Transcript
AZ INTRACELLULÁRIS HISZTAMIN SZEREPE DENDRITIKUS SEJTEK DIFFERENCIÁLÓDÁSA SORÁN. DENDRITIKUS SEJTEK SZUBPOPULÁCIÓINAK VIZSGÁLATA Dr. Szeberényi Júlia Program- és témavezető: Dr. Falus András, egyetemi tanár Budapest, 2001 BEVEZETÉS A hisztaminnak jelentős a szerepe különböző élettani és kórélettani folyamatokban: az allergiás válasz egyes lépéseiben, a vasodilatatioban, ér-permeabilitás növekedésében, simaizom-összehúzódásban, továbbá a gyomorsav termelésben, immunmodulációban és a neurotranszmisszióban. A hisztamin H 1, H 2 és H 3 membránreceptorokon keresztül fejti ki ezeket a hatásokat. A közelmúltban kimutatták, hogy a hisztamin nemcsak sejtfelszíni, hanem intracelluláris receptorokon is hat. Mint autokrin vagy intrakrin mediátor, szerepet játszhat a sejtproliferáció, differenciálódás, magzati fejlődés, a regeneráció és a sebgyógyulás szabályozásában is. A hisztamin képződését emlősökben kizárólag a hisztidin dekarboxiláz enzim (HDC) katalizálja, amely szinte minden sejtben kimutatható. Kísérleteink fő célja az intracelluláris hisztamin sejt-differenciálódást befolyásoló hatásának tanulmányozása volt. Ehhez modellként a dendritikus sejtek in vitro differenciálódását választottuk. A dendritikus sejtek professzionális antigén-prezentáló sejtek, amelyek az immunválasz kialakulásában fontos szerepet játszanak, mivel felveszik és átalakítják az antigéneket, majd bemutatják azokat a T-sejteknek, és kostimulátor molekulákkal serkentik a T-lymphocytákat. A sejtek hisztidin dekarboxiláz tartalmát flow cytometriával határoztuk meg. Előzőleg beállítottunk egy módszert a különböző fehérvérsejtek HDC-tartalmának mérésére. Ezt a módszert használva meghatároztuk egyes leukocyta-populációk és alcsoportok HDCtartalmának változásait kóros állapotokban. Vizsgáltuk azt is, hogyan hatnak a hisztamin és analógjai a leukocyták szuperoxid-termelésére. Dendritikus sejtek in vitro differenciálódása során különböző sejtfelszíni antigéneket és ezzel párhuzamosan a sejtek hisztamin- és HDC-tartalmának változását mértük, valamint vizsgáltuk a hisztamin-antagonistáknak a sejtfelszíni markerek expresszióját befolyásoló hatását. A vérben található kis egyedszámú dendritikus sejt-populációkat sejtfelszíni markereik alapján kívántuk jellemezni. 2 CÉLKITŰZÉSEK Hisztidin dekarboxiláz kimutatása a különböző humán fehérvérsejtpopulációkban és lymphocyta-alpopulációkban Az első kísérletsorozatban flow cytometria segítségével kívántuk meghatározni az intracelluláris hisztidin dekarboxiláz mennyiségét a fehérvérsejtek különböző populációiban. Kérdésünk az volt, hogy vannak-e kimutatható különbségek az egyes fehérvérsejt-populációk és lymphocyta-alpopulációk HDC-tartalmában. HDC-tartalom meghatározása egészséges donorok és bakteriális fertőzésekben szenvedő betegek lymphocyta populációiban A lymphocytákban kimutatható a hisztamin és a hisztidin dekarboxiláz enzim. A hisztamin immunmoduláló hatása ismert. A környező sejtekből felszabaduló hisztamin, illetve az intracelluláris hisztamin befolyásolhatja a lymphocyták aktiváltsági állapotát autokrin vagy intrakrin módon, ezért kísérleteinkben arra kerestünk választ, hogy van-e különbség az egészségesek és a bakteriális fertőzésben szenvedő betegek lymphocytapopulációinak HDC-tartalma között. Az intracelluláris hisztamin- és hisztidin dekarboxiláz-tartalom