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Curso de Biologia Bioquímica 2012/2013
Polifenoloxidase Turma 10
Índice Índice............................................................................................................................... 2 Resumo............................................................................................................................ 3 Resultados....................................................................................................................... 4 Tabela 1 - Reação A – Ação da polifenoloxidase.........................................................4 Tabela 2 - Reação – !atu"e#a $u%mica da polifenoloxidase.....................................4 Tabela 3 - Reação & – 'speci(cidade pa"a o subst"ato.............................................. 4 Tabela 4 - Reação ) – 'feito da concent"ação do subst"ato.......................................4 Tabela * - Reação ' – 'feito da concent"ação do en#ima.......................................... 4 Tabela + - Reação , – 'feito da tempe"atu"a............................................................. * Tabela - Reação – 'feito do p/............................................................................ * )iscussão0&onclusão........................................................................................................+ Reação A – Ação da polifenoloxidase e" Tabela 1 dos Resultados.............................+ Reação – !atu"e#a $u%mica da polifenoloxidase e" Tabela 2 dos Resultados.........+ Reação & – 'speci(cidade pa"a o subst"ato e" Tabela 3 dos Resultados.................. Reação ) – 'feito da concent"ação do subst"ato e" Tabela 4 dos Resultados.......... Reação ' – 'feito da concent"ação do en#ima e" Tabela * dos Resultados.............. Reação , – 'feito da tempe"atu"a e" Tabela + dos Resultados................................. Reação – 'feito do p/ e" Tabela dos Resultados................................................5 iblio6"a(a.....................................................................................................................11
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Resumo As polifenoloxidases 7e6etais são as en#imas "espons87eis pelo escu"ecimento de ce"tos p"odutos 7e6etais. !este t"abal9o expe"imental: "eali#a"am-se 78"ios ensaios com a p"incipal (nalidade de obse"7a": ent"e out"os fato"es: a ação destas en#imas sob"e um subst"ato o catecol um difenol e 7e"i(ca" a in;us a "eali#ação do p"ocedimento expe"imental podemos obse"7a" 78"ias alte"aç=es no aspeto e co" das soluç=es contidas nos tubos de ensaio: alte"aç=es essas $ue se encont"am "e6istadas nas tabelas se6uintes?
Tabela 1 - Reação A – Ação da polifenoloxidase Tubo de Ensaio A1 A2 A3
Cor
Composição
@nicial Ba"anCa escu"o &"eme @ncolo"
'xt"ato &atecol 'xt"ato D6ua D6ua &atecol
)epois da incubação e"mel9o tiColo escu"o &"eme @ncolo"
Tabela 2 - Reação – !atu"e#a $u%mica da polifenoloxidase Tubo de Ensaio
Cor Composição
@nicial
Adição de catecol
B1
'xt"ato &atecol
Ba"anCa escu"o
EEEEEEEE
B2
'xt"ato T&A 'xt"ato &"istais de ,eniltiou"eia
"anco opaco
"anco opaco
"anco opaco
"anco opaco
B3
)epois da incubação e"mel9o tiColo escu"o "anco opaco "anco mais opaco
Tabela 3 - Reação & – 'speci(cidade pa"a o subst"ato Tubo de Ensaio C1 C2 C3
Cor
Composição
'xt"ato &atecol 'xt"ato ,enol 'xt"ato /id"o$uinona
