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QBQ 2454 – Bioquímica: Estrutura de Biomoléculas e Metabolismo
Relatório II – Proteínas: Eletroforese, Dosagem pelo método do biureto e Fracionamento
Carolina Domeniche Romagna Pedro Lazzarin Marani Thiago Carita Correra
N° USP: 5122141 N° USP: 5122238 N° USP: 5122026
QBQ – 2454: Bioquímica: Estrutura de Biomoléculas e Metabolismo IV – ELETROFORESE DE PROTEÍNAS EM ACETATO DE CELULOSE Objetivo Executar uma eletroforese em fita de acetato de celulose e a partir dela determinar as proteínas do soro bovino.
Introdução Esta técnica de separação e identificação de proteínas (e outros compostos) consiste na migração de íons num campo elétrico. Foi usada a eletroforese em folha de acetato de celulose embebida numa solução tamponada em pH 8,4. As proteínas com carga líquida positiva no pH do tampão migram para o pólo negativo, as com carga líquida negativa, para o positivo. A migração depende também da mobilidade do composto sobre o suporte. Proteínas com mesma carga líquida e estruturas diferentes podem não formar bandas iguais. O ponto isoelétrico da albumina é: 4,9, da γ -Globulina é: 6,6, da Hemoglobina: 7,1, do Citocromo C: 10,6. A solução utilizada estava tamponada em pH 8,4.
Resultado e discussão A fita de acetato de celulose com a revelação da eletroforese onde foram aplicados da esquerda para a direita, com o corte na parte superior esquerda, amostra, padrão e soro está em anexo. Onde foi aplicado soro, houve formação de uma nuvem de proteína, umas migradas para o pólo positivo, poucas para o negativos, e uma quantidade apreciável manteve-se sem mover-se. Houve formação de uma banda mais intensa na mesma região que há uma banda na amostra e uma banda da mistura padrão. Na faixa de onde foi adicionada mistura padrão, choveram formações de três bandas distintas, uma que migrou para o pólo positivo (a mesma da amostra), uma que migrou muito pouco para o pólo positivo, e uma que migrou para o pólo negativo. Na faixa onde foi adicionada amostra houve formação de uma única banda, coincidente com uma da mistura padrão. Notou-se que nem na amostra nem no soro apareceu a banda que migrou para o pólo negativo na mistura padrão, notando-se que nem num nem noutra há citocromo c (proteína presente no interior das mitocôndrias). 1) Sabendo que todas as globulinas tem pH menor que o do tampão, e também a albumina, e a hemoglobina, em teoria, espera-se que todas as proteínas do soro encontrassem-se migradas para o pólo positivo umas mais que outras, já que têm carga líquida negativa no pH do tampão. Sabendo que a mistura padrão contem albumina de soro bovino, Hemoglobina e Citocromo C e sabendo seus pI’s, espera-se que tenha três bandas, uma que migrou bastante para o pólo positivo (albumina), uma que migrou um pouco para o pólo positivo (hemoglobina) e uma que migrou para o pólo negativo (citocromo c). Na o se pode prever o comportamento da amostra. 2) Vendo o resultado da eletroforese (anexo), pode-se notar que há uma banda da mistura padrão que é muito parecida com a da amostra, esta é a mancha do padrão que
mais migrou para o pólo positivo (albumina). Pode-se então adotar que na amostra havia albumina de soro bovino, mas ressalta-se que poderia haver uma outra proteína com razão carga liquida/fricção molecular semelhante. 3) A fim de separar as proteínas do soro sangüíneo poderia-se usar uma coluna de troca iônica, usando um tampão com pH adequado, já que neste pH a grande maioria das proteínas estão com carga liquida negativa, seria interessante usar um gradiente para retirar frações de proteínas. Poderia-se usar também a coluna de gel, ainda que não se tenha informação acerca do tamanho das proteínas, haveria uma separação, é necessário saber se a desejada.
V – DOSAGEM DE PROTEÍNAS PELO MÉTODO DO BIURETO Objetivos Esta etapa do experimento tem como objetivo a determinação da concentração de proteínas em amostras desconhecidas.
