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Immeuble «Le Dufy» 1, Place de Turenne SAINT-MAURICE Tel : Fax : Stage effectué du 12 avril au 28 mai 2010 sous la responsabilité de Mme Florence Poty ANALYSE MICROBIOLOGIQUE DE L EAU J ai effectué ce stage au Centre d Analyses Environnementales situé à Saint-Maurice aussi appelé Laboratoire central. Sa mission est d analyser des échantillons d eau provenant de divers sites de prélèvement. Mon rôle était d effectuer différentes analyses sur des échantillons d eau provenant d usine de traitement et de canalisation domestique. Ces analyses ont pour but de vérifier la propreté microbiologique de l eau c'est-à-dire si celle-ci ne contient pas de micro-organismes pathogènes pour l Homme, conformément aux réglementations de la santé publique. I did this internship in Centre d Analyses Environnementales located in Saint-Maurice (94) also called Laboratoire central. Its mission is to analyze water samples taken from different sites. I had to analyse water samples from pipeline servant and plant treatment. These tests aim to control the microbiological cleanliness of the water, in order to determine if it is dangerous to humans, conformly to public health regulations. Année scolaire 2009/2010 L2 chimie Marie Méligne REMERCIEMENTS Je tiens à remercier : - Mme Florence POTY, responsable du service technique de microbiologie et de chimie et directrice adjointe du laboratoire, pour m avoir accueillie au sein de son service dans le cadre de mon stage. - Mme Stéphanie HOUDARD, responsable de l unité technique de microbiologie ainsi que Mme Sophie MOREAU, responsable de l unité technique légionelle pour leur disponibilité et pour m avoir encadré tout au long de mon stage. - Mme Aurore FAURE et Melle Marie-Ève BERCHERY, pour m avoir formée en bactériologie et en DAPI/CTC, ainsi que pour leur aide quotidienne pendant mon stage. - Toute l équipe de production du laboratoire d analyse pour leur accueil, leurs conseils, leur disponibilité et leur patience tout au long de mon stage : Isabelle BONANNI, Florian D ARCO, Sandra DA SILVA, Virginie DEL, Sophie DELGADO, Fabien GADY, Stéphanie HOUVET, Sébastien JEAN, Antoine JICQUEL, Benjamin LALOE, Emilie NATALI, Camille NEGRE. 2 P a g e SOMMAIRE Remerciements... 2 Sommaire... 3 Glossaire... 4 Introduction ) Présentation du Centre d Analyses Environnementales (CAE) ) Activités et organisation du laboratoire de Saint Maurice ) Le service microbiologie... 6 Matériel et méthode du service de bactériologie ) Matériel utilisé dans le laboratoire de microbiologie... 7 A. Les consommables et petits équipements... 7 B. Appareillage ) Méthode d analyse des divers échantillons... 7 A. Recherche des Entérocoques et des bactéries coliformes (Escherichia coli) par filtration... 8 B. Recherches des micro-organismes revivifiables... 8 C. Recherche et dénombrement des spores de micro-organismes anaérobies sulfito-réducteurs par filtration sur membrane... 8 Lectures et Repiquages ) Dénombrement des Entérocoques ) Dénombrement des coliformes et des Escherichia coli ) Dénombrement des micro-organismes revivifiable ) Dénombrement des spores de micro-organismes anaérobies sulfito-réducteurs Conclusion Bibliographie ) Sites internet ) Notices techniques Annexe Annexe Annexe 3 : Composition des divers milieux de culture Annexe 4 : Composition des divers milieux de repiquage Annexe 5 : Schéma simplifié des relations entre différents acteurs du domaine de l eau d alimentation P a g e GLOSSAIRE Anaérobiose : désigne la capacité d'un organisme ou micro-organisme à se développer en l absence oxygène AFNOR : Association Française de NORmalisation AFSSA : Agence Française de Sécurité Sanitaire des Aliments BEA : Gélose Esculine Azide CAE : Centre d Analyses Environnementales Catalase (positif ou négatif) : enzyme catalysant la dismutation de l eau oxygénée (peroxyde d hydrogène) CEN : Commissions Européen de normalisation COFRAC : COmité FRançais d Accréditation CSHPF : Conseil Supérieur