Transcript
9.10.2009r. ĆWICZENIA 1Techniki histologiczne (technika parafinowa, celloidynowa, mrożeniowa) Technika parafinowa 1. Pobieranie materiału Przy pobieraniu materiału należy zwrócić uwagę na dwie zasadnicze sprawy: ã fragment pobranej tkanki powienien być stosunkowo niewielki (do celów mikroskopii świetlnej przynajmniej jeden wymiar nie powinien przekraczać 5 mm, a do celów mikroskopii elektronowej 1 mm), aby zapewnićdobrą i możliwie szybką penetrację płynów stosowanych w dalszych etapach procedury (utrwalacz, płynyodwadniające i pośrednie); przy pobraniu większego fragmentu należy go przed utrwaleniem pokroić namniejsze kawałki; ã jeżeli materiał pochodzi od uprzednio zabitego zwierzęcia laboratoryjnego, pobranie materiału powinno sięodbyć za życia lub natychmiast po śmierci zwierzęcia, aby zapobiec zmianom rozkładowym w tkankach. Ztego samego powodu, jeżeli po pobraniu materiału trzeba go gdzieś przetransportować, należy użyć do tegocelu pojemnika z lodem. 2. Utrwalanie materiałuUtrwalanie materiału ma na celu: ã natychmiastowe zatrzymanie procesów metabolicznych w komórkach i tkankach, przede wszystkim poprzezdenaturację enzymów. Można w ten sposób zapobiec zmianom autolitycznym, czyli samostrawieniu komórek przez ich własne enzymy lizosomowe, oraz wtórnym zmianom rozkładowym i gnilnym wywołanym przezobecne w materiale lub zawleczone z zewnątrz bakterie; ã związanie i wytrącenie (precypitację) niektórych zawartych w tkankach substancji rozpuszczalnych, cozapobiega ich późniejszej dyfuzji i umożliwia uwidocznienie; ã wstępne utwardzenie materiału i zwiększenie jego odporności na działanie odczynników używanych wdalszych etapach procedury; ã niekiedy również poprawę optycznego zróżnicowania tkanki poprzez wywołanie w niej reakcji chemicznychułatwiających późniejsze barwienie. Niewątpliwie najistotniejsze znaczenie mają trzy pierwsze cele utrwalania i prawie wszystkieutrwalacze spełniają zawarte w pierwszych trzech punktach warunki. Umożliwiają one zachowanie wutrwalonym materiale struktury możliwie najbardziej zbliżonej do naturalnej struktury żywych komórek itkanek. Rodzaje utrwalaczy Utrwalanie możemy podzielić na chemiczne i fizyczne. Do utrwalaczy chemicznych należą (wnawiasach podano najczęściej stosowane stężenia): ã aldehydy: formaldehyd (aldehyd mrówkowy, formalina - 2-10%), aldehyd glutarowy (1,5-6,0%), akroleina(10%); ã alkohole: etylowy i metylowy (50-100%); ã ketony: aceton (50-100%); ã kwasy organiczne i nieorganiczne: kwas octowy (50-100%), kwas pikrynowy (1%), kwas chromowy (2%),kwas taninowy (1%); ã związki metali ciężkich: chlorek rtęci (sublimat - 5-7%), dwuchromian potasu (2,5-5,0%), czterotlenek osmu (0,5-2,0%)Utrwalacze chemiczne podzielić można na proste i złożone.Utrwalacze proste (czyli jednoskładnikowe):- kwasy mineralne i organiczne (kwas chromowy, kwas octowy, kwas pikrynowy, kwas trójchlorowy)- formalina 10% rozkłada glikogen, nie rozkłada tłuszczy)- alkohol etylowy 70% (rozpuszcza tłuszcze, nie rozpuszcza glikogenu)- alkohol metylowy- aceton- sole metali ciężkich Utrwalacze złożone , będące mieszaniną dwóch lub kilku utrwalaczy prostych oraz niekiedy innych substancji.Do najczęściej stosowanych utrwalaczy złożonych należą np.: ã utrwalacz Bouina (kwas pikrynowy i octowy, formalina), ã utrwalacz Susa (chlorek rtęci, chlorek sodu, kwas trójchlorooctowy, kwas octowy lodowaty, formalina, wodadestylowana) ã utrwalacz Carnoya (alkohol etylowy, chloroform i kwas octowy), ã utrwalacz Zenkera (sublimat, chlorek rtęci, dwuchromian potasu, siarczan sodu, woda destylowana, kwasoctowy, siarczan sodu).Rozpuszczalnikiem w roztworach utrwalaczy może być woda, bufory o określonym pH i sile jonowej, aw niektórych przypadkach również alkohole. Utrwalanie fizyczne polega na oddziaływaniu na materiał mikrofalami lub promieniowaniem jonizującym. 