változásainak, valamint a sejtfelszíni markerek expresszió-változásának meghatározása monocyták in vitro dendritikus sejtekké, illetve macrophagokká történő differenciálódása során Kérdésünk az volt, hogy hogyan változik az intracelluláris hisztamin mennyisége a sejtek differenciálódása során. Ennek vizsgálatához modellként monocyták in vitro macrophag- illetve dendritikus sejt irányú differenciálódását választottuk. Ha monocytákat in vitro tenyésztünk, M-CSF jelenlétében macrophagokká, GM-CSF és IL- 4 jelenlétében dendritikus sejtekké differenciálódnak. 3 A monocyták dendritikus sejt- illetve macrophag irányú differenciálódása során sejtfelszíni markerek expressziójának változását párhuzamosan vizsgáltuk a hisztidin dekarboxiláz tartalommal és az intracelluláris hisztamin mennyiségével. Hisztamin-blokkoló anyagok hatásának vizsgálata sejtfelszíni markerek expressziójára a dendritikus sejtek in vitro differenciálódása során Következő kísérletsorozatunkban vizsgáltuk, hogy a hisztamin hatását gátló anyagok befolyásolják-e a dendritikus irányú differenciálódás folyamatát. H 1 -receptor antagonista triprolidinnel, H 2 -receptor antagonista tiotidinnel, DPPE-vel, ami az intracelluláris hisztamin kötőhelyhez kötődve gátolja a hisztamin odakapcsolódását, illetve a hisztidin dekarboxilázt irreverzibilisen blokkoló α- fluorometil-hisztidinnel kezeltük a sejteket, és a sejtfelszíni markerek megjelenésének változásait követtük áramlási cytometriával. A dendritikus sejtek vérben megjelenő szubpopulációinak vizsgálata A dendritikus sejtek különböző immunszervekben (lép, nyirokcsomók, tonsillák) vannak jelen, előalakjaik perifériás vérben is megtalálhatók. Kimutatásuk vérből nehéz, mert kis számban fordulnak elő és hiányoznak azok a sejtfelszíni markerek, amelyek kizárólag dendritikus sejtekre specifikusak. Korábban a vér mononuclearis phagocyta-sejtjeinek és a dendritikus sejteknek több alcsoportját azonosították. Ezekben a vizsgálatokban különböző módszereket használtak, így az alcsoportok közötti összehasonlítás nehézkes, vagy lehetetlen volt. Célunk az volt, hogy egészséges donorok véréből mononuclearis sejt-populációkat a sejtfelszíni markereik kombinációi alapján jellemezzünk és azonosítsunk áramlási cytometriával. Ezeket a kísérleteket teljes vérmintán végeztük, ez a megközelítés hasonlít legjobban az in vivo állapothoz. A keringő dendritikus sejt-prekurzorok mennyisége és egymáshoz viszonyított arányuk a különböző kóros állapotokban megváltozhat. Vizsgálatunk kiindulási alapot adhat a kóros állapotokban megváltozott dendritikus sejt-populációk fenotípus- és funkcionális elemzéséhez. 4 Hisztamin és különböző hisztamin-agonisták hatása fehérvérsejtek NADPH-oxidáz aktivitására Granulocytákban és monocytákban stimuláció hatására a NADPH-oxidáz enzim aktiválódik és szuperoxid anion keletkezik molekuláris oxigénből. A szuperoxid anionból reaktív oxigéngyökök képződhetnek. A gyulladás helyszínén a reaktív oxigéngyökök hisztamin felszabadulását idézhetik elő a hízósejtekből. Emellett a leukocyták maguk is képesek hisztaminszintézisre, mint azt előzőleg kimutattuk. Kísérleteinkben arra kerestünk választ, hogy van-e hatása a hisztaminnak a fehérvérsejtek oxidatív burst-aktivitására, és amennyiben igen, melyik hisztaminreceptor vesz részt a folyamatban. MÓDSZEREK A legtöbb mérést flow cytometriával