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PROTEINA VERDE FLUORESCENTE

Historia

La proteína verde fluorescente (o GFP, por sus siglas en ingles, green fluorescent
protein) es una proteína producida por la medusa Aequorea victoria y fue aislada por
Osamu Shimomura y su equipo en 1962 a la que llamo aequorina, nombre derivado de
la medusa con la que trabajaban.

El investigador observo que una solución de GFP se veía verdosa bajo la luz del sol, se
tornaba amarillenta bajo una lámpara de tungsteno, y fluorescia con luz verde brillante
al ser irradiada con la luz UV.

Posteriormente, en 1971, este mismo grupo publicó el espectro de emisión de GFP con
su pico característico a 508 nm, notando que la bioluminiscencia verde del tejido vivo
de la medusa también tenía un pico a esa longitud de onda. La aequorina, proteína de A.
victoria a la que está asociada GFP, emite luz azul (470 nm), a una longitud de onda
cercana a la de excitación de GFP. De esto se postulo acertadamente que GFP convertía
la emisión azul de aequorina al brillo verde que presentan las células animales. En ese
mismo año Morin y Husting descubren el mismo fenómeno en los celenterados Obelia
(un hidroide) y Renilla, siendo los primeros en definir la “transferencia de energía
radiativa”, como el mecanismo de excitación de GFP in vivo. En 1974, se demostró que
la aequorina podía transferir eficientemente su energía luminosa a su compañera cuando
ambas proteínas estaban en contacto adsorbidas en un soporte cationico.

En 1978 se obtuvo la primera estimulación, 27kDa, para la masa de GPF. Un año
después, por análisis de la proteína desnaturalizada, y de un fragmento proteolítico que
conservaba propiedades de absorbancia características, se determino que el cromoforo
de GPF es 4 – hidroxibencilideno – imidazolina – 5 – ona, y que este se encuentra unido
al esqueleto peptidico a través de las posiciones 1- y 2- del anillo. Esto fue confirmado
en 1996 por espectroscopia de masa. Aequorea y Renilla mostraron tener el mismo
cromoforo, sin embargo, la proteína de Renilla tiene un coeficiente de extinción
superior, mayor estabilidad conformacional frente a cambios en el pH y tendencia a
dimerizarse.

Pero los avances cruciales en esta historia tuvieron lugar con el clonado del gen de GFP,
la confirmación en 1992 que su expresión en otros organismos creaba fluorescencia, y
su síntesis in vitro en 1998. Comprobando así que el gen contenía toda la información
necesaria para la síntesis postraduccional del fluoroforo, y que ninguna enzima
especifica de la medusa era requerida para ello.

El 8 de octubre de 2008, los profesores Martin Chalfie (estadounidense), Osamu
Shimomura (japonés radicado en los Estados Unidos) y Roger Y. Tsien
(estadounidense) han sido galardonados por la Real Academia Sueca de Ciencias de
Estocolmo con el Premio Nobel de Química 2008 “por su descubrimiento y desarrollo
de la proteína fluorescente verde (GFP)”, herramienta indispensable para la biología y la
medicina modernas.


Estructura

La estructura de la proteína verde fluorescente se determino en 1996. Está constituida
por 238 aminoácidos, que forman once cadenas beta, cuyo conjunto forma un cilindro,
en el centro del cual se encuentra una hélice alfa.



















La secuencia de 238 aminoácidos de GFP, se conocen varias mutantes, cuyas
alteraciones influencian características específicas y algunas que han mejorado su
expresión, pero no modificar el comportamiento general de la proteína.























Otras apreciaciones

Las diferentes GFPs de distintos celenterados parecen ser compañeras de proteínas
quimioluminiscentes (emisores primarios) y ejercer el control de la emisión de luz in
vivo. Pero, aun no está aclarado (a) por que estos organismos brillan; (b) por que la
emisión de luz verde es preferida a la luz de los emisores primarios; y (c) por que la
mayoría de estos animales marinos sintetizan una proteína separada en vez de mutar la
proteína quimioluminiscente cambiando la longitud de su emisión.

Los emisores primarios parecen contener cofactores externos (lumazinas, flavinas,
peridinclorofila – a y otros cofactores tetrapirrolicos, etc.) como cromoforos, lo cual los
descarta como sondas o marcadores biotecnológicos, (a pesar de ser altamente
fluorescentes y atractivos pigmentos accesorios a larga longitud de onda). La correcta
inserción de todos estos cofactores en otros organismos no se ha logrado aun.