d'hygiène Publique de France DASS : Direction des Affaires Sanitaires et Sociales GIE : Groupement d Intérêt Economique Gram (positif ou négatif) : les bactéries à Gram positif sont mises en évidence par une technique de coloration appelée coloration de Gram, elles apparaissent alors mauves au microscope. La technique de coloration repose sur les caractéristiques membranaires et de paroi de la bactérie ISO : International Organization for Standardization Oxydase (positif ou négatif) : enzyme catalysant la réaction d'oxydo-réduction impliquant une molécule de dioxygène, qui est réduit en eau H 2 O ou en peroxyde d'hydrogène. PCA : Plate Count Agar, milieu ordinaire, sans inhibiteurs, permettant la croissance de l'ensemble des bactéries PCR : Réaction en chaîne par polymérase (de l'anglais polymerase chain reaction), méthode de biologie moléculaire d'amplification d'adn in vitro TTC : Chlorure de Triphényl Tétrazolium, milieu de culture sélectif utilisé pour le dénombrement des bactéries coliformes TSC : Tryptose Sulfite Slanetz (gélose de) : milieu de culture sélectif utilisé pour le dénombrement des Entérocoques 4 P a g e INTRODUCTION L eau est essentielle à la vie et au bien-être. La quantité moyenne d eau contenue dans un organisme adulte est de 65 %. Or le corps humain ne peut la stocker : l homme doit donc chaque jour subvenir à ses besoins en eau. C est pourquoi elle a besoin d être protégée, traitée et économisée. De plus en raison de son caractère vital, l eau consommée doit être de bonne qualité sanitaire afin d éviter la survenue de certaines pathologies hydrique. Actuellement, les principaux risques sanitaires susceptibles d être engendrés par l ingestion de l eau du robinet sont de deux types : - Le risque microbiologique - Le risque chimique Des laboratoires d analyses tels que les Centres d Analyses Environnementales (CAE) de Veolia Environnement sont là pour procéder à un contrôle complet de l eau afin d assurer une bonne qualité et une protection de l environnement. Lors de mon stage, je me suis intéressée à ce premier type de risque. La recherche dans l eau de tous les micro-organismes potentiellement dangereux s avère irréaliste, tant pour des raisons techniques qu économiques. Ainsi, actuellement, la stratégie de contrôle repose sur la recherche de bactéries dites «germes témoins de contamination fécale», faciles à détecter, non directement pathogènes, mais dont la présence laisse supposer l existence de germes autrement dangereux. Le contrôle de la conformité de la qualité microbiologique de l eau porte sur la vérification de l absence d Escherichia coli et d entérocoques dans un échantillon de 100 millilitres d eau prélevé dans le cadre du contrôle sanitaire courant. Par ailleurs, la recherche de spores de bactéries anaérobies sulfito-réductrices telles que les Clostridium, dans le cadre du contrôle sanitaire renseigne sur l efficacité des systèmes de filtration. Les efforts menés par l ensemble des acteurs (collectivités, responsables de la production, financeurs, administrations, etc.) ont permis d améliorer fortement la qualité microbiologique des eaux au cours des dernières années. Ainsi, la proportion de population ayant été exposée à des eaux non conformes vis-à-vis de la qualité microbiologique a diminué de moitir depuis 2000 (4,4 % contre 8,8 % en 2006). 1) Présentation du Centre d Analyses Environnementales (CAE) Le Centre d Analyse Environnementales a été créé afin de regrouper les différentes activités analytiques du groupe Veolia Environnement, leader mondial des services de l environnement. Il est composé d un réseau de sept laboratoires répartis en France. Les laboratoires à Saint-Maurice, à Arras, à Caen, à Florange, à Lyon, à Rennes et à Toulouse. Il emploie environ 200 collaborateurs et traite environ échantillons par an. Le site de Saint-Maurice (94) se compose du Laboratoire Central, chargé des prestations analytiques de routine, d une équipe support (informatique, logistique, achat et administration), ainsi