Transcript
Химия растительного сырья С УДК : ХИМИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ФЛАВОНОИДОВ ПОЛЫНИ ГОРЬКОЙ (ARTEMISIA ABSINTHIUM L.), П. СИВЕРСА (A. SIEVERSIANA WILLD.) И П. ЯКУТСКОЙ (A. JACUTICA DRB.) Е.Н. Сальникова, Г.И. Калинкина *, С.Е. Дмитрук Сибирский государственный медицинский университет, Московский тракт, 2, Томск, (Россия) Исследован состав флавоноидов надземной части полыни горькой (Artemisia absinthium L.), п. Сиверса (A. sieversiana Willd.) и п. якутской (А. jacutica Drob.), произрастающих в Сибири. Методами последовательного извлечения и градиентной экстракции в колонках с силикагелем и полиамидом выделено 8 флавоноидов. Структура выделенных флавоноидов установлена хроматографическими, спектральными методами, сравнением с достоверно известными образцами. Из полыни горькой выделены артемизетин, изорамнетин, нарциссин; из п. Сиверса артемизетин, хризоспленетин, кемпферол; из п. якутской хризоспленетин, 5,7,4 -тригидрокси-3,3 - диметоксифлавон, кактицин, астрагалин. Введение Поиск новых видов лекарственного растительного сырья перспективен, прежде всего, среди близкородственных видов растений. Наиболее интересным в этом отношении по своему многообразию, распространению и сырьевым запасам является род полыни Artemisia L., который насчитывает в Сибири до 70 видов [1]. В медицинской практике используется в основном полынь горькая Artemisia absinthium L. Однако данные литературы свидетельствуют о широком применении в народной медицине систематически близких к п. горькой видов п. Сиверса A. sieversiana Willd. [2, 3] и п. якутской A. jacutica Drob. [4]. Известно, что фармакологические свойства растений рода полынь связывают с содержанием в них эфирного масла и сесквитерпеновых лактонов [5 8]. Вместе с тем особый интерес с этой точки зрения представлют фенольные соединения, в частности, флавоноиды, обладающие широким спектром биологической активности [9]. Флавоноиды полыней изучены недостаточно. Целью настоящей работы является выделение и химическое исследование флавоноидов систематически и морфологически близких видов полыни Artemisia absinthium, A. sieversiana и A. jacutica. * Автор, с которым следует вести переписку. 72 Е.Н. САЛЬНИКОВА, Г.И. КАЛИНКИНА, С.Е. ДМИТРУК Экспериментальная часть Растительный материал. Для выделения флавоноидов собирали надземную часть полыни горькой, п. Сиверса и п. якутской в фазу массового цветения растений в окрестностях г. Томска [1, 2] и в Якутии, в окрестностях с. Чурапчи [3], около жилья в августе 1991 г. Сырье сушили до воздушно-сухого состояния, упаковывали в двойные бумажные мешки и хранили в сухом прохладном месте. Гербарные образцы растений хранятся на кафедре фармакогнозии Сибирского государственного медицинского университета. Общие экспериментальные условия. Качественный состав флавоноидов исследуемых видов полыни изучали с помощью общепринятых методов и приемов фитохимического анализа: 1. В качестве экстрагента при получении суммарного экстракта использовали водный этанол; для очистки, разделения на фракции и выделения индивидуальных флавоноидов применяли методы избирательной жидкостной экстракции, адсорбционной колоночной хроматографии на силикагеле и полиамидном сорбенте, бумажной и тонкослойной хроматографии, дробной кристаллизации. 2. Для колоночной хроматографии (КХ) использовали силикагель 5/40 мк фирмы «Сhemapol» (Чехия), полиамидный сорбент фирмы «Woelm» (Германия); для тонкослойной хроматографии (ТСХ) пластины «Silufol UV-254» (Чехия); для бумажной хроматографии (БХ) бумагу марки «Filtrak» FN-1, 3, 5, 11 [10, 11]. 