@nicial Ba"anCa escu"o &"eme
)epois da incubação e"mel9o tiColo escu"o Ba"anCa
&"eme
Ba"anCa
Tabela 4 - Reação ) – 'feito da concent"ação do subst"ato Tubo de Composição Ensaio D1 &atecol D6ua D2 &atecol D6ua &atecol D6ua D3
Cor
@nicial @ncolo" @ncolo" @ncolo"
Adição de 'xt"ato &"eme cla"o &"eme &"eme escu"o
)epois da incubação e"mel9o tiColo cla"o e"mel9o tiColo e"mel9o tiColo escu"o
Tabela * - Reação ' – 'feito da concent"ação do en#ima Tubo de Ensaio E1 E2
Composição
'xt"ato &atecol 'xt"ato D6ua &atecol
Cor
@nicial Ba"anCa escu"o Ba"anCa cla"o
)epois da incubação e"mel9o tiColo escu"o Ba"anCa escu"o
4
Tabela + - Reação , – 'feito da tempe"atu"a Cor
Tubo de Composição Ensaio
@nicial
Adição de catecol F mesma tempe"atu"a
F1
'xt"ato a GH&
&"eme
&"eme escu"o
F2
'xt"ato a 3H&
&"eme
e"mel9o tiColo
F3
'xt"ato a GH&
&"eme cla"o
&"eme escu"o tu"7o
)epois da incubação e"mel9o tiColo escu"o e"mel9o tiColo escu"o &"eme escu"o tu"7o
Tabela - Reação – 'feito do p/ Tubo de Ensaio G1 G2 G3 G4
Cor Composição
@nicial
/&l Tampão acetato Tampão de fosfatos Tampão T"is
@ncolo" @ncolo"
Adição de catecol e ext"ato 'sb"an$uiçado &"eme
@ncolo"
Ba"anCa escu"o
e"mel9o tiColo escu"o
@ncolo"
e"mel9o tiColo
&astan9o
)epois da incubação 'sb"an$uiçado &"eme escu"o
*
)iscussão0&onclusão Antes de ap"esenta"mos as conclus=es ace"ca das "eaç=es e dos "esultados: conside"amos opo"tuno escla"ece" o p"ocedimento le7ado a cabo pa"a a p"epa"ação do ext"ato en#im8tico. A adição do ;uo"eto de s>dio ao ext"ato 7isou aCuda" a "eti"a" o en#ima do mesmo. AlIm disto: o facto de o ext"ato te" pe"manecido num ban9o de 6elo ap"oximadamente GH& du"ante toda a ati7idade labo"ato"ial te7e como obCeti7o a inibição do polifenoloxidase. J e"lenmeKe" tambIm pe"maneceu du"ante toda a ati7idade cobe"to com papel de alum%nio pa"a e7ita" a desnatu"ação da p"ote%na pela lu#. Jut"o ponto a salienta" I o facto de a incubação te" sido a 3H&: o $ue asse6u"ou de ce"ta fo"ma a 7iabilidade e aceitação ou não dos nossos "esultados: pois I p"ecisamente a esta tempe"atu"a $ue a ati7idade da en#ima em estudo I m8xima. A ati7idade pe"mitiu ti"a" conclus=es "elati7as ao compo"tamento do polifenoloxidase em di7e"sas situaç=es?
Reação A – Ação da polifenoloxidase e" Tabela 1 dos Resultados Relati7amente ao tubo A1: apesa" de se encont"a" F tempe"atu"a ambiente: a Cunção do ext"ato en#im8tico de tom c"eme: contendo polifenoloxidase ao catecol pe"mitiu $ue a "eação ti7esse in%cio de imediato: o $ue: po"tanto: te7e como "esultado a fo"mação de $uinonas e a conse$uente a$uisição de uma co" la"anCa escu"a da solução. !o entanto: a incubação a 3H& p"o7ocou a intensi(cação da ati7idade en#im8tica: o $ue se t"adu#iu num aumento da fo"mação de $uinonas e na intensi(cação da co" pa"a um tom 7e"mel9o tiColo escu"o. Luanto ao tubo A2: a co" inicial pouco se alte"ou com a incubação: uma 7e# $ue est87amos pe"ante uma diluição do ext"ato em 86ua. A co" e"a assim o"iunda do ext"ato: cuCo tom em condiç=es no"mais e"a c"eme. Po" (m: a "eação $ue oco""eu no tubo A3 "esultou na pe"mans a incubação. 'ste "esultado C8 e"a espe"ado: 7isto $ue: semel9ante ao $ue 9a7ia acontecido em A2: este tubo apenas contin9a catecol e 86ua. Js tubos A2 e A3: de ce"ta fo"ma: funciona"am como cont"olo C8 $ue pe"miti"am obse"7a" a não oco"" se deu com este subst"ato e os "esultados na p"esença de 86ua fo"am ne6ati7os.