que de deux équipes de recherche, principalement responsables du perfectionnement des méthodes analytiques existantes et du développement de techniques innovantes, dans les domaines de la microbiologie et de la chimie. Les équipes du CAE ont pour mission d évaluer les besoins, les prélèvements et transports des échantillons, de l analyse, de la validation et de la restitution des résultats. Le domaine d expertise se situe au-delà des eaux propres et résiduaires, puisqu il recouvre l ensemble des domaines de l environnement : l'air, les déchets et combustibles et les matériaux. De plus, le laboratoire central doit s assurer de la conformité des opérations et propose un accompagnement et des services complémentaires. Ces prestations font du CAE un pôle d expertise reconnu de l analyse environnementale. Membre du GIE (Groupement d Intérêt Économique), il est accrédité par le COFRAC (COmité 5 P a g e FRançais d ACcréditation) dans les domaines de la mesure physico-chimique et de la microbiologie des eaux. Il est également membre des commissions de normalisation en France (AFNOR), en Europe (CEN) et au niveau international (ISO). 2) Activités et organisation du laboratoire de Saint Maurice Le laboratoire a pour mission de réaliser des analyses microbiologiques et physico-chimiques pour le contrôle de l'environnement. Les analyses effectuées se situent dans le domaine plus particulier de la qualité de l'eau, des boues et des déchets. Il existe quatre types d'échantillons différents reçus par le CAE qui proviennent de stations de distribution d eau potable, de rivières, de forage, ou encore de particulier : - Eaux propres : eaux destinées à la consommation - Eaux sales : rejets liquides d'usines, eaux non traitées - Déchets : résidus solides, déchets ménagers et industriels - Boues Le CAE de Saint Maurice comporte trois grands services : - Chimie minérale (Métaux lourds, Sels minéraux, Phénols, Détergents, Hydrocarbures, dosage d ions ) - Microbiologie (test de contamination, virologie, test de toxicité, analyse algologique, épifluorescence, saveurs, parasitologie ) - Chimie organique (Micro-polluant, composés phénoliques, solvants, résidus de pesticides ) 3) Le service microbiologie Le laboratoire d analyses microbiologiques traite chaque année échantillons. Selon la nature des échantillons et la demande faite par les clients, ils y subiront des analyses différentes. Ce service comprend une Unité Technique «Microbiologie» (bactériologie, parasitologie, algologie, virologie, bactériophage ) et une Unité «Legionelle» (méthode par culture et par PCR). Toutes ces analyses constituent un moyen de contrôler et de garantir la qualité de l eau pour le consommateur. Au cours de mon stage, j'ai donc pu évoluer dans le service de microbiologie dont voici l'organigramme : 6 P a g e MATÉRIEL ET MÉTHODE DU SERVICE DE BACTÉRIOLOGIE 1) Matériel utilisé dans le laboratoire de microbiologie Outre le matériel courant de laboratoire, la manipulation en laboratoire de microbiologie doit impérativement se faire de façon stérile pour éviter toutes sources de contamination extérieures des échantillons. Pour se faire on utilise donc le matériel suivant : A. Consommables et petits équipements Des rampes de filtration et frittés stérilisés à intervalles réguliers (plusieurs fois par jour au bec benzen et une fois par semaine à l autoclave) sur lesquelles on ajoute des membranes filtrantes stériles de porosité 0,45 µm, et des entonnoirs stériles en plastique. Des pinces permettant de saisir les membranes sans les altérer sont, elles aussi, régulièrement stérilisées à la flamme (Cf Annexe 1, figure 1). Lors des diverses manipulations, on peut être amené à se servir de pipettes pasteur stériles, de Tubes à essais PYREX gradués de 100 ml et 20 ml, de Bouchons en caoutchouc siliconé, mais aussi de boîtes de Petri en plastique stérile de 90 mm et de 55 mm de diamètre, ainsi que des pipettes graduées de capacité 10 ml, 5 ml et 2 ml stériles et à écoulement total. B. Appareillage