3. Для хроматографирования флавоноидов использовали системы растворителей: БХ 15% раствор кислоты уксусной; н-бутанол кислота уксусная вода (4 : 1 : 5); ТСХ хлороформ этанол (9 : 1). 4. На хроматограммах флавоноиды обнаруживали по характерному свечению в УФ-свете при длине волны 365 нм до и после обработки хроматограмм парами аммиака, 1%-ным спиртовым раствором алюминия хлорида [12]. 5. Кислотный гидролиз флавоноидных гликозидов проводили путем растворения 10 мг вещества в 10 мл 10% раствора кислоты серной с последующим нагреванием на кипящей водяной бане в колбе с обратным холодильником [13]. Ход гидролиза контролировали хроматографией на бумаге. Агликоны извлекали диэтиловым эфиром, который затем удаляли под вакуумом, остаток растворяли в этаноле. Кислый водный гидролизат нейтролизовали бария карбонатом, выделившийся осадок отфильтровывали, фильтрат упаривали досуха, остаток растворяли в 0,5 мл метанола и углеводы анализировали методом хроматографии на бумаге в системе растворитетелей н-бутанол кислота уксусная вода (4 : 1 : 2). Детектирование углеводных компонентов проводили бутанольным раствором анилинфталата с последующим прогреванием хроматограмм в сушильном шкафу при t = 105 С до проявления пятен [14]. 6. В качестве ионизирующих и комплексообразующих добавок для установления структуры флавоноидов применяли: 0,1 М раствор натрия этилата, натрия ацетат (плавленный), 4% раствор кислоты лимонной, 0,1% спиртовый раствор алюминия хлорида, 4% раствор кислоты борной [9]. 7. ИК-спектры выделенных веществ снимали на спектрофотометре «Specord-UR» с призмами LiF NaCl, в таблетках KBr высотой 1 мм при соотношении вещества и наполнителя 1:400 и в пленке [15]. УФ-спектры снимали на спектрофотометрах СФ-46, «Specord UV VIS» в кювете с толщиной слоя 10 мм, растворитель абсолютный этанол при концентрации вещества и [16]. ПМР-спектры снимали на приборе «Tesla BS-497» при 100 МГц (в СDCl 3 ) с ГМДС в качестве внутреннего эталона. ХИМИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ФЛАВОНОИДОВ ПОЛЫНИ ГОРЬКОЙ 73 Результаты и обсуждение Надземную часть полыней экстрагировали 80% этанолом при нагревании на водяной бане с обратным холодильником. Экстракт сгущали под вакуумом, обрабатывали горячей водой, осадок отфильтровывали с целью удаления липофильных веществ. Для выделения флавоноидов использовали последовательную экстракцию хлороформом, этилацетатом и н-бутанолом по схеме (рис.). После удаления экстрагента полученные фракции хроматографировали в колонках с соответствующим сорбентом. Хлороформную фракцию помещали в колонку с силикагелем. При элюировании хлороформом и последующей кристаллизацией из этанола выделили вещество 1. При разделении этилацетатной фракции в колонке с полиамидом хлороформно-спиртовыми смесями с градиентным увеличением концентрации последнего выделили три индивидуальных соединения. Вещество 2 получили при элюировании смесью хлороформ этанол в соотношении 9 : 1, вещество 3 1 : 9, вещество 4 1 : 19. При хроматографировании бутанольной фракции в колонке с полиамидом смесью этанол вода (4 : 6), (4 : 8), (2 : 8) выделены соответственно вещества 5 8. Схема разделения флавоноидов различных видов полыни 74 Е.Н. САЛЬНИКОВА, Г.И. КАЛИНКИНА, С.