Transcript
Indiana Journal of Experimental Biology Vol.49, luglio 2011, pp 547-551
Azione sinergica di piperacillina e metilgliossale contro Pseudomonas aeruginosa Sayanti Mukherjeea, Shaswati Chakia, Sukhen Dasb, Saswati SENC, Samir Kr. Duttac & Sujata G. Dastidara * Department of Microbiology, Herbicure Healthcare Bio-Herbal Research Foundation, 7&8 Metro Garden City, D.H. Road, Pailan, Kolkata 700 104, India Department of Physics, Jadavpur University, Kolkata 700 032, India Division of Drug Development/Diagnostics and Biotechnology, Indian Institute of Chemical Biology, (IICB) CSIR, Kolkata 700 032, India Ricevuto il 12 ottobre 2010, modificato il 28 Mar 2011
Il metilgliossale composto di dicarbonilici è un componente naturale del miele di Manuka prodotto dai fiori di Manuka della Nuova Zelanda. Possiede sia attività antitumorale che antibatterica. Queste caratteristiche hanno sollecitato una indagine per osservare la capacità di metilgliossale come potente medicina contro la multiresistenza ai farmaci di Pseudomonas aeruginosa. Un totale di 12 test di P. aeruginosa isolati in vari ospedali sono stati testati per la loro resistenza contro molti antibiotici, la maggior parte dei quali trova applicazione nel trattamento delle infezioni da P. aeruginosa. I risultati hanno rivelato che i ceppi erano resistenti a molti farmaci ad alti livelli, solo piperacillina, carbenicillina, amikacina e ciprofloxacina hanno mostrato resistenze a livelli relativamente bassi. A seguito di sperimentazioni multiple è stato osservato che metilgliossale ha anche una azione antimicrobica contro tutti i ceppi di livelli comparabili. Sinergismo distinto e statisticamente significativo è stato osservato tra metilgliossale e piperacillina tramite diffusione a disco se confrontati con i loro singoli effetti. L'indice di concentrazione inibente frazionale di questa combinazione valutata mediante analisi a scacchiera, era di 0,5, che ha confermato sinergismo tra la coppia. Sinergismo è stato anche notato quando metilgliossale è stato combinato con carbenicillina e amikacina. Il crescente problema della multi-resistenza ai farmaci (MDR) dell'agente patogeno umano Pseudomonas aeruginosa è stato studiato e discusso estensivamente. La ricerca è in atto per combattere questo letale patogeno che può essere fatale se inserito in un sistema immunitario in disordine. Ci sono state molte indagini sulla scoperta e l'applicazione di nuovi antibiotici, singoli e in combinazione, ma i molteplici fattori di virulenza presenti in P. aeruginosa cercano continuamente di sviluppare modi e mezzi per superare la loro applicazione. Il continuo alto tasso di mutazione unito ad altri fattori hanno portato a ll'insorgenza di ceppi MDR. Da questo, la ricerca di composti diversi, diversi antibiotici che possano essere efficaci contro la P. aeruginosa MDR, per aprire un nuovo percorso nella sua storia di patogenesi e trattamento. Metilgliossale (Mg) che è una forma aldeide di P. aeruginosa, prodotto finale dell'acido piruvico può essere ottenuto come componente naturale del miele di Manuka. Si tratta di un particolare tipo di miele ottenuto dai fiori di Manuka, che in genere cresce in Nuova Zelanda avente una proprietà altamente