3. Płukanie materiału w wodzie W przypadku większości utrwalaczy określony jest maksymalny czas utrwalania. Przedłużenie tegoczasu może spowodować niekorzystne zmiany strukturalne w komórkach i tkance. Dlatego też procesutrwalania przerywa się poprzez wypłukanie utrwalacza z materiału. W zależności od rodzaju planowanych badań mikroskopowych (rutynowa mikroskopia świetlna, histochemia, mikroskopia elektronowa) płukanie przeprowadza się bądź w wodzie (najlepiej bieżącej), bądź w buforach, które służyły uprzednio jakorozpuszczalnik dla utrwalacza. Jeżeli użyto alkoholowego (bezwodnego) roztworu utrwalacza, płukanie przeprowadza się w kilku zmianach alkoholu o nieco wyższym stężeniu. 4. Odwadnianie Po utrwaleniu materiału, dalsze etapy procedury uzależnione są od rodzaju docelowego preparatumikroskopowego. W przypadku rozmazów, rozgniotów czy hodowli, można od razu przystępować do barwienia. Jeżeli natomiast chcemy uzyskać skrawki o przydatnej w mikroskopii bardzo niewielkiej grubości, pokrojenie materiału jest możliwe jedynie pod warunkiem jego należytego utwardzenia. Im cieńsze mają byćskrawki, tym twardszy musi być krojony materiał.W procesie odwadniania zastępujemy wodę obecną w tkance alkoholem lub acetonem. Proces ten polega na przeprowadzeniu materiału przez szereg wodnych roztworów tych substancji o stopniowowzrastających stężeniach (np. 50, 70, 80, 90%) aż do dwóch zmian bezwodnego (absolutnego) alkoholu lubacetonu. Odwadniania dokonuje się w szczelnie zamkniętych naczyniach - jest to szczególnie istotne podczasostatniego etapu tej procedury, gdyż zwłaszcza absolutny alkohol jest niezwykle higroskopijny i z łatwością chłonie wodę z powietrza. 5. Przeprowadzenie materiału przez płyny pośrednie: benzen, toluen, ksylen I i II, chloroformOdwodnionego materiału zazwyczaj nadal nie można zatopić, gdyż substancja, którą chcemy go przepoić, nie rozpuszcza się również w alkoholu czy acetonie. Istnieje zatem konieczność wstępnego przepojenia tkanki płynem, który rozpuszczałby się zarówno w odwadniaczu, jak i w środowisku użytym dozatapiania. Płyny takie noszą nazwę płynów pośrednich, bowiem pośredniczą pomiędzy odwadnianiem azatapianiem. Dopiero po dokładnym przepojeniu materiału płynem pośrednim można rozpocząć jegozatapianie.W przypadkach, gdy materiał zatapia się w środowiskach polarnych, nie jest konieczne aniodwadnianie, ani przepajanie płynem pośrednim. 6. Umieszczenie w parafinie ciekłej (początkowo w parafinie o topliwości poniżej 50 o C, później w parafinie o topliwości powyżej 50 o C)Używając parafiny do utwardzania materiału przed jego skrojeniem wykorzystuje się fakt, iż wtemperaturze pokojowej parafina jest substancją stałą, natomiast po stosunkowo nieznacznym ogrzaniu przechodzi w stan płynny.W pierwszym etapie umieszcza się materiał w roztworze płynu pośredniego i parafiny (1:1) wtemperaturze 37°C. Pozwala to na wstępne wprowadzenie parafiny do tkanki. Następnie materiał przeprowadzasię przez 2 lub 3 zmiany czystej parafiny, aby usunąć zeń nawet śladowe resztki płynu pośredniego, któregoobecność wpłynęłaby niekorzystnie na własności materiału podczas krojenia. W rutynowej technice histologicznej używa się kilku odmian parafiny różniących się twardością itemperaturą topnienia (im wyższa twardość, tym wyższa temperatura topnienia: od 45°C dla parafiny bardzomiękkiej do 60°C dla bardzo twardej). Proces przepajania parafiną odbywa się w cieplarce, w temperaturze okilka stopni wyższej od temperatury topnienia użytej parafiny. Czas przepajania jest zależny od rodzaju tkanki(jej twardości, spoistości, itp.) oraz od rozmiarów zatapianego materiału i wynosi od kilku godzin do kilku dni.Skonstruowano urządzenia (tzw. procesory tkankowe), w których cały proces od odwodnieniamateriału do jego przepojenia parafiną odbywa się automatycznie. Są one wykorzystywane w pracowniachwykonujących