Е. ДМИТРУК Очистку веществ проводили рехроматографией в колонках с полиамидом и в тонком слое сорбента, препаративной хроматографией на бумаге и дробной кристаллизацией. Индивидуальность выделенных соединений контролировали двумерной хроматографией на бумаге. Для установления структуры выделенных веществ использовали данные ИК-, УФ-, ПМРспектроскопии, сравнение с достоверно известными образцами. В ходе идентификации в необходимых случаях проводили кислотный гидролиз. В ИК-спектрах выделенных соединений 1 8 имеются характерные для ароматической части флавоноидов полосы поглощения: см 1 (фенольные оксигруппы), см 1 (карбонильная группа γ-пирона), см 1 (скелетные колебания ароматических колец), а максимумы при см 1 свидетельствуют о наличии метоксильных групп. На основании качественных реакций с солями циркония и кислоты лимонной, а также окраски веществ на хроматограммах и по свечению в УФ-свете определяли принадлежность выделенных флавоноидов к флавонам и флавонолам [17]. Вещество 1 состава С 20 Н 20 О 8. Т пл С. Спектральными исследованиями в УФ-области установили наличие замещенных оксигрупп у С-3, С-4, С-6, С-7 и свободной оксигруппы у С-5. Отсутствие батохромного сдвига полос поглощения при добавлении ацетата натрия указывает на то, что гидроксильная группа у С-7 замещена. Незначительный батохромный сдвиг длинноволновой полосы в присутствии алюминия хлорида и хлористоводородной кислоты на 16 нм свидетельствует о наличии оксигруппы у С-5 и метоксигруппы у С-6. Данные ПМР-спектра обнаруживают сигналы при 3,97, 3,93,3,87 м.д. синглеты, соответствующие метоксигруппам [18]. ПМР-спектр (СДCl 3, δ м.д): 7,76 (д.,1н), 7,65 (с., 1Н), 7,01 (м.,1н), 6,45 (с.,1н), 5,34 (м., 1Н), 3,97(с.,9Н) ОСН 3, 3,93(с.,3Н) ОСН 3, 3,87 (с.,3н) ОСН 3. Данные УФ-спектроскопии с диагностическими реагентами, ИК- и ПМР-спектры, величины R f в различных системах растворителей согласуются с литературными данными артемизетина (5-гидроокси- 3,6,7,3,4 -пентаметоксифлавон) [19, 20] (табл. 1). Вещество 2 состава С 19 Н 18 О 8, Т пл С. При исследовании нейтрального спиртового раствора вещества в УФ-области имеются полосы поглощения при λ max 353, 271, 258 нм. Под влиянием этилата натрия обнаруживается батохромный сдвиг максимума поглощения I полосы на 59 нм, что указывает на положение свободной гидроксильной группы у С-4 [21]. Данные УФ-спектров с добавками позволяют предположить наличие оксигрупп у С-4 и С-5. ПМР-спектр (СДCl 3, δ м.д): 7,70(д.,1Н), 7,64(с.,1Н), 7,00(м.,1Н), 6,45(с.,1Н), 5,34(м.,1Н), 3,87 (с., 3Н) ОСН 3, 3,99(с.,3Н) ОСН 3, 3,97(с.,3Н) ОСН 3, 3,93(с.,3Н) ОСН 3. ИК-спектр (λ max, см 1 ) 3320, 1660, 1590, 1570, 1520, 1170, Сравнение УФ- и ИК-спектров, значение Rf, физико-химических свойств вещества 2 с 5,4 - дигидрокси-3,6,7,3 -тетраметоксифлавоном показало их тождественность, что характеризует выделенное соединение как хризоспленетин [17] (табл. 1). Вещество 3 состава С 17 Н 14 О 7, Т пл С. Спектральными исследованиями в УФ-области с диагностическими добавками установили наличие свободных гидроксильных групп у С-7, С-5, С-4. ХИМИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ФЛАВОНОИДОВ ПОЛЫНИ ГОРЬКОЙ 75 В ИК-спектре обнаружили полосы поглощения при см 1 (гидроксильные группы), 1660 см -1 (карбонильная группа γ-пирона), 1625, 1580,1520 см 1 (колебания ароматического ядра), максимумы при 2950, 2880 см 1 свидетельствуют о наличии в молекуле метоксильных групп [15]. В ПМР-спектре присутствуют сигналы при 3,72 и 3,85 м.