antimicrobica. Anche se l'attività antibatterica di metilgliossale è stata chiarita, sono necessarie ulteriori ricerche. Piperacillina (Pp), che è uno dei farmaci di recente adozione contro potenziali agenti patogeni Gram-negativi è un antibiotico che può essere somministrato da solo in infezioni pseudomonas. Ma con l'ampia crescita dei ceppi MDR, l'attività e l'efficacia di piperacillina è in diminuzione costante. Di qui il presente studio è stato progettato per stimare la potenza di metilgliossale isolato e in combinazione con piperacillina contro i recenti isolati umani insieme con un ceppo standard di P. aeruginosa per la valutazione di una possibile combinazione sinergica. Materiali e Metodi Batteri- Un totale di 12 ceppi di patogeni P. aeruginosa sono stati presi per questo studio. Di questi ATCC 27853 sono stati inviati da American Type Culture Collection, USA, AMRI 100, BVC 1, BVC 2, BVC 3, BVC 4 e 5 BVC sono campioni molto recenti di gravi infezioni sistemiche e C15, C17, PS7, APC1 e 732 sono stati raccolti negli ultimi due anni dalle infezioni polmonari acute a Calcutta. Agenti- Una soluzione acquosa al 40% di metilgliossale è stata acquistata da M.P. Biochemicals , USA. Gli antibiotici sono stati acquistati sia sotto forma di polvere secca dalle varie industrie farmaceutiche in India e i dischi di antibiotici sono stati acquistati da Pathotek Biological Labs, India ; i dischi contenenti 200 mM di metilgliossale sono stati preparati in laboratorio. Supporti- I liquidi utilizzati sono brodo nutritivo (NB, Oxoid), acqua peptonata (PW) contenente 1% peptone (Oxoid), più 0,5% di NaCl (AnalaR) e Mueller Hinton Broth (MHB, Oxoid). I nutritivi solidi sono stati l'agar nutritivo (NA, Oxoid) e Mueller Hinton Agar (MHA, Oxoid). Minima concentrazione inibente (MIC) di P. aeruginosa contro gli antibiotici e metilgliossale. L'esperimento è stato condotto secondo le linee guida di Clinical Laboratory Standard Institute (CLSI, 2010) inoculando 105 ufc con l'aiuto di un loopfull 2mm di diluizione 1/10 del 18 brodo nutriente su piastre NA e MHA contenenti 0, 50, 100, 200, 500, 1000, 1500, 2000, 3000 mg/ml di antibiotici e 0, 100, 200, 500, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000 livelli microM di metilgliossale, le diluizioni in corso sono state fatte in acqua distillata sterile. Tutti i ceppi da test sono stati inoculati nello stesso modo su piatti NA e MHA, e osservando dopo 24 ore e fino a 72 ore Il livello massimo di crescita di un farmaco considerata come il livello di resistenza contro un particolare ceppo mentre la dose successiva è stata presa da MIC di piperacillina e metilgliossale rispettivamente. Metodo di sinergismo in vitro- Gli effetti combinati di un antibiotico e metilgliossale sono stati determinati tramite il metodo di diffusione a disco con dischi sterili di carta filtrata (7,25 mm, Whatman n. 1) ciascuno contenente 100 mg di un antibiotico o 200 mM di metilgliossale. Ogni ceppo batterico è stato coltivato in MHB per 4 ore fino a che non ha raggiunto la fase logaritmica di crescita, poi sono stati immersi su supporti solidi in triplice copia, e le piastre sono state essiccate a 37 ° C per 2 ore, i dischi impregnati di farmaco sono stati collocati sulla superficie agar, incubate a 37 ° C durante la notte e sono state misurate le zone di inibizione. A seconda del risultato, i dischi contenenti metilgliossale e un antibiotico, sono stati immessi sui piatti preparati in modo tale che i loro circoli inibitorii si toccassero tangenzialmente. Sono stati registrati sia il diametro delle zone di inibizione e quelli effetti dovuti alla combinazione reciproca sul la stessa piastra. L'aumento della superficie (πr2) a causa di una combinazione di effetti è stato statisticamente valutato dal test Chi-square. La superficie media della zona di inibizione (mm2) è stato calcolato come πr2 sulla base della media del diametro (2r), e l'incremento percentuale è stato calcolato come (BA)/A × 100 dove A = superficie per l'effetto individuale e B = superficie dell'area causato dall'effetto combinato. Le zone di inibizione in combinazione rispetto alla piperacillina (Pp) e metilgliossale (Mg) erano più grandi di quelle formate singolarmente contro gli stessi composti. Questi sono stati calcolati
