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41enero-junio de 2006 UNIVERSITAS SCIENTIARUM Revista de la Facultad de Ciencias Vol. 11, N° 1, 41-48 RECUPERACIÓN DE POLI- b -HIDROXIHEXANOATO-CO-OCTANOATO SINTETIZADO POR Pseudomonas putida MEDIANTE EL USO DE DISPERSIONESHIPOCLORITO-CLOROFORMO N. Moreno-Sarmiento 1 , D. Malagón-Romero 1 , J. Cortázar, A. Espinosa-Hernández 2, 1 Instituto de Biotecnología, Universidad Nacional de Colombia, A.A. 14490, Bogotá
[email protected] 2 Facultad de Ingeniería, RESUMENSe estandarizó una técnica de recuperación de poli-3-hidroxihexanoato-co-hidroxioctanoato a partir de P. putida . El método emplea dispersiones de hipoclorito de sodio-cloroformo para la digestión delmaterial celular y solubilización del polímero, respectivamente. Se evaluó el efecto de la concentración dehipoclorito, la temperatura y el tiempo sobre el porcentaje de recuperación, pureza, peso molecular ytemperatura de fusión. Las mejores condiciones para recuperar este polímero fueron: hipoclorito al5.25% (p/v) a 60°C durante 1 hora. Empleando estas condiciones fue posible mantener el peso molecularpor encima del 87% con respecto al obtenido mediante extracción con cloroformo. La temperatura defusión del polímero fue 57.7°C y 56.4°C para dos muestras al azar. La pureza del material recuperado esde 96%. Palabras clave: Pseudomonas putida , PHAs, biopolímero, recuperación.ABSTRACTA technique for the recovery of poly-3-hydroxyhexanoate-co-hydroxyoctanoate from Pseudomonas putida was developed. The method uses dispersions of sodium hypochlorite and chloroform for thedigestion of the cellular material and the solubilization of the polymer, respectively. The effects of thesodium hypochlorite concentration, the temperature and the time, on the recovery percentage, purity,molecular weight and melting point were evaluated. The best conditions for the recovery of the polymerwere: hypochlorite 5.25% (w/v) at 60°C for 1 hour. Under these conditions it was possible to maintain themolecular weight at above 87% of that obtained by chloroform extraction. The polymer melting pointwas 57.7 °C and 56.4 °C for two random samples. The purity of the recovered material was 96%. Key words: Biopolymer, PHAs, Pseudomonas putida , recovery. INTRODUCCIÓN Entre los polímeros que pueden ser sinteti-zados en la naturaleza los PHAs (poli- β -hidroxialcanoatos) surgen como candidatosexcelentes para remplazar los de srcenpetroquímico, por su similaridad con éstosy su facilidad para ser sintetizados a partirde sustratos económicos. Los PHAs sonpoliésteres de cadena lineal que presentanactividad óptica debido a la quiralidad delcarbono β o carbono 3 que hace al com-puesto perfectamente isotáctico. Dentrode la gama amplia de PHAs que se pue- 42Universitas Scientiarum Vol 11, N° 1, 41-48 den obtener, solamente tres han sidoproducidos con alta productividad:PHB (poli- β -hidroxibutirato), P(HB-co-HV) (poli- β -hidroxibutirato-co-valerato)yP(HHx-co-HO)poli- β -hidroxihexanoato-co-octanoato) (Hahn et al. , 1995). El géne-ro Pseudomonas sintetiza principalmenteeste último tipo de co-polímeros (Witholty De Koning, 1997).El PHO (poli- β -hidroxioctanoato) tiene unatemperatura de transición vítrea de -35°Cpor lo cual es un elastómero, amorfo y pega- joso a temperatura ambiente lo cual dificul-ta su procesamiento. Sin embargo, puede serusado como látex al ser muy estable debidoa que la densidad del polímero es muy cer-cana a la del agua (De Koning, 1995). Latemperatura de fusión reportada para losPHA mcl está entre 39°C y 61°C (De Koning,1995). El peso molecular depende de la fuen-te de carbono, el método de recuperación yla cepa empleada (Sasikala y Ramana,1995). Para P. putida el intervalo del pesomolecular en peso (M w ) está entre 130.000 y160.000 (Huijberts y