végeztük. A különböző fehérvérsejt-populációk hisztidin dekarboxiláz tartalmának meghatározásához alvadásában heparinnal gátolt vért használtunk. A vérminták egészséges felnőtt donoroktól és szisztémás bakteriális fertőzésben szenvedő betegektől származtak, a betegek vérmintáit a budapesti Szent László Kórház Mikrobiológiai Osztályáról kaptuk. Az intracelluláris hisztidin dekarboxiláz indirekt flow cytometriás kimutatási módszerét laboratóriumunk dolgozta ki melanoma sejtvonalakon. Leukocytákon is beállítottuk a hisztidin dekarboxiláz mérésének flow cytometriás módszerét. A sejtfelszíni jelölést követően a mintákat fixáltuk, majd permeabilizáltuk, ezután csirke HDC-ellenes antitesttel jelöltük. Két poliklonalis antitestet használtunk: a és a aminosavak által meghatározott epitopok ellen termeltetett antitesteket. Nyúlban termeltetett, FITC-cel jelölt anti-csirke antitestet használtunk második antitestként. A mérést és az adatok analízisét Coulter Epics Elite (software: Elite 4.01), illetve Becton Dickinson FACSCalibur (software: Cell Quest 3.1) flow cytometerrel végeztük. 5 Következő vizsgálatunkban dendritikus sejtek in vitro differenciálódása során az intracelluláris hisztamin- és hisztidin dekarboxiláz-tartalom változásait, valamint a sejtfelszíni markerek expresszió-változását határoztuk meg. Egészséges önkéntesektől leukaferezissel nyert fehérvérsejtekből standard elutriációs módszerrel nagy tisztaságú monocyta-szuszpenziót állítottunk elő. A sejteket 7-14 napig Macrophage-SFM mediumban tenyésztettük. A dendritikus sejt-irányú differenciáltatáshoz recombináns humán granulocyta-macrophag kolónia-stimuláló faktor (GM-CSF) és rekombináns humán interleukin-4 (IL-4) jelenlétében tenyésztettük a monocytákat, a macrophag irányú differenciáltatáshoz rekombináns humán macrophag kolónia-stimuláló faktort (M-CSF) adtunk a sejtekhez. A sejteket a hisztamin hatását blokkoló anyagokkal H 1 -receptor antagonista triprolidinnel, H 2 -receptor antagonista tiotidinnel, DPPE-vel, ami az intracelluláris hisztamin kötőhelyhez kötődve gátolja a hisztamin oda-kapcsolódását, illetve a hisztidin dekarboxilázt irreverzibilisen blokkoló α-fluorometil-hisztidinnel kezeltük. Az elutriálás napján, és a sejttenyésztés első, második, harmadik, ötödik, hetedik, kilencedik, tizenkettedik és tizennegyedik napján mind a kezelt, mind a kontroll sejteket különböző, fluoreszcensen jelzett antitestekkel jelöltük sejtet inkubáltunk a sejtfelszíni antitestek kombinációival. A következő markereket vizsgáltuk: CD80 (B7.1) és CD86 (B7.2) kostimulációs molekulák, CD14 (LPSreceptor), CD16 (Fcγ receptor III), CD33 (myeloid marker), CD45 (minden leukocytán jelenlevő marker), CD123 (IL3-receptor α-lánc), HLA-DR (MHC II), CD11c (β 2 - integrin α-lánc) és CD40. Két- és négyszínű jelölést végeztünk. A hisztidin dekarboxiláz indirekt flow cytometriás kimutatása a korábbiakhoz hasonlóan történt. Az intracelluláris hisztamin flow cytometriás kimutatásához a sejteket karbodiimid-paraformaldehid keverékben fixáltuk, szaponinos permeabilizálás után nyúl hisztamin-ellenes antitesttel jelöltük, második antitestként FITC-cel jelzett kecske antitestet használtunk. A mintákat a jelölés után néhány órán belül mértük. Mintánként leukocytát vizsgáltunk FACSCalibur flow cytometerrel (Becton Dickinson). Az analízist CellQuest 3.2 software-rel végeztük. 