statisticamente attraverso la determinazione di Student t-test sulla base dei valori di deviazione standard e errore standard, che ha mostrato di essere altamente significativo (P <0,01) rispetto a tutti i batteri di prova. Procedura a scacchiera - il sinergismo tra metilgliossale ed un antibiotico è stato confermato eseguendolo in piastre microtitre in MHB11. Metilgliossale è stato testato a concentrazioni di 0, 5, MicroM 10, 20, 40, 80.160 e 320 e piperacillina è stato testato a concentrazioni di 0, 5, 10, 20, 40, 80, 160 e 320 mcg. Ogni piastra è stata preparata con 96 canali dispenser e conservati a -20 ° C fino al momento dell'uso. La scacchiera è stata organizzata come segue: nella prima fila, tutti i pozzetti contenevano 320 mM di metilgliossale più uno di 0, 5, 10, 20, 40, 80, 160 e 320 mg di piperacillina in un volume finale di 1 ml di MHB. In seconda fila tutti i pozzetti contenevano 160 mM di metilgliossale e quantità crescenti di piperacillina come descritto sopra. Una procedura simile è stata seguita per tutte le righe. Nell'ultima riga, i pozzetti avevano solo quantità variabili di piperacillina. Un inoculo di 0,5 McFarland standard12 è stato applicato con l'aiuto di un inoculatore multipunto, incubato durante la notte a 37 ° C. La presenza o assenza di crescita è stata notata visivamente. Il MIC è stato registrato come l'importo più basso di un agente che non mostra una crescita visibile o una debole nebulosità. Il MIC è stato determinato sia a livello individuale che combinato..Il sinergismo è stato registrato dal calcolo della concentrazione frazionale Inibente(FIC), indice di quanto segue: MIC di metilgliossale in combinazione/MIC di metilgliossale studiati da soli + MIC di piperacillina testato in combinazione/MIC piperacillina studiati da soli. Caratterizzazione dei ceppi di P. aeruginosa-Tutti gli organismi sono stati identificati con l'aiuto di vari test biochimici come descritto da Collee.
Risultati e discussione Modello della resistenza di P. aeruginosa rispetto agli antibiotici e metilgliossale-In un studio comparativo dell'azione di inibizione della crescita di una gamma di antibiotici contro ceppi di P. aeruginosa è stato osservato che l'antibiotico penicillina era altamente inattivo contro tutti i ceppi. Per la piperacillina e carbenicillina il livello di resistenza è stato tra Da 100 a> 1000 mg/ml. Per imipenem, ceftazidime, ceftriaxone e cefotaxime il livello di resistenza è stato tra 250 e> 1000 mg/ml, mentre ceftazidime era risultato essere un farmaco migliore per quanto riguarda la sensibilità verso la maggior parte dei ceppi MDR del caso. Amikacina ha anche sorprendentemente mostrato alti livelli di sensibilità verso quasi tutti i ceppi. I pseudomonadi, d'altra parte, erano in gran parte resistenti alla tetraciclina, cloramfenicolo e azythromycin ad alti livelli (tra 1500> 3000 mg/ml). Il livello di resistenza al metilgliossale era molto simile agli antibiotici, che varia tra 2000 e 5000 micron. Effetto della combinazione di un antibiotico e metilgliossale in vitro- Il sinergismo tra metilgliossale e la piperacillina, carbenicillina e amikacina è presentato nella tabella 1. Quando si sono eseguiti i test per il sinergismo tra i due composti, l'aumento percentuale nella zona di superficie è risultata statisticamente significativa rispetto al metilgliossale più piperacillina in tutti e 5 ceppi sperimentali. L'azione reale tra i dischi di piperacillina (100 mg) e metilgliossale (200 mM) rispetto a P. aeruginisa 732 viene presentata in fig. 1.
Didascalia figura 1: Fig.1-Effetto del Pp (100 mg) e Mg (200 mM), dischi su Pseudomonas aeruginosa 732 illustra il sinergismo distinto tra i due E' stato definito sinergismo quando il canbenicillin antibiotici e amikacina sono stati combinati con metilgliossale (Tabella 1).
