante e inhibe ante todo el enriquecimiento de la  flora Gram (+) acompa acompañante ñante.. CALDO DE THIOGLICOLATO.THIOGLICOLATO. Es un medio de cultivo cultivo líquid líquidoo que se emplea emplea para para la multiplicac multiplicación ión y el  aislamiento de Bacterias anaerobias estrictas, facultativas y de gérmenes microaerófilos. También se los emplean para los test de esterilidad de ciertos productos biológicos. CALDO DE TETRATIONATO.TETRATIONATO. Es un medio enriquecido enriquecido por la adición adición de bilis de buey, buey, también también es  selectivo  selectivo porque porque se utiliza utiliza para para el crecimiento crecimiento de Salmone Salmonellas. llas. El verde verde brillante que entre en su composición inhibe la flora Gram (+). Se utiliza cuando la muestra es pobre en gérmenes tal como sucede en pacientes crónicos, convalecientes o portadores sanos.  AGAR  AGAR MOTILIDA MOTILIDAD.D. Es un medio semisólido semisólido y se emplea emplea para averigu averiguar ar la motilidad motilidad de las  Bacterias.  Bacterias. Es un medio medio diferen diferencial, cial, se lo emplea emplea en los test bioquím bioquímicos. icos.  AGAR  AGAR CHOCOLA CHOCOLATE.TE. Es un medio sólido especial, especial, utilizad utilizadoo para para el crecimi crecimiento ento de microorganismos exigentes como las neisserias patógenas (gonococo y meningococo). En este medio pueden efectuarse las siembras del líquido cefalorraquídeo y pus.  AGAR  AGAR TELURITO. TELURITO.- Es un medio de cultivo cultivo sólido sólido selectivo selectivo utilizado utilizado para la la diferencia diferenciación ción colonial de los tres tipos de bacilos diftérico: Mitis, Gravis e intermedius, a partir de exudados nasales y faringeos. Su contenido en telurito de  potasio  potasio permite, permite, en primera primera instancia instancia inhibir inhibir el desarrollo desarrollo de la flora contaminante.  MEDIO  MEDIO DE HUEVO HUEVO o de de PAI.PAI.53 54  Es un medio de cultivo cultivo sólido sólido selectivo selectivo emplead empleadoo para para el crecimiento crecimiento del  bacilo diftérico en general.  AGAR  AGAR CHAPMAN CHAPMAN o MANITOL MANITOL SALADO.SALADO. Es un medio de cultivo cultivo sólido sólido selectivo selectivo emplead empleadoo en el aislamien aislamiento to de de estafilococos basado en la tolerancia que poseen a una alta concentración de cloruro de sodio que al mismo tiempo inhibe el desarrollo de otros microorganismos.  MEDIO  MEDIO DE LOWENSTE LOWENSTEIN IN - JENSEN JENSEN.. Es un medio de cultivo cultivo sólido sólido selectivo selectivo emplead empleadoo universal universalmente mente para el  cultivo y el aislamiento de micobacterias, en especial M. tuberculosis.  Este medio medio debe conservarse conservarse en en tubos tubos hermética herméticamente mente cerrados cerrados y en refrigeración  MEDIO  MEDIO DE THAYER THAYER MARTIN. MARTIN.- Es un medio enriquecido enriquecido que permite permite el crecimient crecimientoo de cepas exigentes exigentes de de  Neisserias.  Neisserias.  AGUA  AGUA O CALDO CALDO DE PEPTO PEPTONA.NA. Es un medio líquido líquido diferenci diferencial; al; que que se utiliza para el cultivo cultivo de de enterobacterias para observar la producción producción de indol. se lo emplea en las reacciones bioquímicas . CALDO DE SELENITO F. Es un medio de cultivo cultivo selecti selectivo vo recomend recomendado ado para la la detección detección e identificación de Salmonellas en heces (Coprocultivos), alimentos,  productos  productos lácteos lácteos y otros materiales materiales de importan importancia cia sanitar sanitaria. ia.  AGAR  AGAR MULLER MULLER - HINTON.HINTON. Es un medio enriquecido enriquecido recomendado recomendado para el aislamien aislamiento to y cultivo, cultivo, en especial de la familia Neisseriaceae. Constituye un excelente medio para el diagnóstico precoz de los portadores de microorganismos rinofaríngeos. También se lo utiliza para la interpretación del Test de  sensibilidad  sensibilidad de las Bacterias Bacterias o los antibióti antibióticos. cos.  MEDIO  MEDIO DE LOEFLER. LOEFLER.- Es un medio altamente altamente nutritivo nutritivo recomendad recomendadoo universalme universalmente nte para el  cult cu ltiv ivoo y aisla aislami mien ento to de Co Cory ryne neba bact cter eriu ium m diph diphte teri riea eaee en exuda exudado do rinofaríngeos.  