Transcript
Nowoczesne metody diagnostyczne Nowoczesne metody diagnostyczne Molekularne metody fenotypowe ‐ analiza białek
dr hab. Beata Krawczyk dr hab Beata Krawczyk Katedra Mikrobiologii PG
Publikacja współfinansowana ze środków Unii Europejskiej w ramach Europejskiego Funduszu Społecznego
Metody fenotypowe oparte o analizę białek • Elektroforetyczne Elektroforetyczne techniki analizy białek techniki analizy białek drobnoustrojów : ‐ profile białkowe uzyskane z całych komórek fil bi łk k ł hk ó k ‐ profile białkowe błony zewnętrznej bakterii gram‐ujemnych ‐ metody elektroforetyczne rozdzielające izoenzymy f komórkowe (Multilocus Enzyme Electrophoresis ‐ MLEE) ‐ różne odmiany immunoblottingu óż d i i bl tti
• Typowanie serologiczne oparte na reakcji antygen‐ przeciwciało i i ł 2
Analiza profili białkowych – techniki Analiza profili białkowych – elektroforetyczne Cząsteczki białek w polu elektrycznym migrują z szybkością ą p y y g ją y ą zależną od ich masy cząsteczkowej, wypadkowego ładunku, od ładunku zależy też ich kierunku ruchu. PAGE ‐‐ elektroforeza natywna PAGE Ograniczeniem jest: ‐potrzebna standaryzacja potrzebna standaryzacja ‐kompleksy białek dają profile trudne do interpretacji, y ‐stosunkowo słaba rozdzielczość metody.
3
Elektroforeza w obecności SDS (strefowa) • Zastosowanie SDS (dodecylu siarczan sodu) ‐substancji powierzchniowo czynnej ‐ przyczynia się do znacznego poprawienia rozdzielczości techniki elektroforetycznej poprawienia rozdzielczości techniki elektroforetycznej. • Potraktowanie cząsteczki białka przez SDS skutkuje powstaniem kompleksów białko ‐ SDS o ustalonym stosunku powstaniem kompleksów białko SDS o ustalonym stosunku ładunku elektrycznego do masy.
4
Obecność SDS przynosi szereg korzyści: ● zdecydowana większość białek jest d d i k ść bi ł k j rozpuszczalna w elektrolitach zawierających SDS, szczególnie po redukcji mostków disiarczkowych ● separacja białek odbywa się zgodnie z ich masami cząsteczkowymi z ich masami cząsteczkowymi ● barwienia kompleksów białko ‐ SDS jest znacznie wydajniejsze niż samego białka bi łk ● obecność SDS skutecznie eliminuje enzymatyczną degradację białek w trakcie separacji.
Rys. Podstawy biologii komórki, Bruce Alberts i in. PWN 1999
5
Schemat metody SDS‐ Schemat metody SDS Schemat metody SDS‐PAGE Dodanie SDS; podgrzanie białka
1
2
Naniesienie próbki białka na SDSPAGE ścieżka 2; ścieżka 1 – marker k molekularny l k l
SDS wiąże się do reszt aminokwasowych i nadaje ujemny ładunek po ładunek, podgrzaniu białka ulegają linearyzacji
6
Elektroforeza nieciągła Elektroforeza nieciągła • Połączenie izotachoforezy Połączenie izotachoforezy z elektroforezą strefową • Nośnik Nośnik elektroforetyczny składa się z elektroforetyczny składa się z dwóch kontaktujących się ze sobą części wypełnionych elektrolitami o różnym składzie i różnej wartości pH kł d i i óż j ś i (ang. discontinue electrophoresis or disc‐electrophoresis). p )
izotachoforeza
Elektroforeza strefowa
7
Detekcja żeli białkowych
Można w ten sposób znaleźć 1 μg białka w prążku prążku.
Coomassie Brillant Blue Metoda ta pozwala oznaczyć 10 ng białka w prążku. pą
Barwienie srebrem 8
Nowości - DualColor™ Protein Loading Buffer Pack (Fermentas F t Science) S i ) •
DualColor zapobiega degradacji białek DualColor™ zapobiega degradacji białek podczas podgrzewania próbek do SDS‐ PAGE jak i podczas prowadzenia elektroforezy.
•
W skład obciążnika wchodzą dwa barwniki: bromofenol blue oraz pironina Y, dzięki czemu można śledzić przemieszczanie się próbek podczas elektroforezy oraz Western blotting. Zawarty w DualColor™ SDS i DTT niszczy wyższe struktury białkowe. SDS przyłącza się do hydrofobowych regionów białka powodując rozwijanie struktury tym samym nadając ładunek ujemny DTT rozwijanie struktury tym samym nadając ładunek ujemny. DTT niszczy mostki dwusiarczkowe oraz pozostałe struktury dwurzędowe.