Eggink, 1996).La mayoría de los métodos de recuperaciónde PHAs, reportados en la literatura, sonpara el PHB. Inicialmente se recuperaba consolventes clorados tales como cloruro demetileno, cloroformo, tricloroetano odicloroetano; sin embargo, ninguno de es-tos métodos es usado a nivel industrial, peroson técnicas comunes de laboratorio parala recuperación de PHAs (Ramsay, 2000).Uno de los inconvenientes que presentaeste método es la alta viscosidad de solu-ciones de PHB por encima del 5%(p/v) loque dificulta la eliminación de residuoscelulares. Aunque la mayoría del solventese recuperaba, los costos de recuperaciónresultaban demasiado altos para el proce-so. Una alternativa a este método es el usode enzimas, tales como lisozima, alcalasa yfosfolipasas combinadas con agentes conactividad superficial que degradan los com-ponentes celulares distintos al polímero.Una desventaja de este método es la purezabaja (cercana al 90% del material recupera-do) (Hahn et al., 1995).Hahn et al. (1995) muestra el empleo de hi-poclorito de sodio para la digestión de com-ponentes celulares distintos al polímero;sin embargo, el hipoclorito causa una dis-minución del peso molecular en peso delPHB hasta en un 50% comparado con laextracción con cloroformo. Para evitar esteproblema Kwang et al. (1994) y Hahn et al. (1995) han usado dispersiones de hipoclo-rito-cloroformo donde se busca que elhipoclorito libere el polímero mediante ladigestión de la membrana celular y demásorganelos celulares y el cloroformo solu-bilice los gránulos liberados protegiéndolosde la acción degradativa del hipoclorito.En este trabajo se establecen las condicio-nes para la recuperación del polímero acu-mulado en P. putida aislada de sueloscolombianos mediante dispersiones dehipoclorito-cloroformo. Pseudomonas putida es un micoorganismo que cumplecon las condiciones adecuadas para produ-cir PHAs con fines industriales, por lo cualse escogió para producir esta clase de ma-teriales, según lo planteado por Griffin(1994): habilidad de la cepa para usar unafuente de carbono económica, alta veloci-dad de crecimiento y síntesis de polímeroy alta acumulación de polímero. MATERIALES Y MÉTODOSMicroorganismo. Se empleó Pseudomo-nas putida aislada por el Centro de In-vestigaciones Microbiológicas de laUniversidad de los Andes (CIMIC) a partirde suelos colombianos. La cepa se conser-vó liofilizada y fue activada en caldo nu-tritivo y repicada a Agar nutritivo de dondese tomó la semilla para la fermentación. Medio de cultivo. El medio de cultivo es elempleado por Brandl et al (1988), el cual 43enero-junio de 2006 fue modificado en la concentración de lafuente de carbono ya que P. putida presen-ta inhibición por sustrato (ácido octanoico)como lo demostraron Suárez y Suárez(1997). La composición del medio es: áci-do octanoico 1g/l, (NH 4 ) 2 HPO 4 1.1 g/l,K 2 HPO 4 5.8 g/l, KH 2 PO 4 3.7 g/l, Solución100 mM de MgSO 4 10 ml/l y solución demicroelementos 1 ml/l. Condiciones de fermentación. Las fer-mentaciones necesarias para la produc-ción del biopolímero se realizaron en unfermentador SOVILAB con volumen deoperación de 3 l a 200 rpm, 26°C y 1.7 v.vmde aire durante 20 horas. Seguimiento de la fermentación. La semi-lla se tomó del medio sólido (agar nutriti-vo) y se pasó a un preinóculo (30 ml), sedejó en agitador orbital a 200 r.p.m. duran-te 12 horas a 25°C. De allí se pasó al inóculo(300 ml) y permaneció 8 horas en las mismascondiciones de agitación y temperatura.La fermentación fue monitoreada en su con-centración de biomasa mediante la medi-ción de absorbancia teniendo una curvapatrón que relaciona absorbancia y concen-tración. El espectrofotómetro usado fueVARIAN modelo DMS 100 a una longitudde onda de 450 nm usando como blancosolución salina isotónica estéril. Tambiénse hizo un seguimiento