д., подтверждающие присутствие в молекуле вещества двух метоксильных групп в ароматическом ядре. На основании данных УФ-, ИК-, ПМР-спектров, а также сравнения физико-химических констант с описанными в литературе [22] вещество 3 идентифицировали как 5,7,4 -тригидрокси диметоксифлавон (табл. 1). Вещество 4 состава С 16 Н 12 О 7, Т пл С. На основании физико-химических констант, УФ-, ИК-спектров и данных хроматографии на бумаге с подлинным образцом вещество 4 идентифицировали как 3,5,7,4 -тетраокси-3 -метоксифлавон (изорамнетин) (табл. 1). Вещество 5 состава С 15 Н 10 О 6, Т пл С. Физико-химические характеристики, спектральные характеристики вещества тождественны с достоверным образцом 3,5,7,4 -тетраоксифлавона (кемпферол) (табл. 1). Таблица 1. Структура флавоноидов, выделенных из полыней CH 3 CH 3 CH 3 CH 3 CH 3 CH 3 CH 3 Артемизетин CH 3 CH 3 Хризоспленетин CH 3 CH 3 H H CH 3 5,7,4'-тригидрокси-3,3'-диметоксифлавон Изорамнетин H H R Кемпферол R-глюкоза Астрагалин CH 3 CH 3 H H R R R-галактоза R-рутиноза Кактицин Нарциссин 76 Е.Н. САЛЬНИКОВА, Г.И. КАЛИНКИНА, С.Е. ДМИТРУК Вещество 6 состава С 21 Н 22 О 11, Т пл С. Темно-коричневая окраска пятна на хроматограмме в УФ-свете до гидролиза и желтая после гидролиза позволяет предположить, что соединение является производным флавонола с замещенной оксигруппой у С-3 [11]. Продуктами кислотного гидролиза являются D-глюкоза и агликон, УФ-спектр которого и хроматографические исследования с достоверным образцом согласуются с кемпферолом. Гликозидную природу вещества 6 подтверждает ИК-спектр: обнаружены три полосы поглощения в области см 1, принадлежащие колебаниям пиранозного кольца, а полосы поглощения при см 1 β-конфигурации гликозидной связи [15]. Данные УФ-спектров с использованием комплексообразующих добавок [14] подтверждают идентичность вещества 6 с кемпферол-3-0-β-dглюкопиранозидом (астрагалин) (табл. 1). Вещество 7 состава С 22 Н 22 О 12, Т пл С. Гидролизуется на D-галактозу и агликон, структуру которого установили спектральными исследованиями в УФ-области и хроматографическим сравнением с известным образцом изорамнетина. Использование диагносцирующих добавок позволило подтвердить наличие в молекуле анализируемого вещества свободных оксигрупп при С-5, С-7, С-4 и наличие углеводного заместителя в положении С-3. Конфигурацию гликозидной связи определяли методом ИКспектроскопии. Наличие трех интенсивных полос поглощения в области см 1 и полосы при 896 см 1 является признаком β-конфигурации гликозидной связи. Полосы в области см 1 указывают, что сахарный компонент связан с агликоном о-гликозидной связью [15]. Таким образом, вещество 7 идентифицировано как изорамнетин-3--β-d-галактопиранозид или кактицин (табл. 1). Вещество 8 состава С 28 Н 32 О 16, Т пл С. В продуктах кислотного гидролиза обнаружили и идентифицировали с достоверными образцами изорамнетин, D-глюкозу и L-рамнозу. Спектральными исследованиями в УФ-области установили наличие в структуре вещества замещенной оксигруппы при С-3 и свободных гидроксильных групп при С-5, С-7, С-4. ИК-спектры вещества 8 дают полосы поглощения в области см 1 (оксигруппы), 1660 см 1 (карбонильная группа γ-пиронового кольца), 1610 см 1 (валентные колебания двойных связей бензольных колец), максимум при 2940 см 1 свидетельствует о наличии метоксильной группы [15]. Сравнение физико-химических свойств вещества 8 с достоверным образцом изорамнетин-3-0-β-d-глюкопиранозил-6-0-l-рамнопиранозида (нарциссин) показало их идентичность [23] (табл. 1). Распределение флавоноидов, выделенных из исследованных полыней, по видам представлено в таблице 2. Таблица 2. Распределение флавонидов, выделенных из полыней, по видам вещества Название вещества Полынь горькая Полынь Сиверса Полынь якутская 1 Артемизетин Хризоспленетин ,7,4 -тригидрокси-3,3 -диметоксифлавон + 4 Изорамнетин + 5 Кемпферол + 6 Астрагалин + 7 Кактицин + 8 Нарциссин + ХИМИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ФЛАВОНОИДОВ ПОЛЫНИ ГОРЬКОЙ 77 Выводы 1. Методами последовательного извлечения и градиентной экстракции в колонках с силикагелем и полиамидом из надземной части полыни горькой, п. Сиверса и п. якутской, произрастающих в Сибири, выделено 8 веществ флавоноидной природы. 