Analiza I Ocena Metod Badania Adhezji Bakterii Do Powierzchni

Transcript

Analiza i ocena metod badania adhezji bakterii do powierzchni metalowych o różnym składzie pierwiastkowych Żywicka A., Fijałkowski K., Nawrotek P. Studenckie Koło Naukowe Mikrobiologów, Katedra Immunologii, Mikrobiologii i Chemii Fizjologicznej, Zachodniopomorski Uniwersytet Technologiczny w Szczecinie, Szczecin Wstęp Materiały i metody Wiele drobnoustrojów posiada zdolność do adhezji do powierzchni metalowych. We współczesnej inżynierii materiałowej coraz częściej poszukuje się stopów metali, które wykazują właściwości antyadhezyjne wobec mikroorganizmów. Jednakże, badania adhezji na powierzchniach metalowych, ze względu na ich właściwości fizykochemiczne są często utrudnione. Materiał do badań stanowiło 12 płytek metalowych o różnym składzie pierwiastkowym (Tab.1). Adhezja oceniana była po inkubacji bakterii (Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, i Acinetobacter baumannii) z badanymi próbami metali. Do oceny stopnia adhezji wykorzystano następujące metody: test redukcji MTT, test AlamarBlue (test bezpośredni i pośredni), barwienie safraniną oraz posiewy powierzchniowe po inkubacji prób badanych w roztworze saponiny. Ponadto, ocenę liczebności bakterii na powierzchni prób dokonano przy użyciu mikroskopu fluorescencyjnego. Cel Celem niniejszej pracy była ocena stopnia adhezji bakterii do metalowych powierzchni o różnym składzie pierwiastkowym. Tab.1. Skład pierwiastkowy prób Wyniki Ryc.1. Próba ślepa z AlamarBlue. Intensywność koloru różowego jest proporcjonalna do ilości żywych komórek w zawiesinie. Badania wykazały, że pierwiastki wchodzące w skład powierzchni metalowych mogą reagować ze składnikami testów AlamarBlue i MTT dając reakcję podobną bądź taką sama jak żywe komórki bakterii. Największą reaktywnością charakteryzowały się próby, w których skład wchodził cynk - próby 1, 2, 3 (dołki 1A, 1B, 1C). A C B D Lp. 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. Powłoka próby Ocynk ogniowy, cynkowanie w temperaturze otoczenia Ocynk galwaniczny o Ocynk ogniowy, cynkowanie w temperaturze 250 C Fe/Ni5sCu10Nib10Crr Fe/Ni5sCu Fe/Ni 5sCuNi20dCrr Fe/Cu Fe/Ni10bCrr Fe/Ni20bCrr Fe/Ni5Cu10Nib10 Mosiądz manganowy MM59, (CuZn40Mn) Miedzionikiel MN25, (CuNi25) Gdzie: 20 – minimalna grubość powłoki niklowej (10m), d – jednowarstwowa powłoka niklowa o grubości minimum 10m, Crr – powłoka chromowa zwykła o minimalnej grubości 0,3m, s – powłoka jednowarstwowa niklowa matowa, 5s – minimalna grubość powłoki niklowej 5m, Cu10 – minimalna grubość powłoki miedzianej 10m. W dalszej części prezentowanej pracy kolejność prób została zachowana jak w tabeli 1. A B Ryc. 2. Testy pośrednie i bezpośrednie dla MTT (A, B) i Alamar blue (C, D). W płytce 96-dołkowej widoczne są 3 kolejne powtórzenia każdej z 12 prób. Testy MTT i AlamarBlue dawały prawidłowe wyniki tylko w przypadku wykonywania testu pośredniego. Pomimo braku żywych komórek w testach bezpośrednich uzyskiwano pozytywne wyniki. A B 100 80 60 40 20 0 Test pośredni AlamarBlue 40 % kontroli % kontroli Test pośredni MTT 1 2 3 4 5 6 7 8 Ryc. 5. Metoda posiewów dziesiętnych. Rozcieńczenie 10-4 dla Acinetobacter baumannii 30 20 10 0 9 10 11 12 1 Numer próby 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 Numer próby Test bezpośredni, barwienie safraniną C % kontroli 80 60 40 20 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Ryc.6. Badanie właściwości bakteriostatycznych. (A) zahamowany wzrost bakterii, (B) brak właściwości bakteriostatycznych. W metodzie posiewów dziesiętnych wyniki były zadowalające, jednak trudność stanowił dobór odpowiedniego rozcieńczenia. Przy dużej liczbie prób, ze względu na czasochłonność test może być mniej użyteczny. W dalszych badaniach wykazano właściwości bakteriostatyczne prób 1, 2 i 3, co przy metodzie posiewów powierzchniowych mogło wpływać na zafałszowanie wyników. 10 11 12 Numer próby Ryc.3. Ocena stopnia adhezji do powierzchni metalowych na przykładzie Acinetobacter baumannii. Test pośredni dla MTT (A) i AlamarBlue (B) oraz test bezpośredni dla testu barwienia safraniną. A B Ryc. 4. Barwienie safraniną 0,1%. Próby w skład, których wchodził cynk (1,2 i 3) cechowały się wysoką reaktywnością z kwasem octowym 30% wykorzystywanym w teście barwienia safraniną (A). Reakcja ta spowodowała zniszczenie powłoki cynkowej prób. W przypadku pozostałych prób nie zaobserwowano takiej reakcji (B). Ryc.7. Obraz z mikroskopu fluorescencyjnego, próba nr 1. Ryc.8. Obraz z mikroskopu fluorescencyjnego, próba nr 6. Przy zastosowaniu mikroskopu fluorescencyjnego nie było możliwe oznaczenie stopnia adhezji w próbach o zróżnicowanej powierzchni (Ryc.7). Tylko w przypadku prób o gładkiej i jasnej powierzchni było to możliwe (Ryc. 8). Wnioski Na podstawie badań można stwierdzić, że przy doborze metody badania adhezji do powierzchni metalowych należy kierować się ich składem, strukturą, zabarwieniem, stopniem utlenialności, wrażliwością na zmiany pH, a także reaktywnością z poszczególnymi składnikami wykorzystywanych w badaniach testów. Porównywalne wyniki uzyskano dla wszystkich wykorzystanych w doświadczeniu bakterii.