Dans la salle, toutes les manipulations se font soit sous un plafond laminaire, une hotte à flux laminaire ou encore proche d une flamme pour assurer la stérilité de l environnement de l analyse. (Cf Annexe 1, figure 2) Sont aussi présents plusieurs bains marie. Un premier bain-marie réglé sur environ 100 C pour fondre les milieux pendant une heure maximum, et deux autres réglés à (45 ± 1) C et 50 C pour les maintenir en surfusion. Un dernier bain-marie, réglé à une température de (75 ± 5) C, pour la sélection des spores de bactéries anaérobies sulfito-réductrices de type Clostridium. Pour permettre à toutes les flores de se développer 4 types d étuves thermostatées sont présents. Des étuves réglées à (36 ± 2) C, d autres réglées à (22 ± 2) C, certaines à (44 ± 2) C, et enfin à (37 ± 2) C (Cf Annexe 1, figure 3). 2) Méthode d analyse des divers échantillons Pour mener à bien ces recherches bactériennes, le service effectue des analyses sur des échantillons d'eaux propres qui arrivent au cours de la journée dans des bouteilles en plastiques stériles de 500 ml. Le récipient utilisé pour le prélèvement contient du thiosulfate de sodium à raison de 10 mg afin de neutraliser un éventuel oxydant et le chlore. (Cf Annexe 1, figure 4) Les échantillons sont analysés le jour même ou au plus tard dans les 24 heures suivant le prélèvement pour limiter l expansion de la flore bactérienne. Les bactéries sont, les plus petits organismes unicellulaires connus, douées de métabolisme et capables de croître ainsi que de se diviser aux dépens de substances nutritives. Le contrôle bactériologique des eaux usées et distribuées consistent en la recherche des germes indicateurs et germes totaux : - Bactéries coliformes et Escherichia coli par filtration sur membrane selon la norme NF EN ISO Entérocoques intestinaux par filtration sur membrane selon la norme NF EN ISO Micro-organismes revivifiables à 36 C et à 22 C par inclusion selon la norme NF EN ISO Spores de bactéries anaérobies sulfito-réductrices par filtration sur membrane selon la norme NF EN ISO P a g e A. Recherche des Entérocoques et des bactéries coliformes (Escherichia coli) par filtration a. Les entérocoques Les entérocoques sont des bactéries à Gram positif et à catalase négative qui entraîne notamment des infections urinaires. Elles se multiplient en aérobie. Ainsi, la recherche des celles-ci dans un échantillon d eau passe par les étapes suivantes : 1. Filtration de 100 ml de l échantillon d eau sur membrane au travers d une membrane filtrante stérile de porosité 0.45 µm. 2. Dépôt de la membrane sur milieu gélosé sélectif contenant de l azoture de sodium destiné à inhiber la croissance des bactéries à Gram négatif (Slanetz). (Cf Annexe 1, figure 5) 3. Incubation pendant (44±4) heures à (36±2) C. b. Les bactéries coliformes Les coliformes sont des bactéries à Gram négatif et oxydase négative. Elles peuvent former des colonies en aérobiose sur un milieu de culture lactosé sélectif. La plus connue d entre elles est l Escherichia coli, qui peut entraîner gastro-entérites, infections urinaires, méningites, ou septicémies. La recherche de ces bactéries dans un échantillon d eau reprend le même mode opératoire que pour les entérocoques. À l exception du milieu sélectif utilisé qui est le T.T.C (Chlorure de Triphényl Tétrazolium). De plus, une seconde boîte avec une membrane supplémentaire est incubée à (44 ± 1) C pendant (44 ± 4) heures permettant la recherche des coliformes thermotolérants mais aussi évitant le problème de la flore interférente. (Cf Annexe 1, figure 6) Une autre méthode existe pour déterminer la présence de bactérie coliforme, toutefois celle-ci reste qualitative. Cette détection se fait grâce à des kits, appelés Colilert (détection des coliformes totaux). Ils offrent la possibilité de suivre la qualité de l eau en cours de traitement et permettent d agir plus rapidement, car le temps d incubation n est que de à (24 ± 1) heures. On met en évidence la présence de coliformes par l apparition d une couleur jaune/orangée. En présence de cette couleur, une lecture visuelle sous UV à 365 nm est réalisée : une fluorescence bleue mettra en évidence la présence d E. coli. (Cf Annexe 1, figure 7) B. Recherches des micro-organismes revivifiables Le principe de la recherche et du dénombrement des micro-organismes revivifiables dans un échantillon d eau, repose sur les étapes suivantes : 1. Ensemencement de 1 ml d échantillon d eau en boîte de pétri de 90mm de diamètre, le milieu de culture utilisé est le Plate Count Agar (PCA). 