szczególnie duże ilości preparatów mikroskopowych (np. duże pracownie histopatologiczne).7. Formowanie bloczków Po zakończeniu procesu zatapiania materiał wkłada się do specjalnych foremek, zalewa płynną parafiną i szybko oziębia, np. przez zanurzenie w zimnej wodzie. Parafina zestala się i tak uzyskany bloczek możnanastępnie przyciąć do pożądanego kształtu i rozmiarów za pomocą ostrego noża.Przy równoczesnym opracowywaniu większej ilości materiałów niezbędne jest odpowiednieoznakowanie bloczków. Najprościej można to zrobić przez włożenie do foremki niewielkiego paska papieruzawierającego symbol danego materiału w ten sposób, aby po zestaleniu parafiny oznakowany fragment paskawystawał poza bloczek. 8. Krojenie przy pomocy mikrotomów Do krojenia skrawków histologicznych służą przyrządy zwane mikrotomami. Każdy mikrotom składasię z czterech podstawowych części: noża mikrotomowego, stolika przedmiotowego, na którym montuje sięskrawany bloczek, mechanizmu skrawania oraz mechanizmu regulującego grubość skrawków. W zależności odtypu konstrukcyjniego, częścią ruchomą może być albo stolik, albo (rzadziej) nóż.Istnieje kilka typów mikrotomów: ã mikrotom rotacyjny , najpowszechniejszy, w którym obrotowy ruch korby przekształcany jest w posuwisto-zwrotny ruch stolika względem noża; ã mikrotom wahadłowy , w którym obrotowy lub wahadłowy ruch uchwytu jest przekazywany systememdźwigni na stolik przedmiotowy, wykonujący ruch wahadłowy (po wycinku koła); ã mikrotom saneczkowy , w którym stolik wraz z uchwytem przesuwa się ruchem posuwisto-zwrotnymwzdłuż prowadnic, a nóż jest nieruchomy (lub odwrotnie). Nowoczesne mikrotomy często wyposażone są w napęd elektryczny oraz układy elektroniczneumożliwiające regulację szybkości skrawania, automatyczne dosuwanie nowo założonego bloczka do noża, itp. 9. Ułożenie skrawka materiału na szkiełku podstawowym Przy krojeniu materiału zatopionego w parafinie tworzy się tzw. wstęga , złożona z kolejnych(seryjnych) skrawków zlepionych ze sobą krawędziami. Używane obecnie mikrotomy pozwalają na uzyskanieskrawków parafinowych o grubości 2-10 µ m. Skrawki takie można przechowywać dowolnie długo bądź wformie wstęgi, bądź po ich uprzednim naklejeniu na szkiełka podstawowe. Naklejenie skrawka parafinowego na szkiełko podstawowe wymaga jego rozprostowania, gdyż podczaskrojenia skrawki mocno się fałdują. W celu rozprostowania skrawka umieszcza się go na powierzchni wodyogrzanej do ok. 40°C - działają nań wówczas siły napięcia powierzchniowego wody, a parafina staje sięmiękka. Po podłożeniu szkiełka pod rozprostowany skrawek wyjmuje się go z wody, a skrawek przykleja siędo powierzchni szkła. Naklejone skrawki suszy się przez ok. godzinę w temperaturze 37°C, co powodujemocne przywarcie wciąż miękkiej parafiny skrawka do szkiełka podstawowego.W przypadku niektórych materiałów oraz pewnych procedur wiążących się z intensywnym działaniemchemicznym na skrawek (np. utlenianie) lub z gwałtownymi zmianami środowiska (szybkie odwadnianie)skrawki mogą jednak odklejać się od szkiełka podstawowego. Zapobiega się temu przez pokrycie szkiełka przed naklejeniem skrawka cienką warstwą roztworu albumin lub poli-L-lizyny. 10. Odparafinowanie – przeprowadzenie przez płyny pośrednie 11. Nawadnianie – przeprowadzenie przez szereg alkoholi o malejących stężeniach: 96%, 80%, 70%, 50% 12. Barwienie W histologii używane są przede wszystkim wodne (rzadziej alkoholowe) roztwory barwników.Przepojone niepolarną parafiną skrawki nie zabarwią się, gdyż cząsteczki barwnika w wodnym środowisku są odpychane przez parafinę. Dlatego z takich skrawków trzeba najpierw usunąć parafinę (przez zanurzenie wksylenie lub innym rozpuszczalniku organicznym), a następnie przeprowadzić przez szereg roztworówalkoholu o coraz niższych stężeniach (nawadnianie, odwrotność odwadniania), aby w końcu