Barkoding Dna Jako Nowoczesne Narzędzie Biologii Molekularnej

Transcript

POSTĘPY BIOLOGII KOMÓRKI TOM 42 2015 NR 4 (621–632) BARKODING DNA JAKO NOWOCZESNE NARZĘDZIE BIOLOGII MOLEKULARNEJ DNA BARCODING AS A MODERN TOOL OF MOLECULAR BIOLOGY Lidia SKUZA1,2, Katarzyna DEMSKA1,2, Anastazja ADAMCZYK1,2 1 Katedra Biologii Komórki, Wydział Biologii, Uniwersytet Szczeciński 2 Centrum Biologii Molekularnej i Biotechnologii, Wydział Biologii, Uniwersytet Szczeciński Streszczenie: Według różnych szacunków na świecie istnieje 5-12 milionów gatunków, z których tylko 1,7 miliona zostało zidentyfikowane. Rozróżnia się je między sobą na podstawie cech morfologicznych, co wymaga dużego nakładu pracy oraz specjalistycznej wiedzy. Dlatego rozpoczęto poszukiwania narzędzia, które mogłoby ten proces ułatwić. Skupiono się na cząsteczkach DNA, dzięki którym można ustalić wiele zależności taksonomicznych. Barkoding DNA jest stosunkowo nową metodą, polegającą na sekwencjonowaniu ściśle określonych loci (dla roślin są to geny matK i rbcL zlokalizowane w genomie chloroplastowym, a w przypadku zwierząt – gen COI w genomie mitochondrialnym) i identyfikowaniu przynależności gatunkowej organizmów na podstawie tych sekwencji. Sekwencja nukleotydów uzyskana przy użyciu określonych starterów przedstawiana jest w postaci paska przypominającego kod kreskowy, który pozwala na porównywanie i odróżnianie gatunków od siebie. Barkoding DNA stał się podstawą do stworzenia bazy sekwencji organizmów występujących na Ziemi, która umożliwi zgromadzenie w jednym miejscu wiedzy niezbędnej do ich identyfikacji. Do tego typu badań stosuje się głównie genomy organellowe, które, ze względu na swoje cechy, takie jak inna budowa i organizacja w porównaniu z genomami jądrowymi, a także podleganie innym zasadom dziedziczenia, są bardzo ważnym źródłem informacji nt. przynależności gatunkowej. Ponadto większa jest ilość materiału genetycznego, którą można uzyskać z jednej komórki. W pracy podano charakterystykę genomów organellowych oraz opisano metody uzyskiwania barkodów DNA. Ponadto przedstawiono wady i zalety tej metody. Celem pracy jest przedstawienie barkodingu DNA genomów organellowych jako metody, która wprowadziła wielkie ułatwienie w identyfikacji gatunków roślin i zwierząt, dodatkowo zwracając uwagę na ważność tych genomów w badaniach nad systematyką. Słowa kluczowe: barkoding DNA, klasyfikacja, filogeneza Summary: According to various estimates, there are 5 to12 million species in the world, of which only 1.7 million have been identified. They are distinguished on the basis of morphological features, which 622 L. SKUZA, K. DEMSKA, A. ADAMCZYK requires a lot of work and specialized knowledge. That is why scientists made efforts to find a tool which would facilitate this process. They focused on DNA particles, thanks to which many taxonomic connections may be established. DNA barcoding is a relatively new method based on sequencing of specific loci (matK and rbcL genes located in chloroplast genome in plants, COI gene in mitochondrial genome in animals) and then identifying species affiliation with the use of these sequences. Nucleotide sequence obtained by specific primers is shown in the form of a strip resembling a bar code. It enables us to compare and distinguish