2. Incubation des boîtes à (36±2) C pendant (44±4) heures et à (22±2) C pendant (68±4) heures. Le milieu PCA étant très peu sélectif, on cherche ici à dénombrer le nombre de micro-organismes vivants présent dans l échantillon. (Cf Annexe 1, figure 8) C. Recherche des spores de micro-organismes anaérobies sulfitoréducteurs par filtration sur membrane Ces micro-organismes sont capables de sporuler, ces spores résistent à un chauffage de 15 minutes à (75±5) C. Ils sont capables de se développer à (37±1) C en (44±4) heures en anaérobiose, sur un milieu gélosé contenant des sels de fer. Le principe de la recherche et du dénombrement de ces micro-organismes est proche des autres modes 8 P a g e opératoires. 1. On sélectionne les spores bactériennes dans l échantillon par un chauffage au bain-marie à (75±5) C pendant 15 minutes, pour que les cellules végétatives soient détruites. 2. Filtration de ces 100 ml d échantillon au travers d une membrane filtrante stérile dont les pores présentent une dimension de 0.45 μm pour que les spores de bactéries soient retenues à l intérieur de la membrane filtrante. 3. Dépôt de la membrane à l envers sur un milieu de culture spécialement sélectif (gélose Tryptose sulfite). (Cf Annexe 1, figure 9) 4. L anaérobiose est créée par une seconde couche de ce milieu sur la membrane. 5. Incubation des boîtes à (37±1) C pendant (44±4) heures. 9 P a g e LECTURES ET REPIQUAGES 1) Dénombrement des Entérocoques Après 48 heures d incubation, on dénombre toutes les colonies présentant une couleur rouge caractéristique et pouvant être limitée à leur centre ou leur périphérie (Cf Annexe 2, figure 1). Toute membrane présentant ce type de colonie suspecte est transférée sur un milieu de confirmation qui est une gélose biliée à l esculine (BEA). Ce milieu permet l isolation sélectif des Entérocoques, car ils tolèrent jusqu à 40 % de bile contrairement à de nombreux autres germes et l azoture de sodium élimine toutes les bactéries Gram négatifs. Après deux heures dans une étuve à (44 ± 1) C, les colonies confirmées comme entérocoques présentent un halo noir traduisant l hydrolyse de l esculine en esculétine qui se lie avec le fer (Cf Annexe 2, figure 2). La réglementation française actuelle impose un seuil limite, stipulant qu aucun entérocoque ne soit présent dans un échantillon de 100 ml. 2) Dénombrement des coliformes et des Escherichia coli La lecture des bactéries coliformes peut se faire soit après 24 heures soient 48 heures d incubation. Ces bactéries sont identifiables grâce à leur couleur jaune-orange entourée d un halo jaune sur le milieu. Ce virement de couleur est dû au virage de l indicateur coloré, en effet, les coliformes transforment le lactose présent en acide lactique. (Cf Annexe 2, figure 3) Les colonies ainsi suspectées sont repiquées par étalement sur du PCA, si elles se sont multipliées après 24heures à (36±2) C, alors la propriété oxydase des coliformes sera vérifiée. (Cf Annexe 2, figure 4) En parallèle un deuxième test est effectué avec un bouillon tryptophane. Après incubation pendant 24 heures à (44±1) C, si de l indole s est formé, la présence d un E. coli est confirmé. (Cf Annexe 2, figure 5) La réglementation française impose que l eau distribuée ne contienne pas d Escherichia coli dans 100 ml d eau. 3) Dénombrement des micro-organismes revivifiable Ce dénombrement consiste au comptage de micro-organisme, par millilitre d échantillon, à partir du nombre de c