+
Reação – !atu"e#a $u%mica da polifenoloxidase e" Tabela 2 dos Resultados !o tubo 1: sabendo $ue tin9a na sua composição o mesmo $ue o tubo A1: e"a de espe"a" $ue os "esultados fossem i6uais. Assim: isto mesmo foi 7e"i(cado e a "eação ent"e o ext"ato en#im8tico e o catecol o"i6inou uma co" la"anCa escu"a inicialmente: e depois da incubação: um tom 7e"mel9o tiColo escu"o. Me"7indo então: este tubo: como cont"olo positi7o. 'm "elação ao tubo 2: obse"7ou-se $ue a "eação ent"e o ext"ato e o 8cido t"iclo"oacItico T&A dete"minou a mudança da solução pa"a uma co" b"anca opaca: "e;etindo assim a p"esença de pa"t%culas em suspensão. 'ste acontecimento foi p"o7ocado pela desnatu"ação dos en#imas do ext"ato como conse$ubia de difen>is: mas tambIm a 9id"oxilação de 78"ios monofen>is. )este modo: se"ia de espe"a" a oco""s a incubação: $uando inicialmente e"a c"eme "e7ela: de no7o: um "esultado positi7o. )a$ui se dep"eende $ue o polifenoloxidase desempen9a a sua
ati7idade en#im8tica: não s> sob"e difen>is e monofen>is: mas tambIm sob"e out"as espIcies $u%micas.
Reação ) – 'feito da concent"ação do subst"ato e" Tabela 4 dos Resultados !esta "eação: tendo em conta: po" um lado: o p"ocedimento se6uido e o conse$uente aumento da $uantidade de catecol e dec"Iscimo da $uantidade de 86ua de )1 pa"a )3 tubo )1? O G:G*mB de catecol tubo )2? 1mB de catecol tubo )3? 2mB de catecol ou seCa: diluiç=es e: po" out"o lado: a pe"sisttima pa"a o funcionamento do polifenoloxidase: a "eação: como C8 e"a espe"ado: deco""eu no"malmente? a ati7idade en#im8tica aumentou e su"6iu uma co" 7e"mel9o tiColo escu"a. !o tubo '2: alIm de te" sido colocada uma $uantidade meno" de ext"ato: a solução foi ainda mais dilu%da 6"aças F adição de 86ua. Assim: a co" inicial não e"a tão fo"te $uanto F do tubo '1: tendo passado de um la"anCa cla"o pa"a um la"anCa escu"o $ue ma"ca7a a p"esença de $uinonas numa concent"ação bastante infe"io" ao $ue 9a7ia acontecido ante"io"mente. Relati7amente F "eação ': o obCeti7o ence""ado nesta "eação foi cump"ido e foi poss%7el obse"7a"-se o efeito da concent"ação do en#ima. &oncluiu-se então $ue uma maio" concent"ação p"o7oca uma cat8lise en#im8tica mais e(ciente e po"tanto uma maio" 7elocidade na fo"mação dos metabolitos. 'sta
a("mação baseia-se na compa"ação não s> dos "esultados obtidos nos tubos '1 e '2: mas tambIm no tubo A1. Assim: 7e"i(ca-se $ue: po" exemplo: F tempe"atu"a ambiente a "eação foi mais "8pida de '2 mais dilu%do: passando po" A1: atI '1 solução com uma maio" concent"ação de ext"ato en#im8tico.