• • •
Zastosowanie: i Przygotowanie białek do SDS‐PAGE Monitorowanie transferu białek podczas Western blotting
•
Śledzenie próbek z DualColor™ Protein Loading Buffer Pack Zwiększona stabilność białka dzięki DualColor™ Protein Loading Buffer Pack M ‐ PageRuler™ Unstained Protein Lauder (#SM0661) 1,3 ‐ próbka białka przygotowana z DualColor™ Protein Loading Buffer Pack 2,4 ‐ próbka białka przygotowana z konwencjonalnym buforem obciążającym Leammli (pH 6.8) i DTT. Fermentas.
9
El k f Elektroforeza dwukierunkowa d ki k białek • Łączy w sobie dwie techniki: ogniskowanie izoelektryczne i elektroforezę SDS‐PAGE
10
Dwukierunkowa elektroforeza w żelu poliakryloamidowym Stabilny gradient pH
kwaśne
Migracja a SDS (m.cz. 10 -3
zasadowe
Rys. Podstawy biologii komórki, Bruce Alberts i in. PWN 1999
11
2D electrophoresis of periplasmic fractions of E. coli BL21(DE3)/pET30b-sygDraBE (A) and E. coli BL21(DE3)/pET30b (B). [n] indicates oligomers of the DraE protein resolved on the gel; 1 corresponds to a monomer of DraE, and 2, 3, 4, 5, and 6 correspond to a dimer, a trimer, a tetramer, a pentamer and a hexamer of DraE, respectively. In panel A at pH 9 and 30 kDa is a spot corresponding to the DraB protein. The IEF was performed with a linear pH 3 to 10 gradient as indicated at the top. top Separation by size was performed by using an SDS-12% polyacrylamide gel; the masses of compounds in a low-molecular-mass protein marker (Amersham Bioscience) are indicated between the gels. The gels were stained with silver.
Molecular Aspects of Biogenesis of Escherichia coli Dr Fimbriae: Characterization of DraB-DraE Complexes ; Rafał Piątek i in. Infection and Immunity, January 2005, p. 135-145, Vol. 73, No. 1
12
allozymy
Elektroforeza allozymów
Allel A
Locus 1 Allel B
izoenzymy Locus 2
Chromosomy homologiczne pojedynczego osobnika
Izoenzymy ‐ enzymy o tych samych funkacjach katalitycznych, ale różniących się składem aminokwasowym , są kodowane przez geny położone w różnych locus ; różnych locus Allozymy – warianty enzymu, które są kodowane przez różne allele tego samego locus 13
Technika MLEE (ang. Multilocus Enzyme Electrophoresis Electrophoresis) ) • Charakterystyka gatunków drobnoustrojów poprzez relatywną mobilność l bil ść elektroforetyczną ich dużej liczby enzymów komórkowych • •
Metoda służy do badania genetycznej zmienności (wyrażonej f fenotypowo) wewnątrz populacji bakterii oraz stopnia pokrewieństwa ) l ji b k ii i k i ń pomiędzy izolatami, populacjami i gatunkami Używa się do badania zmienności w populacjach bakterii z rodziny Escherichia, Salmonella, Legionella, Leishmania, Neisseria i Haemophilus
14
Technika MLEE Technika MLEE Technika 1. Różnicowanie szczepów metodą MLEE polega na względnej ruchliwości elektroforetycznej rozpuszczalnych w buforach wodnych izoenzymów komórkowych 2. Rozdział elektroforetyczny białek cytoplazmatycznych w żelu poliakryloamidowym w warunkach natywnych 3. Transfer na błonę 4. Reakcja błony ze związkami substratowymi specyficznymi dla danego enzymu (procedurę powtarza się każdorazowo dla każdego białka, w zależności od ilości badanych izoenzymów) 5 Uzyskujemy 5. Uzyskujemy charakterystyczny wzór mówiący o podobieństwach charakterystyczny wzór mówiący o podobieństwach i różnicach fenotypowych
15
MLEE
16 Dokumentacja KM PG
MLEE three enzymes (A) Mannitol 1-phosphate dehydrogenase in E. coli; 18 isolates. ((B)) Glucose 6-phosphate p p dehydrogenase in N. meningitidis; 19 isolates. (C) Malate dehydrogenase in E. coli; 14 isolates. Anodal direction of migration g from the origin is indicated by the Arrow.
Copyright © 1986, American Society for Microbiology Methods of Multilocus Enzyme Electrophoresis for Bacterial Population Genetics and Systematics ROBERT K. SELANDER,l* DOMINIQUE A. CAUGANT,' HOWARD 17 OCHMAN,2 JAMES M. MUSSER,’MARION N. GILMOUR,' AND THOMAS S. WHITTAM3
Wady MLEE: y • B Brak odtwarzalności w różnych laboratoriach k d l ś i óż h l b i h (problemy proceduralne) • Użyteczna w badaniach długoterminowych Uż b d i h dł i h (studiach epidemiologicznych globalnych) • mało czuła w badaniach epidemiologicznych ł ł b d i h id i l i h krótkoterminowych dla szczepów blisko spokrewnionych
18