species between themselves. DNA barcoding has become a basis for creation a database containing the sequences of organisms living on Earth. It will enable us to gather knowledge necessary for their identification. For this kind of studies organellar genomes are mainly used. Because of their structure, organization and rules of inheritance, compared to nuclear genome they are a very important source of information on species affiliation. This study describes characteristics of organellar genomes, as well as methods of obtaining barcodes with their advantages and disadvantages. The aim of the study is to show DNA barcoding as a method which facilitates taxonomic studies and identification of species. Key words: DNA barcoding, classification, phylogeny WSTĘP Barkoding DNA jest metodą wykorzystującą sekwencjonowanie jednego lub kilku loci do identyfikacji gatunków, opracowaną przez Paula Heberta z Instytutu Bioróżnorodności Uniwersytetu Guelph w Kanadzie w 2003 roku. Wykorzystanie bardzo krótkiej, zdefiniowanej sekwencji genomu pozwala na uzyskanie „kodu paskowego DNA” – obrazu kolejności zasad w odcinku DNA, które można porównywać ze sobą by ustalić przynależność gatunkową osobników. Można rozróżnić gatunki bez względu na stadium rozwojowe [1]. W wyniku poszukiwań idealnego odcinka DNA do porównań ustalono, że najlepszy genu zwierząt to gen kodujący I podjednostkę oksydazy cytochromowej (COI, coxI) długości 648 pz, znajdujący się w genomie mitochondrialnym [33]. Spełnia on wymogi barkodingu (krótka, zdefiniowana sekwencja), ponadto występuje w większej liczbie kopii niż geny w genomie jądrowym. COI okazał się skuteczny w identyfikacji ptaków, ryb, motyli, much, nietoperzy i wielu innych grup zwierząt. Natomiast wśród roślin genom mitochondrialny nie mógł być wykorzystany ze względu na odmienną ewolucję tego genomu u roślin, a także możliwość krzyżowania się roślin – możliwa obecność mitochondriów od różnych gatunków w jednej roślinie [14]. W wyniku badań przeprowadzonych przez grupę zajmującą się barkodingiem roślin w CBOL (ang. Consortium for the Barcode Of Life), w których porównano kilka różnych układów genów przypuszczalnie przydatnych dla barkodingu, stwierdzono, że najlepsze i najbardziej wiarygodne wyniki otrzymuje się dla genów chloroplastowych: matK kodującego maturazę i rbcL kodującego dużą podjednostkę RuBisCO [14]. BARKODING DNA JAKO NOWOCZESNE NARZĘDZIE BIOLOGII MOLEKULARNEJ 623 CHARAKTERYSTYKA GENOMÓW ORGANELLOWYCH CHARAKTERYSTYKA ZWIERZĘCEGO GENOMU MITOCHONDRIALNEGO Zgodnie z teorią endosymbiozy w trakcie ewolucji doszło do degeneracji genomu symbionta (przodek α-proteobakterii), przez co utracił on swoją autonomię [20]. Ze względu na bliskość wolnych rodników dochodzi do częstych mutacji mitochondrialnego DNA – mtDNA. Ponadto bardziej podatny na mutacje zwierzęcy mtDNA nie ma histonów, a w mitochondrium nie ma tylu systemów naprawczych co w jądrze. Genomy te nie rekombinują ze sobą wcale lub w niewielkim stopniu [32]. Może to powodować heteroplazmię – obecność różnych sekwencji mtDNA w organizmie (populacja mtDNA u osobnika jest raczej homoplazmatyczna) [20]. W genomie mitochondrialnym można spotkać różne formy organizacji: chromosomy liniowe w postaci pojedynczych cząsteczek lub konkatamerów, zestawy cząstek