Las GFP tienen una admirable capacidad para sufrir transformaciones fotoquímicas, las
cuales posibilitan la visualización o el transporte de proteínas fusionadas o marcadas
con ellas.
Una zona definida de una célula o tejido puede momentáneamente exponerse a una
iluminación muy intensa y analizarse las reacciones fotoquímicas y las
fotoconversiones posteriores a la iluminación, que sufren las proteínas mediante la toma
de imágenes en el transcurso del tiempo.

Aplicaciones

Las propiedades luminosas se esta proteína, se han convertido en una de las
herramientas más usadas en la biociencia moderna y han hecho visibles procesos antes
desconocidos, como el desarrollo de las células nerviosas en el cerebro y la propagación
de células cancerígenas.

La observación del deterioro celular en pacientes con Alzheimer, de las células que
producen insulina en el páncreas y las bacterias patógenas son otros de los múltiples
usos de la GFP, que permitiendo además seguir los procesos intracelulares potencia el
desarrollo de medicamentos más efectivos y con menos efectos secundarios.

El uso de GFP está revolucionando la biología celular al permitir obtener datos sobre la
localización, dinámica y redes de interacción molecular de numerosas proteínas con una
gran resolución espacial y temporal. También sirven para monitorear cambios
bioquímicos dentro de las células.
También se utiliza esta proteína (GFP) para producir organismos transgénicos con
interés comercial; por ejemplo, el pez cebra modificado genéticamente que brilla en la
oscuridad.

Pero mas allá del arte-científico la proteína GFP y otros marcadores se han utilizado
para monitorear genes con interés y aplicación biotecnológica, como el mejoramiento de
plantas, hongos y bacterias con las técnicas de ingeniería genética con la finalidad de
obtener: mejoramiento de cultivos vegetales de importancia agronómica, producción de
vacunas y nuevos medicamentos, enzimas de aplicación industrial e inclusive
microorganismos y plantas para limpiar y recuperar el medio ambiente.


Investigaciones “iluminadas” con la proteína

Por tanto, además de premiar el descubrimiento, en esta ocasión la Academia Sueca ha
reconocido los trabajos posteriormente realizados con la ayuda de la GFP. En la
actualidad, y desde hace aproximadamente una década, es bastante corriente que los
expertos inyecten el gen que produce esta proteína para visualizar células. Gracias a
ello, se han podido observar procesos hasta ahora invisibles, como el desarrollo de las
células nerviosas o el movimiento de las células cancerosas. Los investigadores suelen
utilizar esta proteína como apoyo de sus estudios. Se trata de una herramienta de
trabajo, no de una terapia, con la que pueden valorar la eficacia de la inserción de otros
genes, como actúa un tratamiento a nivel biológico o como los vasos sanguíneos dan
soporte a ciertos tumores. Dentro de la neurobiología, en el estudio del cáncer y en la
biología en general es muy útil ya que permite visualizar el procedimiento biológico de
incorporación de genes. Un ejemplo de su uso es en el estudio de la angiogenesis. Hay
ratones transgénicos que tienen el endotelio de sus vasos marcados con esta proteína”, y
gracias a que sus venas y arterias presentan un tono fluorescente se puede evaluar los
procesos tumorales. El daño neuronal que sufren los pacientes de Alzheimer o la
creación de células productoras de insulina son otros de los destacados por la Fundación
Nobel y en los que la fluorescencia ha resultado esencial.

Por ejemplo, se puede observar la dinámica molecular de una proteasa (MT1 – MMP),
que desempeña un papel importante en la degradación de la matriz de los tejidos durante
la invasión tumoral. “La función de MT1 – MMP es clave para el desarrollo de
metástasis en cáncer y la utilización de GFP nos ha permitido desenmascarar el
mecanismo molecular responsable de la función pro-invasiva de esta molécula”. “En un
experimento espectacular, los investigadores fueron capaces de marcar distintas células
nerviosas en el cerebro de un ratón con un caleidoscopio de colores”, apunta la
Academia Sueca en un comunicado. No obstante, como resalta el científico del CNIC,
el potencial de esta herramienta está prácticamente sin explotar. “Sabemos dónde se
encuentran las proteínas pero no conocemos las secuencias reguladoras de la mayoría,
como se regulan, por que se expresan de una forma u otra… Hasta que no tengamos
más información de este tipo no podremos sacar más provecho de la GFP”.










Bibliografía




 www.wikipedia.com

 www.elmundo.es/elmundosalud/2008/10/08/biociencia/122345971
9.htm-52k-

 Otros enlaces web.