6 A hisztidin dekarboxilázt western blot analízissel is kimutattuk. A HDC mrns-t reverz transzkriptáz-polimeráz láncreakcióval, a HDC expressziójának mértékét kompetitiv RT-PCR-rel mutattuk ki. A mononuclearis sejtek szubpopulációinak vizsgálatához egészséges egyénektől származó vért használtunk. Ezeket a kísérleteket teljes vérmintán végeztük, azaz nem szeparáltuk a mononuclearis sejteket. A módszer előnye,hogy mivel nincsenek szeparálási lépések, a sejtek nem aktiválódnak, nincs szelektív sejtvesztés, ez a megközelítés hasonlít tehát legjobban az in vivo állapothoz. 100 µl teljes vérhez négy különböző festékkel (FITC, PE, PerCP, APC) jelzett, sejtfelszíni markerek ellen termeltetett antitestek kombinációit adtuk. Csövenként legalább fehérvérsejtet mértünk FacsCalibur (Becton Dickinson) flow cytometerrel. Az adatok analízisét CellQuest 3.1.f és Paint-A-Gate software-ekkel végeztük. A különböző leukocyta populációkat a sejtfelszíni markerek expressziója alapján határoztuk meg. A hisztamin és agonistáinak oxidatív burst-re gyakorolt hatásának vizsgálatához teljes vérből származó fehérvérsejteket és szeparált mononuclearis sejteket használtunk. A szeparált mononuclearis sejteket Ficoll-grádiens-centrifugálással nyertük, majd a Ficollt kimostuk a sejtekből. A NADPH-oxidáz aktivitást dihidrorodamin-123 intracelluláris oxidációjával mértük FACScan (Becton Dickinson) flow cytometerrel. EREDMÉNYEK Hisztidin dekarboxiláz kimutatása leukocytákban Beállítottuk a hisztidin dekarboxiláz flow cytometriás mérési módszerét fehérvérsejteken. A vizsgált leukocyta-populációkban (granulocyták, monocyták, T h -, T c -, B-lymphocyták, NK-sejtek) kimutattuk a hisztidin dekarboxiláz jelenlétét mind a 7 kétféle antitesttel és mennyiségi különbségeket találtunk az egyes lymphocytapopulációk HDC-tartalmában. Egészségesekben a B-lymphocytákban a legnagyobb a hisztidin dekarboxiláz mennyisége, kevesebb HDC van a helper T-lymphocytákban, a cytotoxikus T-sejtekben és az NK-sejtekben. Bakteriális fertőzésekben szenvedő betegek lymphocyta-alcsoportjainak HDCtartalma Szisztémás bakteriális fertőzésben szenvedő betegek lymphocyta-populációinak HDCmennyisége és eloszlása különbözik az egészséges egyénekétől. Ezekben a betegekben a helper, illetve a cytotoxikus T-lymphocytákban találtuk a legmagasabb HDCtartalmat. Egészségesek helper, illetve cytotoxikus T-lymphocytáiban a HDC-koncentrációt jellemző görbe egycsúcsú. Bakterialis fertőzésben a fluoreszcencia intenzitás két csúcsú megoszlási görbét eredményez. Bakteriális fertőzésben a T-lymphocyták populációja heterogénné válik, jól elkülönül egy kisebb és egy nagyobb HDC-tartalmú alcsoportra. Nem tudjuk, hogy a magasabb HDC-tartalmú alcsoport a T-lymphocyták aktiváltsági állapotával, differenciálódási, illetve proliferációs képességével függ-e össze. Eredményeink arra utalhatnak, hogy a hisztamin résztvesz a bakteriális fertőzésre adott immunválaszban, azt közvetlenül befolyásolja, illetve lokálisan módosítja citokinek felszabadulását, így indirekt módon szabályozza az immunválaszt. Monocyták in vitro differenciálódása során az intracelluláris hisztamin- és hisztidin dekarboxiláz-tartalom változásainak, valamint a sejtfelszíni markerek expresszió-változásának meghatározása A hisztidin dekarboxiláz mennyisége és a hisztamin-tartalom párhuzamosan nőtt a dendritikus