przenieść je doczystej wody.Barwienie:a) naturalne- hematotoksylina (niebieski),- karmin (czerwony) b) sztuczne syntetyczne Najpopularniejszą metodą barwienia jest wykorzystanie barwników kwaśnych (eozyna, floksyna, oranżG) i zasadowych (hematoksylina, błękit metylenowy, safranina). Barwienie ma tu charakter reakcjizobojętniania: barwniki kwaśne wiążą się z tymi strukturami komórkowymi i tkankowymi, które wykazują odczyn zasadowy ( struktury kwasochłonne ), jak np. białka cytoplazmatyczne, włókna kolagenowe, itp.,natomiast barwniki zasadowe wiążą się ze strukturami wykazującymi odczyn kwaśny ( strukturyzasadochłonne ), jak np. chromatyna jądrowa (obecność DNA), czy rejony cytoplazmy bogate w rybosomy(obecność RNA). W najpowszechniej stosowanym barwieniu przeglądowym z użyciem hematoksyliny ieozyny, jądra komórkowe wybarwiają się hematoksyliną na granatowo, a cytoplazma eozyną na czerwono. Wkomórkach zawierających liczne rybosomy, cytoplazma barwi się na kolor fioletowy (efekt nałożenia barwyczerwonej i niebieskiej).Technikę barwienia można podzielić na barwienie progresywne , w którym przerywamy proces barwienia w momencie uzyskania pożądanej intensywności koloru, oraz barwienie regresywne , w którymtkankę rozmyślnie przebarwiamy, a następnie stosując odpowiednie roztwory odbarwiające doprowadzamy dowymaganego nasilenia barwy. Może się również zdarzyć, że podczas barwienia progresywnego - zwłaszczakilkoma różnymi barwnikami - dojdzie wbrew naszej woli do przebarwienia preparatu i trzeba zmniejszyćintensywność koloru. Traktowanie zabarwionego preparatu roztworami odbarwiającymi nosi nazwęróżnicowania i przeprowadza się go oczywiście pod kontrolą mikroskopu. Do różnicowania służą - wzależności od rodzaju użytego barwnika - roztwory alkoholi, kwasów, a także substancji o właściwościachutleniających. 13. Nawadnianie14. Zamykanie szkiełkiem nakrywkowym za pomocą balsamu kanadyjskiego.Po zabarwieniu i wypłukaniu preparat jest praktycznie gotowy do analizy mikroskopowej - należy go jednak zabezpieczyć przed niekorzystnym wpływem otoczenia (uszkodzenia mechaniczne, wysychanie,utlenianie niektórych barwników). Do tego celu służy tzw. zamykanie preparatów, czyli umieszczenie ich pomiędzy szkiełkiem podstawowym a nakrywkowym i wypełnienie przestrzeni pomiędzy oboma szkiełkamisubstancją, która powinna spełniać dwa podstawowe warunki: ã powinna posiadać taki sam współczynnik załamania światła jak szkło (w celu uniknięcia uginania irozpraszania promieni świetlnych na pograniczu środowisk o różnej charakterystyce optycznej); ã powinna w temperaturze pokojowej hermetycznie i trwale spajać oba szkiełka.Oba warunki najlepiej spełniają niepolarne żywice - albo naturalne (balsam kanadyjski), albosyntetyczne (DPX, Malinol, XAM, Entellan). Ponieważ żywice te są rozpuszczalne jedynie wrozpuszczalnikach organicznych, zabarwione preparaty muszą być poddane ponownemu odwodnieniu (tymrazem szybkiemu, gdyż dłuższe przetrzymywanie w roztworach alkoholi odbarwia preparaty) i zanurzone wtoluenie lub ksylenie (tzw. prześwietlanie). Dopiero wówczas preparaty można pokryć kroplą żywicy i nałożyćszkiełko nakrywkowe. Po wysuszeniu (przez kilka godzin, w temperaturze ok. 60-80°C) oba szkiełka są zesobą ściśle i hermetycznie spojone, i tak przygotowany preparat zachowuje swe własności optyczne nawet przez kilkadziesiąt lat.W sytuacji, gdy potrzebne jest natychmiastowe zamknięcie preparatu po barwieniu (np. blaknący barwnik), lub gdy preparatu nie można poddać odwodnieniu i prześwietleniu (w niektórych reakcjachhistochemicznych barwny produkt rozpuszcza się w alkoholu lub rozpuszczalnikach organicznych), stosuje sięmniej trwałe, wodne środowiska zamykające, które całkowicie spełniają tylko pierwszy z dwóchwymienionych powyżej warunków. Są to np.: żel glicerolowy (roztwór glicerolu i żelatyny), glicerol w soli