liniowych, chromosomy koliste, sieci splecionych cząsteczek kolistych [31]. Większość organizmów ma koliste mtDNA, a liniowe można spotkać np. u orzęsków [34]. U zwierząt mtDNA nie ma długich obszarów niekodujących, intronów i sekwencji UTR. U wielokomórkowców występuje specjalny obszar niekodujący różnej długości, u kręgowców oflankowany genami kodującymi tRNA dla proliny i fenyloalaniny, posiadający miejsce startu replikacji. Nie wszystkie ORF (ang. Open Reading Frame) dla białek i rRNA są przedzielane genami kodującymi tRNA i czasami dodatkowymi nukleotydami. Niektóre geny zachodzą na siebie co jest dość częste, z uwagi na kondensację genomu mitochondrialnego i brak lub małe regiony UTR [31]. Genom mitochondrialny zwierząt zawiera 37 genów. Mimo tych samych genów w mtDNA różnych organizmów nie można użyć tych samych sond do detekcji wszystkich genów między gatunkami, gdyż niekiedy geny te różnią się sekwencją. Przykładem małego zróżnicowania pod tym względem jest gen kodujący pierwszą podjednostkę oksydazy cytochromowej (COI). Czasami można spotkać wyjątki w organizacji i zawartości genomu mitochondrialnego. Przykładem jest Mytilus edulis (omułek) który nie ma genu ATPazy 8, u Chlamydomonas reinhardtii geny ND3 i ND4L znajdują się w genomie jądrowym, wśród osobników Metridium senile (ukwiał) w mtDNA w genach COI i ND5 znajdują się introny i tylko dwa tRNA – dla formylometioniny i tryptofanu [5]. Nie jest zachowana uniwersalność kodu genetycznego – u ssaków 5 z 64 kodonów ma inne znaczenie niż w genomie jądrowym, a translacja rozpoczyna się od N-formylometioniny, jak u bakterii [31]. Geny obecne w mtDNA kodują tylko 1% proteomu mitochondriów. Zatem ponad 1000 białek mitochondrialnych jest kodowanych w genomie jądrowym, do ich syntezy dochodzi na terenie cytoplazmy i są one importowane do wnętrza mitochondrium [18]. 624 L. SKUZA, K. DEMSKA, A. ADAMCZYK CHARAKTERYSTYKA ROŚLINNEGO GENOMU MITOCHONDRIALNEGO Genom mitochondrialny roślin ulega ciągłej reorganizacji w wyniku rekombinacji i mutacji [31]. Są to zdarzenia wpływające na zmiany w obrębie genomu, rearanżacje materiału genetycznego, a zatem mające wpływ na poziom zmienności genetycznej. Ponadto mitochondria u roślin dziedziczą się w różny sposób: w linii matczynej lub ojcowskiej, co też utrudnia oznaczanie gatunku na podstawie mtDNA [32]. Genomy te u roślin są większe niż u innych organizmów (222-2400 kpz). Różnice wielkości mtDNA roślin wynikają głównie z dużej ilości zduplikowanych sekwencji i powiększania się regionów międzygenowych (odwrotnie niż u zwierząt) [25, 20]. Po porównaniu mtDNA dotychczas zsekwencjonowanych roślin stwierdzono, iż pokrywało się tylko 5% sekwencji powtórzonych. W powiększaniu się genomów mitochondrialnych roślin istotną rolę odgrywają insercje z genomów: chloroplastowego (1% mtDNA, uznawane za raczej niefunkcjonalne) oraz jądrowego (4% mtDNA, uważane za retrotranspozony). Duże zróżnicowanie wielkości genomu mitochondrialnego występuje nawet u przedstawicieli jednego gatunku. Mimo różnic widocznych też między jednoliściennymi a dwuliściennymi, zawartość genów w ich mtDNA jest podobna [31]. Zawartość genów w genomie mitochondrialnym jest zróżnicowana między różnymi gatunkami roślin. Największe różnice dotyczą zawartości genów kodujących białka