sejtek in vitro differenciálódása során, a maximumot az ötödik napon érte el. Hasonló változásokat figyeltünk meg a monocyták in vitro macrophag irányú differenciálódása során is. 8 A HDC-tartalom változását mind flow cytometriával, mind western blot analízissel kimutattuk, a hisztidin dekarboxiláz- és a hisztamin-szint párhuzamos változását flow cytometriával mértük. A HDC mrns mennyiségének emelkedése megelőzte a HDC-protein szintjének emelkedését, amint ezt az elutriálás napján és egy nap múlva elvégzett RT-PCR eredményeink mutatják. A monocyták in vitro dendritikus irányú differenciálódását tíz különbönző sejtfelszíni marker (CD80, CD86, CD14, CD16, CD33, CD45, CD123, HLA-DR, CD11c CD40) expresszió-változásának mérésével követtük. Hisztamin-blokkolók hatása a sejtfelszíni markerek expressziójára dendritikus sejtek differenciálódása során Az in vitro differenciálódó dendritikus sejteket a hisztamin hatását blokkoló vegyületekkel kezeltük, és különböző sejtfelszíni markerek expresszióját vizsgáltuk. A sejtfelszíni markerek előzőleg megfigyelt változásait kiindulási alapként használtuk ezekhez a kísérletekhez. Megállapítottuk, hogy valamennyi vizsgált hisztamin-blokkoló anyag csökkentette a CD40 sejtfelszíni expressziójának növekedési ütemét. A H 2 receptor antagonista tiotidin (és kisebb mértékben a H 1 receptor-blokkoló triprolidin) csökkentette a CD45 molekulák expresszióját. Ez arra mutat, hogy a lokálisan keletkező hisztamin befolyásolja a CD40 és CD45 sejtfelszíni expresszióját. Az intracelluláris hisztamin-kötőhelyekhez kapcsolódó N,N-dietil-2-[4(fenilmetil)- fenoxi]-etánamin (DPPE) a tíz vizsgált markerből hat differenciálódási antigén: a CD40, CD86, CD45, CD33, HLA-DR és CD11c sejtfelszíni expresszióját csökkentette. A legnagyobb mértékű gátlást a tenyésztés ötödik napján figyeltük meg, amikor a HDC expressziója a legmagasabb volt. Az in vitro differenciálódó dendritikus sejtekkel végzett eredményeink szerint az intracelluláris hisztamin tartalom a hisztidin dekarboxiláz mennyiségével párhuzamosan nő a monocyták dendritikus irányú differenciálódása során, és a hisztamin hatását gátló anyagok módosítják az érés folyamatát. 9 Dendritikus sejt-szubpopulációk sejtfelszíni markereinek vizsgálata perifériás vérből A vérben keringő mononuclearis sejt-populációk sejtfelszíni markereinek flow cytometriás vizsgálatával hat különböző szubpopulációt különítettünk el, amelyek közül két kisméretű dendritikus sejt-prekurzor csoportot tudtunk megkülönböztetni. A vérben keringő dendritikus sejt-prekurzorok mennyiségi változásainak vagy fenotípus-eltolódásainak kórélettani jelentősége lehet a különböző kóros állapotokban. Hisztamin és különböző hisztamin-agonisták hatása fehérvérsejtek NADPH-oxidáz aktivitására Granulocytákban és monocytákban a hisztamin önmagában képes volt stimulálni az oxidativ burst-öt. Nagyobb mértékű stimuláló hatást mutattunk ki a H 2 -receptor agonista amthamin alkalmazásával. KÖVETKEZTETÉSEK A hisztaminnak, amely a citokinek termelését lokálisan befolyásolhatja illetve azok hatásait módosíthatja, szerepe van a differenciálódás folyamatában. A hisztamin gyakorlatilag minden sejtben kimutatható, így a leukocytákban és a monocytákból in vitro differenciálódó macrophagokban és dendritikus sejtekben is. Az intracelluláris hisztamin mennyisége nő a monocyták dendritikus