Esperimento a scacchiera per la determinazione dell'indice FIC-Il MIC di metilgliossale rispetto a P. aeruginosa 27853 in MHB era di 160 mM mentre quello di piperacillina era di 40 mcg. in combinazione con i valori di MIC è diventato 80 mM e 20 mg per metilgliossale e piperacillina rispettivamente. I dati qui presentati per l'effetto di determinazione antibatterica sinergica indica che la combinazione ha prodotto un sinergismo significativo di questa coppia, in quanto l'indice FIC è stato calcolato essere 0.5. Tali valori significativi dell'indice FIC sono stati ottenuti anche nelle coppie di metilgliossale + Carbenicillina e metilgliossale + amikacina. Metilgliossale è un composto unico formato come un metabolico intermediario durante i vari
percorsi biochimici nei microrganismi. Si tratta di un dicarbonilico composto, da un'aldeide e un chetone, che è parte integrante del prodotto naturale del miele di Manuka. Questo miele presenta forti azioni antibatteriche rispetto al miele normale comunemente disponibile sul mercato. Questa proprietà unica del miele di Manuka è attribuita alla presenza di metilgliossale in essa. Ulteriori relazioni rivelano che nei batteri la sintesi di proteine, DNA e RNA sono tutti fortemente inibiti dal metilgliossale. La proprietà anticancro di metilgliossale è inoltre nota da molto tempo. A partire dall'inizio del 1960, vi erano ampie evidenze prodotte dagli scienziati sulla proprietà antitumorali. Egylid et. al1. suggerì che la proprietà antitumorale di metilgliossale è mediata attraverso la inibizione della crescita del composto, che a sua volta, è dovuta alla l'inibizione della sintesi proteica. Queste osservazioni ci hanno guidato a cercare la potenzialità antibatterica di metilgliossale contro la P. aeruginosa MDR tramite sperimentazione con questo studio. È stato osservato che piperacillina, carbenicillina, ceftazidime, amikacina e ciprofloxacina mostrano una sensibilità migliore nei confronti quasi tutti i ceppi di P. aeruginosa a livelli molto più bassi che sul resto degli antibiotici testati. I risultati sono in accordo con l'attuale trattamento terapeutico contro la P. aeruginosa, in quanto tutti gli antibiotici sono farmaci contro questo patogeno. Gli isolati recenti AMRI 100, BVC 3 e 5 BVC sono risultati resistenti a tutti gli antibiotici compresi i farmaci a livelli molto alti. Gli isolati precedenti erano meno resistenti a questi farmaci, ma mantenendoli in forma liofilizzata non sembrano aver perso le loro proprietà di farmaco-resistenza, come è stato chiaramente osservato quando il modello di resistenza è stato studiato. Pertanto si può concludere che la P. aeruginosa non riesce a perdere la sua resistenza facilmente con il tempo o subcolture. Tutti i campioni erano contemporaneamente e distintamente altamente resistenti a molti antibiotici comuni, tra cui cloramfenicolo e tetraciclina. I risultati presentano inoltre che i livelli di resistenza verso piperacillina e metilgliossale erano decisamente molto più individuali rispetto a quando sono stati combinati per determinare il loro effetto insieme dimostrando in tal modo la sinergia tra i due farmaci. Tali risultati hanno dimostrato che metilgliossale è un potenziale farmaco con profonda attività sinergica con la capacità di uccidere ceppi di P. aeruginosa. Lo studio di tossicità di metilgliossale1 come potenziale farmaco è già stato svolto molto ampiamente non mostrando effetti pericolosi in vivo. Così se una piccola dose di metilgliossale è usata come un farmaco con piperacillina l'effetto combinato può indurre l'inizio di una nuova era nella ricerca per la gestione efficace di P. aeruginosa MDR. Piperacillina continua ad essere il farmaco scelto per il trattamento contro questo agente patogeno, ma per i ceppi MDR il farmaco da solo sembra essere poco efficace anche in dosi più elevate. Quindi se metilgliossale può essere integrato con piperacillina in una dose bassa, l'efficacia di piperacillina come farmaco aumenterà notevolmente. In questo studio piperacillina, carbenicillina, amikacina e ciprofloxacin sono stati selezionati per test di sinergismo insieme a metilgliossale dal momento che questi antibiotici sono stabiliti per il trattamento di infezioni acute di P. aeruginosa. E ' noto che metilgliossale è un composto strutturalmente molto semplice e non ci dovrebbero essere difficoltà a sintetizzarlo in un industria farmaceutica. In considerazione del problema acuto di resistenze agli antibiotici, non solo in P. aeruginosa, ma anche tra i vari altri organismi patogeni, l'applicazione di metilgliossale come farmaco antimicrobico può essere usato per il trattamento di diverse infezioni.