Introdução Existem diversos métodos para dosagem de proteínas, c omo o ensaio de fixação do verde de bromocresol e o teste de biureto, entre outros. Ambos os testes estão baseados na absorbância das espécies formadas da reação dos corantes com as proteínas da solução. Neste experimento foi utilizado o método do biureto (solução básica de sulfato de cobre e tartarato, que funciona como estabilizante), que consiste numa reação colorimétrica, gerando a espécie abaixo:
O R O R C N H H H
C C
C
H
N H 2+
Cu
N H C C
H H N
C
C
R O R
O
1
Tal reação dos íons Cu 2+ em meio alcalino com os nitrogênios das proteínas produz uma coloração púrpura (absorve em 540nm), o que possibilita o uso da fotometria para determinar a absorbância da amostra de proteínas simples, já que as soluções de proteínas conjugadas possuem coloração, impedindo o uso do método. Pela lei de Lambert e Beer 2, a absorbância de uma amostra será dada por: A = a.b.c, onde a é a absortividade molar do composto, b é o caminho ótico atravessada pela luz e c é a concentração molar. Como o caminho ótico depende da cubeta utilizada no espectrofotômetro e a absortividade molar será a mesma para o composto estudado 3, basta construir uma curva 1
Adaptado do roteiro experimental da disciplina DB-105 (Bioquímica) Unicamp http://www.sherwood-scientific.com/chroma/chromaoperation.html 3 Como a e b são constantes no experimento, temos A = K.c. 2
padrão de absorbância por concentração, utilizando para isso diversas amostras de concentração conhecida previamente preparadas. O coeficiente angular da regressão linear desta curva padrão será uma relação entre concentração e absorbância, o que possibilitara a dosagem de amostras uma vez que suas absorbâncias tenham sido medidas.
Experimento Para dosar a quantidade de albumina foi construído uma curva padrão, e para tanto cinco soluções de concentração conhecida tiveram sua absorbância medida no espectrofotômetro previamente calibrado. Uma amostra sem proteína foi utilizada como branco. Essa amostra tem a função de corrigir a absorbância correspondente a todas as espécies presentes na solução que não a proteína que reagiu com os íons cobre II. Caso isso não tivesse sido feito, seria necessário descontar de todos os dados um b que seria: A = C*k + b O espectrofotômetro desconta o valor de absorbância obtido dessa amostra dos valores obtidos nas amostras que continham proteínas, assim obtemos somente a absorbância relativa às proteínas que desejamos quantificar. Após as amostras serem preparadas estas foram colocadas em banho-maria á 37ºC por 15 minutos para que ocorra a reação. Após o banho e as amostras terem voltado à temperatura ambiente (já que a absorbância também depende da temperatura) as absorbâncias foram medidas, dando origem aos dados abaixo: Absorbância (A) C/mg.mL-1 0,0586 0,2 0,0933 0,4 0,1427 0,6 0,1842 0,8 0,3361 1,4
0,35
Y = 0,23815*X R = 0,99837
0,30
0,25
a i c n â 0,20 b r o s b 0,15 A 0,10
0,05
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0 -1
C/mg.ml
1,2
1,4
Resultados e discussão A curva padrão encontrada é uma reta que passa pela origem, devido à amostra branco, de concentração de proteína 0 mg/mL, mas ocasionalmente poderia não passar pela origem devido aos erros experimentais ocorridos. Mesmo assim, uma curva não deve ser usada, pois pela lei de Lambert e Beer a absorbância será linearmente proporcional a concentração ( A = k.C ) e sabemos que esta é uma equação de uma reta que passa pela origem. A absorbância da amostra desconhecida foi medida sendo 0,2726. Portanto a concentração da albumina será: C = A/K , onde K foi obtido do gráfico anterior. Logo C = 0,2726/0,23815 = 1,14 mg.mL -1 Porém, como a solução de concentração desconhecida foi diluída antes de ser colocada no espectrofotômetro, a concentração real da solução será: C = (C f .V f )/V i C = 1,14*4/1 = 4,56 mg.mL -1 Este experimento tem sua importância na medida que através da dosagem de albumina no soro humano pode-se diagnosticar diversos quadros patológicos, simplesmente comparando as concentrações obtidas com os valores obtidos de pacientes saudáveis. Da literatura4 temos que os valores esperados são: Idade C/mg.mL-1 Adultos 18-60anos 35-50 >60anos 34-48 Crianças 14-18anos 32-45 4dias-14 38-54 Recém-nascidos 0-4dias 28-44 Variações na taxa de albumina no soro humano são dados importantes já que esta proteína representa 55 a 65% de todas as proteínas plasmáticas 5, transportando e armazenando uma série de ligantes, ligando-se e solubilizando compostos e fármacos, o que explica sua importância farmacocinética. Por esse motivos e muitos outros a hipoalbuminemia é freqüente em muitas doenças, como má-absorção de aminoácidos (doença de Crohn), proteinúria devida à síndrome nefrótica, perda de proteínas nas fezes (doença neoplásica), possibilitando que tais doenças sejam diagnosticados.