irányú differenciálódása során és a hisztamin hatását gátló anyagok az érés folyamatát módosítják. Ez arra utal, hogy a hisztaminszint növekedése nem csak passzív, másodlagos folyamat a differenciálódás során, hanem a képződő hisztamin is aktívan befolyásolja, elősegíti a sejtek érését. A dendritikus sejtek prekurzorai megjelennek a perifériás vérben, ezen kis sejtpopulációk kimutatása és azonosítása összehasonlításul szolgálhat olyan későbbi vizsgálatokhoz, amelyekben ezeknek a populációknak mennyiségi és funkcionális változásait követhetjük kóros állapotokban. 10 AZ EREDMÉNYEK ÖSSZEFOGLALÁSA 1. Beállítottuk a hisztidin dekarboxiláz flow cytometriás mérési módszerét fehérvérsejteken, és mennyiségi különbségeket mutattunk ki az egyes lymphocyta-populációk HDC-tartalmában. 2. Szisztémás bakteriális fertőzésben szenvedő betegek lymphocyta-populációinak HDC-mennyisége és eloszlása különbözik az egészséges egyénekétől. 3. Monocyták in vitro dendritikus sejt, illetve macrophag-irányú differenciálódása során mértük a sejtek hisztidin dekarboxiláz- és hisztamintartalmát a sejtfelszíni markerek változásával együtt. A HDC- és hisztamintartalom párhuzamosan emelkedett monocyták in vitro dendritikus sejtekké differenciálódása folyamán. 4. In vitro differenciálódó dendritikus sejteket a hisztamin hatását blokkoló vegyületekkel kezeltünk, és különböző sejtfelszíni markerek expresszióját vizsgáltuk. Azt találtuk, hogy a hisztamin hatását blokkoló anyagok a differenciálódás folyamatát módosítják. 5. A vérben keringő mononuclearis sejt-populációk sejtfelszíni markereinek flow cytometriás vizsgálatával hat különböző szub-populációt különítettünk el, amelyek közül két dendritikus sejt-prekurzor csoportot tudtunk megkülönböztetni. 6. A hisztamin a leukocyták oxidativ burst aktivitását a mi kísérleti rendszerünkben fokozta, nagyobb stimulációt értünk el a H 2 -agonista amthamin alkalmazásával. 11 KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS Köszönettel tartozom prof. Dr. Falus András akadémikusnak, a Genetikai, Sejt- és Immunbiológiai Intézet igazgatójának, program- és témavezetőmnek, aki kutatómunkámat kezdettől segítette és támogatta, Dr. Pállinger Évának, aki megtanított a flow cytometria elméleti és gyakorlati alkalmazására és nagyon sok hasznos tanáccsal szolgált, Reichenbach Tamásnak, a Becton Dickinson cég képviselőjének, akihez bármikor fordulhattam bármilyen flow cytometriai technikai kérdéssel. Dr. László Valériának értékes együttműködéséért. Kísérleteim nagy részét a Regensburgi Egyetem Klinikai Kémiai Intézetében végeztem, DAAD-ösztöndíj keretében. Köszönöm prof. Dr. Gerd Schmitznek, Dr. Gregor Rothenek, és Dr. Orsó Evelinnek, hogy javaslataikkal, ötleleteikkel segítették a munkámat. Köszönettel tartozom prof. Dr. Ligeti Erzsébetnek és Dr. Geiszt Miklósnak, akik az Élettani Intézetben tudományos diákkörösként a kutatás örömét megismertették velem, Kozák Angélának, Farkasné Nagy Krisztinának, Ördögh Juditnak és Balázs Istvánnénak a módszerek megtanításáért és a kísérletekben nyújtott technikai segítségükért, a Semmelweis Egyetem Genetikai, Sejt- és Immunbiológiai Intézet munkatársainak az évek során nyújtott tanácsaikért és azért, hogy az Intézetben mindig barátsággal és szeretettel vettek körül. A TÉMÁBAN MEGJELENT KÖZLEMÉNYEK JEGYZÉKE I. Szeberényi JB, Pállinger É, Todoro