rybosomalne np. rpl2 i rpl16 obecne u Arabidopsis thaliana i Oryza sativa nie występują w mtDNA buraka cukrowego. Gen rps19 obecny u Marchantia polymorpha i ryżu, u A. thaliana jest tylko pseudogenem. Gen rps11 występuje w mtDNA M. polymorpha, ale nie u pozostałych roślin. Jednakże u ryżu znajduje się on w postaci niefunkcjonalnego pseudogenu, a funkcjonalny gen jest zlokalizowany w genomie jądrowym [27]. W genomie mitochondrialnym roślin mogą występować pseudogeny – wadliwe wersje genu uszkodzone w obszarze kodującym, które uniemożliwią tworzenie funkcjonalnego produktu. Spotyka się geny chimeryczne powstałe z połączenia dwóch kodujących fragmentów DNA lub fragmentów genów pochodzących z rekombinacji między genomami mitochondrialnymi. Pseudogeny i geny chimeryczne można spotkać tylko u niektórych gatunków roślin [7]. Sekwencja genów bardzo się różni nawet między blisko spokrewnionymi gatunkami, różnice w organizacji mogą zachodzić między osobnikami jednego gatunku. Mimo dużego zróżnicowania w kolejności genów można znaleźć geny występujące w określonej kolejności u wszystkich dotychczas badanych gatunków roślin. Np. gen rrn5 jest poniżej genu rrn18 [37]. Tylko 4 geny są kodowane u wszystkich znanych gatunków: cob, COI, 26S rRNA i 18S rRNA. Mimo tego gen COI nie może być wykorzystany do barkodingu roślin, gdyż wykazuje niewystarczającą zmienność, ponadto dochodzi do rekombinacji i wymiany DNA z genomem jądrowym [33]. BARKODING DNA JAKO NOWOCZESNE NARZĘDZIE BIOLOGII MOLEKULARNEJ 625 CHARAKTERYSTYKA GENOMU CHLOROPLASTOWEGO W wyniku zacieśniania endosymbiozy między eubakteryjną komórką gospodarza a wchłoniętą eubakterią fotosyntetyzującą doszło do utraty genów z jej genomu i przeniesienia ich do genomu jądrowego gospodarza, co doprowadziło do wytworzenia obecnych genomów chloroplastowych [13]. Cząsteczka cpDNA podzielona jest na 4 części, zawiera m.in. dwa regiony odwróconych powtórzeń (IR). Różnice w wielkościach IR są główną przyczyną różnic wielkości genomów chloroplastowych między gatunkami. Region IR nie jest niezbędny do funkcjonowania chloroplastów, a niektóre rośliny utraciły go, np. sosny [22]. Wielkość genomu chloroplastowego waha się od 35 kpz do 217 kpz, u organizmów fotosyntetyzujących wielkość ta mieści się w granicach od 115 kpz do 165 kpz. Jest to o wiele mniejszy zakres wielkości niż w przypadku genomów mitochondrialnych roślin [8]. Długość cząsteczki cpDNA jest stała w obrębie gatunku, populacja cpDNA jest zazwyczaj homogeniczna, chociaż np. u Pylaiella littoralis (brunatnica) na genom chloroplastowy składają się dwie cząsteczki kolistego DNA: jedna wielkości 133 kpz, a druga 58 kpz [16]. CpDNA to dobry obiekt badań filogenetycznych, gdyż tempo zmiany nukleotydów w sekwencji (wolniejsze niż w jądrze) jest różne w różnych partiach genomu, co umożliwia badanie rożnych poziomów filogenetycznych. Ponadto genom chloroplastowy dziedziczy się głównie uniparentalnie i brak rekombinacji między cząsteczkami cpDNA. Zmiany kolejności genów są rzadkie, a geny są wysoko konserwatywne wśród roślin lądowych. Genom chloroplastowy zawiera zazwyczaj 110-130 genów [13]. Nie wszystkie z nich są obecne u wszystkich organizmów, całkowita ich ilość zależy od gatunku, np. tytoń ma 112 genów, ryż – 110 [35, 36]. Geny występujące w genomie