Reação , – 'feito da tempe"atu"a e" Tabela + dos Resultados 'm "elação ao tubo ,1: a colocação do ext"ato no ban9o de 6elo: e po"tanto a ap"oximadamente GH&: le7ou F 7isuali#ação: no in%cio: de um tom c"eme do ext"ato en#im8tico: como C8 9a7ia sido desc"ito ante"io"mente. Luando o catecol foi adicionado ao ext"ato: ainda a esta tempe"atu"a: deu-se uma pe$uena "eação $ue: contudo: condu#iu F alte"ação da p"imei"a co" pa"a um c"eme escu"o: "e7elando: um pouco inespe"adamente: a ati7idade do polifenoloxidase a esta tempe"atu"a. A inibição pa"cial causada pela baixa tempe"atu"a foi eliminada a pa"ti" do momento em $ue o tubo foi incubado e F medida $ue se foi dando o a$uecimento atI aos 3H&: o en#ima 7oltou a um estado ati7o e t"ansfo"mou o subst"ato em $uinonas $ue concede"am F solução o tom 7e"mel9o tiColo escu"o ca"acte"%stico. )e se6uida: o tubo ,2 $ue foi mantido a uma tempe"atu"a constante de 3H&: p"odu#iu i6ualmente um "esultado positi7o. A colo"ação c"eme o"iunda do ext"ato: "apidamente deu o"i6em a um 7e"mel9o tiColo $uando foi adicionado o catecol. A pe"mans esta etapa da "eação. Po" (m: o tubo ,3 foi colocado du"ante um cu"to espaço de tempo numa incubação a GH&. Ao (m deste tempo: 7e"i(c8mos $ue a co" c"eme natu"al do ext"ato 9a7ia dado lu6a" a um c"eme mais cla"o de7ido F desnatu"ação de al6uns en#imas. Luando se Cuntou o catecol a co" (cou li6ei"amente mais escu"a e tu"7a: conse$us a incubação a 3H& p"o7ou: de no7o: $ue esta tempe"atu"a to"na a "eação mais extensa e mais e(ciente na catalise en#im8tica do polifenoloxidase. ,inalmente: o constante tom incolo" dos tamp=es usados: $ue tambIm se 7e"i(cou com o tampão T"is: deu lu6a" a um tom 7e"mel9o tiColo escu"o no exato momento em $ue fo"am ac"escentados o ext"ato e o catecol. )a$ui se infe"e $ue a "eação foi bastante positi7a e $ue o tampão T"is to"nou a catalise en#im8tica ext"emamente e(ciente mesmo F tempe"atu"a ambiente. )a incubação $ue se se6uiu: su"6iu um tom castan9o $ue demonst"a a fo"mação de $uinonas e $ue con("ma os efeitos $ue" do p/: $ue" da tempe"atu"a na cat8lise en#im8tica. ,indando as conclus=es $ue infe"imos ace"ca desta ati7idade labo"ato"ial encont"a-se a "eação $ue tin9a o intuito 7e"i(ca" o efeito do p/ sob"e os en#imas e a sua ati7idade. Js "esultados obtidos fo"am bastante positi7os e comp"o7a"am $ue a ati7idade en#im8tica I fa7o"ecida po" n%7eis de p/ mais b8sicos: sendo bastante p"eCudicada po" n%7eis fo"temente 8cidos. AlIm disto: uma compa"ação ent"e a tempe"atu"a >tima de funcionamento dos en#imas e os n%7eis de p/ mais fa7o"87eis: pe"mite conclui" $ue estes Qltimos desempen9am uma papel mais positi7o e dete"minante na ati7idade en#im8tica. 'sta dedução ad7Im da compa"ação dos "esultados do tubo A1: po" exemplo: e do tubo 4? com as mesmas concent"aç=es de en#ima e subst"ato: F tempe"atu"a ambiente o p/ fa7o"eceu mais a ati7idade do polifenoloxidase. 1G
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iblio6"a(a M. Dixon, E. C. Webb, Enzymes, 3rd ed.; Longman: London, 1979.
T. Anis#eSsl: R. Biebe"ei: U. uleSic#: Acta iol. &"ac. Me". ot. 2GG: *G: –1.
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