VI – FRACIONAMENTO DE PROTEÍNAS Introdução A fim de separar proteínas um dos métodos usados é o fracionamento por “salting out”. Uma solução contendo uma mistura de proteínas tem sua força iônica alterada a fim de precipitar uma delas, retira-la e posteriormente precipitar mais uma, 4
Tietz NW, ed. Clinical Guide to Laboratory Tests. 2nd ed. Philadelphia: WB Saunders; 1990:26-29. et al. 5 Manual do kit de reagentes COBAS ® INTEGRA Albumin,Versão 3.0, 05/1998.
etc. Isto ocorre pois diferentes proteínas respondem ao aumento da força iônica de formas diferentes, devido às alterações que o meio causa nas interações da solvente proteína e proteína - proteína. O sal usado geralmente é o sulfato de amônia devido à sua capacidade de formar soluções de alta força iônica. Esta precipitação depende também da temperatura.
Experimento Aos cinco mililitros de soro que foram disponibilizados, adicionou-se cinco mililitros de solução saturada de sulfato de amônio a fim de obter uma solução 50% do sal. Após a primeira centrifugação o precipitado foi diluído em cinco mililitros de solução de NaCl 2% com esta solução foi feita a analise quantitativa por meio do método do biureto considerando que no precipitado havia apenas uma proteína com o numero de resíduos similar ao da albumina, usando a curva padrão feita no experimento 5. Daí obteve-se uma concentração de proteína no precipitado centrifugado de 16,35 mg/ml (ver contas). 1- Volume de precipitado: 3,5 ml. 2- Volume de precipitado + Solução de NaCl 2%: 8,5 ml. 3- Volume de solução usada para preparar a solução de biureto para analise: 0,5 ml. A solução final tem 4 ml. 4- Absorbância excetuando-se o branco: 0,2864. 5- Equação do experimento V: A=0,2382*C. 6- Concentração do analito: 1,202 mg/ml. 7- Concentração da solução 2: 9,618 mg/ml. 8- Concentração de globulina na solução: 16,35 mg/ml. Cálculo: Da concentração de analito: C = m/V 1,202 = m/4 m = 4,809 mg de globulina. Ajuste do volume: Os 8,5 mL têm a mesma concentração: m = (8,5/0,5)*4,809 m = 81,76 mg de globulina. Esta era a massa de globulina presente nos 5ml de soro iniciais. C = m/V C = 81,76 / 5 C = 16,35 mg/ml Notar que para que a consideração de que a absorbância desta solução pode se referir à concentração conforme a curva padrão feita no experimento 5 seja valida é necessário considerar que esta tem numero de ligações peptídicas comparável, e portanto numero de resíduos comparável com a albumina. A γ -globulina tem massa próxima à do dímero de albumina de soro 6. Aos demais seis e meio mililitros de sobrenadante, foram adicionados outros seis e meio mililitros de solução saturada de sulfato de amônia. Após a segunda centrifugação o precipitado foi solubilizado em cinco mililitros de solução 2% de NaCl e foi analisado com o mesmo método a quantidade de albumina. 1- Volume de precipitado: 2,0 ml. 2- Volume de precipitado + solução de NaCl 2%: 7,0 ml. 3- Volume de solução usada para preparar a solução de biureto para analise: 0,5 ml. E 1,0 ml. A solução final tem 4 ml. 4- Absorbâncias excetuando-se o branco: 0,1510. E 0,2001. 5- Equação do experimento V: A=0,2382*C. 6- Concentração do analito: 0,6339 mg/ml. E 0,8400 mg/ml. 7- concentração da solução 2: 5,0714 mg/ml. E 3,3602. 6
Voet, Donald, Biochemistry, third ediction, 2004, Wiley international edition, Figure 6-10, page 138.
