ćwiczenie 2 - Diagnostyka Molekularna - Rainhardt

Transcript

Ćwiczenie 2.doc (47 KB) Pobierz ĆWICZENIE 5 Diagnostyka molekularna zakażeń gronkowcowych Badanie patogenezy chorób gronkowcowych stanowi ważną dziedzinę współczesnej nauki, w której upatruje się szansę na znalezienie alternatywnej metody zwalczania wielolekoopornych szczepów Staphylococcus aureus. Patogeneza chorób wywoływanych przez S. aureus jak i stopień wirulencji gronkowca złocistego zależy w dużej mierze od funkcjonowania jak i typu genu globalnej regulacji czynników wirulencji (gen agr). Stąd poznanie technik detekcji tego genu i badanie jego polimorfizmu ma istotne znaczenie. Ponadto, dużym problemem współczesnej medycyny jest badanie pokrewieństwa szczepów klinicznych odpowiedzialnych za zakażenia szpitalne. Stąd celem niniejszego ćwiczenia jest również poznanie techniki losowej amplifikacji polimorficznych fragmentów DNA (technika RAPD) stosowanej w ustalaniu pokrewieństwa badanych szczepów. W tym ćwiczeniu badane szczepy Staphylococcus aureus zostaną przeanalizowane pod kątem przynależności do jednej z czterech grup genu agr przy użyciu techniki multiplex PCR (5 różnych primerów, jeden forward i cztery reverse). Przebadany zostanie również polimorfizm genu agr drogą amplifikacji w reakcji PCR najbardziej polimorficznego rejonu tego genu, a następnie trawienia produktu PCR odpowiednimi enzymami i analizy produktów trawienia. Ostatnim etapem będzie oznaczenie struktury klonalej szczepów Staphylococcus aureus przy użyciu techniki RAPD-PCR. 1) Izolacja DNA z bakterii Jako metoda izolacji DNA genomowego z komórek S. aureus wykorzystany zostanie komercyjnie dostępny zestaw GeneJET Genomic DNA purification kit (postępowanie zgodnie z instrukcją załączoną w zestawie). Do dyspozycji studenci otrzymają hodowle nocne szczepów S. aureus hodowane w pożywce BHI. 2) Oznaczanie grupy genu agr w szczepach Staphylococcus aureus (AGR program) Przy zastosowaniu odpowiednich primerów w reakcji PCR (jeden primer forward i cztery primery reverse charakterystyczne dla danej grupy genu agr) badane szczepy zostaną przydzielone do jednej z czterech grup genu agr Przygotować Master Mix – ostateczna objętość 25 ul:    10x Bufor (1x) 10 mM dNTPs (200 µM) Mieszanina 5 primerów o stęż. 20 pmol/µl (30 pmol/reakcję)  1U/µl Polimeraza (1 U)  H2O  Dodać 4 μl matrycowego DNA  PCR – 30 cykli  Denaturacja 94°C 4 min  Denaturacja 94°C 30 sec  Hybrydyzacja 55°C 30 sec  Elongacja 72°C 1 min  Elongacja 72°C 5 min 3) Oznaczanie polimorfizmu genu agr w szczepach Staphylococcus aureus (agr pol program) Termocykler – Biometra Uno2  Przygotować MasterMix – ostateczna objętość 25 μl    10x bufor (1x) 10 mM dNTPs (200 μM) 100 pmol/µl primery (2 primery, 40 pmol/reakcję każego)  1U/µl polimeraza (EXTEND, 1 U)  H2O  Dodać 4 μl matrycowego DNA  PCR- 30 cykli  Denaturacja 94°C 4 min  Denaturacja 94°C 1 min  Hybrydyzacja 55°C 2 min   Elongacja 72°C 2 min Końcowa Elongacja72°C 4 min 4) Oznaczanie struktury klonalnej szczepów Staphylococcus aureus metodą RAPDPCR 1. Przygotować MasterMix do rekacji PCR zgodnie z poniższym opisem Ostateczna objętość 25 ul    10x Bufor (1x) 10 mM dNTPs (400 μM) 100 pmol/µl Primer AP-7 (50 pmol/reakcję)  1U/µl polimeraza (2 U)  H2O  Dodać 4 μl matrycowego DNA  Przygotowane próbki wstawić do termocyklera (30 cykli):  Denaturacja 94°C 4 min  Denaturatcja 94°C 1 min  Hybrydyzacja 25°C 1 min   Elongacja 74°C 2 min Końcowa Elongacja72°C 7 min 1 Plik z chomika: Rainhardt Inne pliki z tego folderu:   11.pdf (837 KB)  Cwiczenie 4.doc (31 KB)  Edyta_Paczos-Grzęda.pdf (293 KB) GeneJET genomic DNA purification kit (cw2).pdf (152 KB)  Hubisz Marta_gr2.doc (315 KB) Inne foldery tego chomika: biochemia białek lab diagnostyka w medycynie sądowej  giełdy 2014 msu molekularna diagnostyka wykłady  seminarium    Zgłoś jeśli naruszono regulamin        Strona główna Aktualności Kontakt Dla Mediów Dział Pomocy Opinie Program partnerski     Regulamin serwisu Polityka prywatności Ochrona praw autorskich Platforma wydawców Copyright © 2012 Chomikuj.pl