MEDIO  MEDIO DE BORDET BORDET - GENGO GENGOU.U. Es un medio enriquecido enriquecido con sangre que se utiliza utiliza para el diagnóstico diagnóstico bacteriológico de la Tosferina, es decir para el aislamiento de la Bordella  pertusis.  pertusis.  EUGON  EUGON AGAR AGAR o EXUB EXUBERAN ERANTE TE AGAR.AGAR.54 55  Es un medio enriquecido enriquecido muy adecuado adecuado para obtener obtener el desarrollo desarrollo exuberante de distintas bacterias de difícil crecimiento, como Hemophilus,  Neisseria,  Neisseria, Pasteurella, Pasteurella, Brucella Brucella y lactobacilo lactobacilos. s. Es muy utilizado utilizado en bacter bac teriol iologí ogíaa alimenti alimenticia cia para el control control de las carnes carnes y alimen alimentos tos.. También para la preparación de antígeno y vacunas.  AGAR  AGAR SENSIBILID SENSIBILIDAD.AD. Es un medio de enriquecimi enriquecimiento ento especial, especial, sólido que se envasa envasa en las cajas de Petri y se lo utiliza en las pruebas de sensibilidad in vitro, de las  Bacterias  Bacterias a los antibió antibióticos ticos (Antibiogram (Antibiogramas). as).  MEDIO  MEDIO DE STONBRIN STONBRINK.K. Medio recomendad recomendadoo para el aislamiento aislamiento de especies especies de Mycobacteri Mycobacterium um bovis, que no se desarrollan normalmente en Lowenstein - Jensen.  MEDIO  MEDIO DE TRANSPOR TRANSPORTE TE DE DE STUART.STUART. El medio de transporte transporte de Stuart, Stuart, originalmen originalmente te usado para facilitar facilitar el  transporte transporte de muestras muestras tomadas tomadas con hisopos hisopos para cultivar cultivar gonococos, gonococos,  puede ser también usado para llevar muestra con otros microorganismos microorganismos de distintos materiales (vías respiratorias, entéricos, etc.). Es un medio  semisólido  semisólido no nutritivo nutritivo que contiene contiene glicolato glicolato de sodio para suprimir  suprimir  cambios oxidativos y enzimáticos de las células. Este medio tiene la ventaja de mantener la vitalidad de todos los gérmenes aerobios o microaerófilos delicados.  AGAR  AGAR TCBS.TCBS.- (Agar (Agar de Tiosul Tiosulfato-ci fato-citrato trato-- bilis y sacarosa).sacarosa). El Agar TCBS es un medio selectivo selectivo que se utiliza para el cultivo cultivo y aisl aislam amie ient ntoo de dell Vibri Vibrioo ch chol oler erea eaee y otro otro vibr vibrio io en ente tero ropa pató tóge geno no.. Las Las concentraciones de tiosulfato, citrato y alcalinidad del medio inhiben el  crecimiento de otras enterobacterias presentes en las heces. La bilis y el  citrato disminuye el desarrollo de Proteus y enterococos favoreciendo el  de vibrio.  MEDIO  MEDIO DE CLED.CLED.- (cisteina(cisteina- lactosalactosa- electrolit electrolitoo deficiente). deficiente).- El Agar CLED es un medio no inhibidor, inhibidor, que ha sido adoptado adoptado univer universal salmen mente te para para efectu efectuar ar recuen recuento to de coloni colonias as y aislam aislamien iento to en bacteriología urinaria ya que permite el desarrollo de todos los patógenos urinarios y previene el desarrollo invasor (swarming) de Proteus sp. CONTROL DE CALIDAD DE LOS MEDIOS  Con los medios de cultivo se deben establecer tres tipos de control antes de considerarlos aptos para utilizar: CONTROL DE ESTERILIDAD.55 56 Se efectúa incubando algunas placas, escogidas del lote al azar durante 2 días a 35 °C y 5 días a temperatura ambiente. El resto de las placas se  guarda en refrigerado refrigeradorr a 4 °C, y solo se utiliza utiliza del del grupo grupo control control muestra muestra ausencia de cualquier tipo de crecimiento después de los 7 días. CONTROL DE CALIDAD.Se realiza para comprobar que el medio contiene aquellos componentes que le caracterizan. Para las comprobaciones se utilizan por lo menos dos  gérmenes  gérmenes distintos, distintos, uno que crece sobre el medio, medio, o da positiva positiva una determinada prueba, y otro que no crece, o da negativa. CONTROL DE CADUCIDAD. Para ponerlo ponerlo en práctica práctica es necesario necesario que en en el momento momento del del empaque empaque se rotule en algún lugar visible de la placa, la fecha de preparación, además el nombre del medio. De esta manera se podrá saber en todo momento el  tiempo que falta para llegar al límite de su utilización.  Hasta aquí el primer parcial.  REVISADO  REVISADO Y ACTUALIZ ACTUALIZADO ADO  DR EDUA EDUARDO RDO CHANCAY CHANCAY L.  Jefe de de la Cátedr Cátedraa de Bacteri Bacteriolog ología ía  Junio/2012  Junio/2012 56