chloroplastowym można podzielić na trzy grupy: geny aparatu fotosyntetycznego, geny systemu translacji i transkrypcji, geny związane z biosyntezą związków. Geny zorganizowane są w operony [13]. Gen rbcL jest pierwszym sklonowanym i zsekwencjonowanym genem kodującym białko, pozbawionym intronów u roślin wyższych. Ponadto został on zsekwencjonowany u największej liczby gatunków roślinnych. Jako pierwszy został wykorzystany do badań filogenetycznych, lecz duże zróżnicowanie jego sekwencji niekiedy skutkowało nadmiernym poziomem homoplazji, co z kolei doprowadzało do fałszywych podejrzeń o pokrewieństwo między roślinami. Duże zróżnicowanie może być też związane z wysoką częstością mutacji [13]. Analiza genu matK znajdującego się w intronie trnK jest dobrym uzupełnieniem informacji o powiązaniach filogenetycznych, ponieważ dostarcza 2 do 4 razy więcej informacji niż na przykład gen rbcL. Dzięki temu ułatwione jest badanie taksonów, które niedawno się rozdzieliły, m.in. w rodzinach Brassicaceae, Orchidaceae czy Poaceae [13]. Obecnie zsekwencjonowanych jest 206 genomów chloroplastowych [37]. 626 L. SKUZA, K. DEMSKA, A. ADAMCZYK POSTĘPOWANIE SŁUŻĄCE OTRZYMYWANIU BARKODÓW DNA POBIERANIE I POSTĘPOWANIE Z MATERIAŁEM Postępowanie z materiałem do analiz barkodingu nie różni się od standardowej pracy z materiałem genetycznym. Opisane próbki (data, lokalizacja, gatunek) są fotografowane i katalogowane. Należy je traktować tak, by nie uszkodzić DNA. Materiał poddaje się mrożeniu, zanurzeniu w etanolu lub traktuje się cyjankiem. Zamrażanie jest korzystnym sposobem konserwacji. W przypadku etanolu stabilność DNA nie jest wysoka, może ono ulec zakwaszeniu i degradacji. Przy konserwacji należy unikać kontaktu z formaliną i octanem etylu. DNA uzyskane z wysuszonych okazów zazwyczaj jest w dobrym stanie co najmniej rok, lecz z czasem stopień degradacji wzrasta. Najlepiej wykonać analizy bezpośrednio po pobraniu, by uniknąć degradacji DNA wynikającej ze sposobu przechowywania [15, 12]. W zależności od pochodzenia materiału postępowanie przebiega nieco inaczej. W przypadku roślin naczyniowych najlepszej jakości DNA otrzymuje się z części rośliny (liści) wysuszonych zaraz po zebraniu (do 24h). Suszenie odbywa się w małych zamykanych torebkach przy użyciu żelu krzemionkowego – proporcja jego objętości do objętości próbki powinna wynosić 5-10:1. Liście mogą być dzielone na porcje, co przyspieszy suszenie (kontakt materiału z krzemionką). Należy chronić materiał przed dostępem wilgoci [30]. Materiał zwierzęcy może być pobrany inwazyjnie (krew, pióra, wycinki mięśni, fragmenty tkanek mózgu, wątroby od osobników martwych) oraz nieinwazyjnie (pióra, odchody, włosy, wypluwki, błona pergaminowa jaj, wymaz ze śluzówki policzkowej i języka) [12, 15, 30]. Małe kręgowce i bezkręgowce można mrozić w całości w plastikowej torebce i przechowywać w -20°C. Z dużych okazów pobiera się natomiast fragmenty tkanki mięśniowej z różnych lokalizacji. Okazy można także przechowywać w 96% czystym etanolu oraz w 80-85% etanolu (gdy okaz np. stawonoga jest delikatny, kruchy). Jeżeli okaz zawiera dużo wody, po około 2 dniach należy wymienić płyn na świeży etanol [30]. Można także pobrać np. próbki bentosu ze zbiornika wodnego i z niego wyizolować pojedyncze osobniki, które