a la acumulaciónde polímero en las células mediante tincióncon sudán negro (Schlegel et al. , 1970).Una vez finalizada la fermentación labiomasa fue separada del medio de cultivomediante centrifugación en centrífugaSORVALL a 7200 X g durante 30 minutos.La biomasa fue separada del sobrenadantey resuspendida en solución Tris-HCl 0.01M a pH 7.0 y congelada a - 70°C. Labiomasa se liofilizó en un equipoLABCONCO modelo 77500-00 durante 72horas a una temperatura de -50°C y una pre-sión de vacío de 5 µ m de Hg. Recuperación del polímero Debido a que se usaron varios lotes de P. putida liofilizada se hizo necesario tenerun patrón de comparación entre cada unode los lotes. Se escogió la extracción concloroformo como patrón. De esta manera,cada resultado obtenido con la dispersiónhipoclorito-cloroformo se comparaba conel obtenido con cloroformo para el mismolote. Se realizó un diseño factorial para ladeterminación de la influencia del tiempo,concentración de hipoclorito y temperatu-ra en la recuperación del polímero tenien-do como variable de respuesta la relaciónporcentaje de acumulación del ensayo a por-centaje de acumulación con cloroformo.Inicialmente se determinó la relación pesode biomasa a volumen de dispersión;Kwang et al. (1994) y Hahn et al. (1995)muestran que el rango para dicha relaciónestá entre 0.01 y 0.04 g biomasa/ ml disper-sión. Con base en esta información se reali-zaron 4 ensayos preliminares evaluandodistintas relaciones: 0.01, 0.02, 0.03 y 0.04g células liofilizadas/ml dispersión. Fijadala relación anterior se examinaron 3 varia-bles (temperatura: 30 y 60°C; concentra-ción de hipoclorito: 5 y 14% (p/v); tiempo:30, 60, 90 minutos). Los ensayos de recu-peración se realizaron por duplicado bajoun diseño factorial.La biomasa se dejó en contacto con la dis-persión (50% v/v) en un balón de 100 mlcon agitación el tiempo según el ensayo. Secentrifugó en tubos de 50 ml a 10.000 X gdurante 10 minutos; una vez finalizó lacentrifugación, se retiraron la fase superiory la fase intermedia en la cual se hallan res-tos celulares. La fase orgánica se concentróen rotaevaporador a 70°C, sin vacío, hastaalcanzar un volumen cercano a 10 ml. Elpolímero se precipitó en metanol frío man-teniendo una relación 1/10 en volumen decloroformo a metanol. Se dejó decantar du-rante 12 horas a 4°C. Se desechó el sobre- 44Universitas Scientiarum Vol 11, N° 1, 41-48 nadante y el polímero obtenido se dejó se-car hasta alcanzar peso constante.Para la determinación de la pureza de lasmuestras, una vez obtenido el polímero sesolubilizó en cloroformo y se filtró a travésde membranas de acetato de celulosa (0.45 µ m) para retener las impurezas que puedatener el material. Se dejó secar la soluciónfiltrada a temperatura ambiente hasta alcan-zar peso constante. Evaluación de propiedades. El pesomolecular en peso (M w ) se determinó me-diante cromatografía de permeación en gel(GPC) en un equipo HPLC Waters 510Millipore usando dos columnas WaterStyragel HT4 y HT5 empacadas conestireno y divinilbenceno altamenteentrecruzados, colocadas en serie a 30°C ydetector de índice de refracción (IR) a 30°C.La fase móvil fue tetrahidrofurano con unflujo de 0.3 ml/min. Se utilizaron patronesde poliestireno monodispersos entre 2 x 10 4 y 1 x 10 6 de peso molecular.La temperatura de fusión se determinó me-diante calorimetría diferencial de barrido(DSC) en un equipo TA modelo 2100, enmodo estándar, con flujo de helio 20 cm 3 / min., una rampa de calentamiento de 10°C/ min entre 25 y 110°C.Una muestra de polímero recuperado sesometió a metanólisis siguiendo la meto-dología descrita por Braunegg et al. (1978)para obtener el metil-éster del polímero yser detectado mediante cromatografía degases en un equipo VARIAN 3400 usandouna columna DB-WAX semicapilar(15 m*0.53 mm*0.1µm) con