2. Структура выделенных соединений установлена хроматографическими, спектральными методами и сравнением с достоверно известными образцами. Из полыни горькой выделены и идентифицированы артемизетин, изорамнетин и нарциссин; из п. Сиверса артемизетин, хризоспленитин, кемпферол; из п.якутской хризоспленетин, 5,7,4 -тригидрокси-3,3 -диметоксифлавон, кактицин и астрагалин. Список литературы 1. Красноборов И.М. Artemisia L. // Флора Сибири. Новосибирск, Т. 13. С Березовская Т.П., Великанова В.И., Уралова Р.П. Полынь Сиверса полноценный заменитель полыни горькой // Некоторые вопросы фармакогнозии дикорастущих и культивируемых растений Сибири. Томск, С Гаммерман А.Ф., Кадаев Г.Н., Яценко-Хмелевский А.А. Лекарственные растения. М., с. 4. Макаров А.А. Растительные лечебные средства якутской народной медицины. Якутск, с. 5. Рыбалко К.С. Природные сесквитерпеновые лактоны. М., с. 6. Kelsey R.G., Shatizadeh F. Sesguiterpene lactones and systematics of the genus Artemisia // Phytochemistry Vol P Баженова Е.Д., Ашрафова Р.А., Алиев Х.У., Туляганов П.Д. Влияние арсулина и абсинтина на регенерацию экспериментальных язв желудка // Медицинский журнал Узбекистана С Таран Д.Д. Противовоспалительное и анальгетическое действие эфирных масел некоторых полыней, тысячелистника и хамазулена // Проблемы освоения лекарственных ресурсов Сибири и Дальнего Востока. Новосибирск, С Максютина Н.П., Литвиненко В.И. Методы выделения и исследования флавоноидных соединений // Фенольные соединения и их биологические функции. М., С Шаршунова М., Шварц В., Михалец И. Тонкослойная хроматография в фармации и биохимии. М., с. 11. Harborne I. Bi Comparative biochemistry of the flavonoids. London; New York, p. 12. Бандюкова В.А. Применение цветных реакций для обнаружения флавоноидов путем хроматографии на бумаге // Растительные ресурсы Т. 1. Вып. 4. С Chander R.F., Harper K.A. Identifikation of Saccharides in Anthcyamins and other Flavonoids // Austral. J. of Chem Vol P Методы исследования углеводов / Пер. с анг. В.А. Несмеянова; Под ред. А.Я. Хорлина. М., с. 15. Ковалев И.П., Титов Е.В. Инфракрасные спектры поглощения некоторых групп природных соединений: Атлас спектров. Харьков, с. 16. Перельсон М.Е., Шейнкер Ю.Н., Савина А.А. Спектры и строение кумаринов, хромонов и ксантонов. М., с. 17. Marbi N.I., Markham K.R., Thomas M.B. The sistematic identification of Flavonoids. New York, p. 18. Mareo I., Allerto, Barbera scar, Rodriguez Santiago, Domingo Concepcion. Flavonoides and other phenolics from Artemisia hispanica // Phytochemistry Vol P Чемесова И.И., Беленовская Л.М., Маркова Л.П. Фенольные соединения Artemisia sieversiana // Химия природных соединений С Rauter A., Branco I., Tonstao L. Flavonoids from Artemisia campestris Subsp.Maritima // Phytochemistry Vol P 78 Е.Н. САЛЬНИКОВА, Г.И. КАЛИНКИНА, С.Е. ДМИТРУК 21. Шинкаренко А.Л., Бандюкова В.А., Казаков А.Л. Методы исследования природных флавоноидов. Пятигорск, с. 22. Неделько Е.С., Никонов Г.К. Метиловые эфиры кверцетина Artemisia heptapotamica // Химия природных соединений С Ряховская Т.В., Сакко О.А. Флавоноиды Artemisia cina // Химия природных соединений С Поступило в редакцию 25 января 2001 г. После переработки 8 февраля 2001 г.