8- Concentração da albumina no soro: 5,902 mg/ml. (media) Calculo: Da concentração de analito para 0,5 ml: C = m/V 0,6339 = m/4 m = 2,536 mg de albumina. Ajuste do volume: Os 7 mL têm a mesma concentração: m = (7,0/0,5)*2,536 m = 35,50 mg de albumina. Esta era a massa de albumina presente nos 5mL de soro iniciais. C = m/V C = 35,50 / 5 C = 7,10 mg/ml Da concentração de analito para 1 mL: C = m/V 0,8400 = m/4 m = 3,3602 mg de albumina. Ajuste do volume: Os 7 mL têm a mesma concentração: m = (7,0/1)*3,3602 m = 23,52 mg de albumina. Esta era a massa de albumina presente nos 5mL de soro iniciais. C = m/V C = 23,52 / 5 C = 4,70 mg/ml Media: C = (7,10 + 4,70)/2 C = 5,09 mg/ml Notar que este precipitado continha albumina, portanto a curva padrão se aplica sem aproximações. A fim de facilitar foram feitas duas soluções de biureto com o precipitado da centrifugação, uma com 0,5 ml de solução e uma de 1 mL já que não era sabido qual delas seria compatível com a curva padrão feita no experimento 5. No entanto as duas forneceram pontos na curva, mas os resultados foram diferentes, a primeira (0,5 mL) forneceu concentração inicial de 7,10 mg/mL e a segunda, de 4,70 mg/mL. Em não se sabendo qual é o dado correto fez-se uma media entre eles.
Resultados e Discussão 1) a- Segundo o gráfico, log s ~ 0,1 portanto, shemoglobina ~ 1,26 g/ml . Ver figura:
bAnalisando o gráfico, vemos que numa solução de força iônica igual a 8, a solubilidade de mioglobina é aproximadamente igual a 7,08 g/ml, portanto, não pode ter
havido precipitação, pois a concentração de mioglobina é necessariamente menor que 3,5 g/ml, já que uma solução com esta concentração foi diluída para obter aquela. 2) O gráfico abaixo foi construído com os dados do roteiro: NaCl NaCl NaCl NaCl
3,0
1mM 5mM 10mM 20mM
2,5 1 -
L 2,0 m . g m / 1,5 e d a d i l i 1,0 b u l o S 0,5
0,0 4,8
5,0
5,2
5,4
5,6
5,8
pH
aHá um mínimo das curvas num pH entre 5,2 e 5,4 (aproximadamente 5,26). O que já era esperado, pois o pI da β -lactoglobulina é 5,27. bEste pH é o ponto isoelétrico onde a solubilidade de proteínas em meios com sais tem um mínimo pois em pH’s acima e abaixo dele elas têm carga liquida diferente de zero mas neste ponto sua carga liquida é zero. Representando um mínimo de interação com o sal e, portanto, um mínimo de solubilidade. cNum mesmo pH, a solubilidade da proteína aumenta com o aumento da concentração de sal. O fenômeno observado poderia ser diferente se fossem estudadas concentrações menores. dO efeito em que em soluções mais ricas em sal a solubilidade de proteínas é maior é chamado “salting in” e consiste em aumentar a solubilidade de uma proteína pela adição de um composto iônico devido à interação entre a proteína e o composto iônico. Essa interação entre as duas substâncias faz com que hajam mais moléculas de solvente livres, que solvatariam um maior número de moléculas de proteína, aumentando a sua solubilidade. O efeito da diminuição da solubilidade da proteína com a variação do pH havendo um mínimo de solubilidade é chamado de precipitação isoelétrica, pois quanto mais próximo o pH está do pI menos carregada estará a proteína, e, portanto, menos solúvel em solução de solvente polar e soluto iônico ela será.
Bibliografia 1.Roteiro experimental da disciplina DB-105 (Bioquímica) Unicamp 2. http://www.sherwood-scientific.com/chroma/chromaoperation.html 3. Tietz NW, ed. Clinical Guide to Laboratory Tests . 2nd ed. Philadelphia: WB Saunders; 1990:26-29. et al. 4. Manual do kit de reagentes COBAS ® INTEGRA Albumin,Versão 3.0, 05/1998. 5. Voet, Donald, Biochemistry , Third Ediction, 2004, Wiley international edition. 6. Lehninger, Principles of Biochemistry , Third Edition, 2000, Worth Plublishers 7
Lehninger, Principles of Biochemistry, Third Edition, 2000, Worth Plublishers, Table 5-6, page 135
7. ZAIA, Dimas A. M., ZAIA, Cássia Thaïs B. V. and LICHTIG, Jaim. Determination of total protein by spectrophotometry: advantages and disadvantages of proposed methods. Quím. Nova, Nov./Dec. 1998, vol.21, no.6, p.787-793