un flujo dehelio de 10 ml/min. El programa de la co-lumna fue 1 min a 60°C y luego una rampade calentamiento de 15°C/min hasta 220°Cdonde permanece 1 minuto. Los están-dares externos empleados fueron ácido β -hidroxibutírico, β -hidroxihexanoato, β -hidroxioctanóico y β -hidroxidecanoatomarca SIGMA-ALDRICH; el estándar in-terno usado fue ácido ben-zocio marcaMERCK. RESULTADOS Y DISCUSIÓN Los ensayos realizados para determinar larelación biomasa a dispersión se presentanen la Tabla 1. En la relación de 25 ml dedispersión / g de biomasa, el volumen dedispersión fue muy pequeño y no alcanzóa entrar en contacto con toda la biomasa.En la relación de 75 ml de dispersión / g debiomasa la fase orgánica queda demasiadoviscosa, lo cual dificulta la filtración. En larelación 100 ml de dispersión / g debiomasa se obtiene la fase orgánica fácil-mente filtrable y la fase acuosa con pocosresiduos celulares. Con base en estos resul-tados se escogió la relación 100 ml de dis-persión / g de biomasa para la realizaciónde los demás ensayos. Con el fin de mante-ner la relación anterior, en todos los ensa-yos se usaron 0.5 g de biomasa liofilizaday 50 ml de dispersión (25 ml de hipocloritode sodio y 25 ml de cloroformo) y se varióla concentración de hipoclorito, la tempe-ratura y el tiempo. Tabla 1Relación volumen de dispersión a cantidad de biomasaVolumen de la dispersión aRendimientocantidad de biomasa (ml/g)(g de polímero recuperado / g biomasa) 1000.0894750.0416500.020025Imposible determinar 45enero-junio de 2006 La Tabla 2 presenta los resultados del aná-lisis de varianza obtenido para el diseñofactorial previsto, el valor de F calculadoes el obtenido para un nivel de confianzade 95%. En dicha tabla se ve que existeefecto significativo del tiempo, en tanto queno existe un efecto significativo de tempe-ratura y concentración.En cuanto a los efectos conjuntos (inte-racción de dos variables) se aprecia en laTabla 2 que es el par concentración-tiem-po el que tiene una mayor influencia sobreel rendimiento, en tanto que los otros parestemperatura-tiempo y temperatura-concen-tración no es significativa su influencia. Elefecto de la interacción de las tres varia-bles estudiadas resultó ser significativo.Hahn et al. (1995) reportan que en la medi-da que transcurre el tiempo se recupera máspolímero, pero se corre el riesgo que dismi-nuya el peso molecular. Con respecto a laconcentración de hipoclorito, dicho autorconcluye que a medida en que aumenta laconcentración aumenta el porcentaje de re-cuperación. Desafortunadamente no estu-dia una temperatura distinta a 30°C. Alcomparar los resultados presentados pordichos investigadores y el presente trabajose encuentran grandes similitudes: el tiem-po es fundamental en la recuperación depolímero pero también lo es la concentra-ción del hipoclorito; la temperatura no re-sulta ser significativa en la recuperación.La Figura 1 muestra que el porcentaje deacumulación resulta ser muy similar al ob-tenido mediante extracción con clorofor-mo y en algunos ensayos fue mayor, lo cuales un gran avance al disminuir el volumende solvente empleado y el tiempo de recu-peración frente al método de recuperacióncon cloroformo.F IGURA 1. Resultados de la recuperacióndel polímeros con dispersiones hipo-clorito-cloroformo. a) Concentración dehipoclorito 5% (p/v); b) concentración dehipoclorito 14% (p/v). Tabla 2Análisis de varianza Fuente deSuma deGrados deCuadradoFFvariacióncuadradoslibertadmediocalculadotabla Temperatura0.0001510.00150.054.75Concentración0.0048210.004821.674.75Tiempo0.4488020.2244078.053.89Temperatura-concentración0.0073510.007352.564.75Temperatura-tiempo0.0127720.006382.223.89Concentración-tiempo0.0462520.023158.043.89Temperatura-concentración-tiempo0.0299520.014975.203.89Error0.03450120.00287Total0.5845823 ab