następnie kataloguje się i od każdego otrzymuje się barkod DNA [11]. IZOLACJA DNA Z ZEBRANEGO MATERIAŁU Pierwszym etapem otrzymywania barkodu DNA jest izolacja DNA. Ilość materiału pobieranego do uzyskania barkodu DNA jest bardzo mała. Operacje należy wykonać w sterylnych warunkach i sterylnymi narzędziami. Zaleca się prowadzanie izolacji w 96-dołkowych płytkach, podczas korzystania z nich należy unikać krzy- BARKODING DNA JAKO NOWOCZESNE NARZĘDZIE BIOLOGII MOLEKULARNEJ 627 żowej kontaminacji [15]. Strategie izolacji DNA z tkanek można podzielić na dwie kategorie: uwalnianie i ekstrakcja. Uwalnianie DNA z tkanek polega na jego szybkim przeniesieniu do roztworu bez uszkadzania próbki, co czyni je dostępnym dla dalszych procedur (PCR). Metoda oparta na uwalnianiu jest dogodna dla materiału świeżego i niedawno zebranego. Nie zapewnia jednak odpowiedniej czułości ani czystości DNA potrzebnej do dłuższego przechowywania (ponad rok). Metody ekstrakcyjne natomiast oczyszczają DNA np. przez powinowactwo do membran lub chemicznie (stosując proporcje fenolu i chloroformu). Sposób ten jest dogodny dla izolacji DNA z okazów muzealnych, natomiast wady to toksyczność i czasochłonność [12]. Do izolacji DNA z materiałów świeżych lub zamrożonych można użyć polimerów chelatujących, które w połączeniu z proteinazą K to prosta, wydajna i tania metoda ekstrakcji DNA. Przygotowuje się bufor ekstrakcyjny z użyciem polimeru, 1% azydku sodu, 1M Tris-HCl o pH 8.3 oraz ultraczystej wody, który dodaje się do roztworu proteinazy K, w celu przygotowania roztworu roboczego dodawanego do próbki. Po inkubacji (12-24h) próbki są wirowane i inkubowane w celu inaktywacji proteinazy K. Tak otrzymane próby można przechowywać w -20°C. Metoda ta jest skuteczna dla stawonogów, ryb, ptaków (również piór) i ssaków (również skóra i włosy) i wymaga małej ilości tkanki: 1-3 mm³, nie ma konieczności homogenizacji w ciekłym azocie. Chityna nie jest rozpuszczana, co umożliwia ekstrakcję z małych bezkręgowców. Jednak metoda ta jest nieodpowiednia dla próbek zawierających duże ilości inhibitorów PCR (np. hemoglobinę) lub próbek o zdegenerowanym DNA. Tak uzyskane DNA często jest dość zanieczyszczone i niestabilne [15]. Aby uzyskać DNA z chitynowych pancerzy owadów lub sierści zwierząt (eksponatów muzealnych, elementów kolekcji) można też stosować metodę, która nie powoduje ich uszkodzeń fizycznych. Należy je zanurzyć w buforze trawiącym (CaCl2, SDS, DTT, proteinaza K, Tris pH 8, NaCl), a po inkubacji w ruchu (16-20 h) umieścić w 100% alkoholu etylowym (2-4 h), po czym suszyć na powietrzu. DNA oczyszcza się z użyciem fenolu i chloroformu [2]. W przypadku okazów archiwalnych, można stosować zestawy wykorzystujące krzemionkę. Pozwalają one uzyskać niezanieczyszczone DNA, które łączy się ze złożem w obecności soli chaotropowych. W tych wypadkach należy przygotować roztwór roboczy proteinazy K, a procedura wymaga korzystania z gotowych buforów oraz wykonywania etapów zgodnie z instrukcją (przygotowanie prób, wirowanie, inkubacja, użycie membran, płukania, elucja). Ekstrakcja DNA odbywa się również za pomocą kulek magnetycznych, które mają powinowactwo do DNA, jednak czystość produktu może być niezadowalająca [12]. W przypadku tkanki roślinnej przed przystąpieniem do izolacji DNA, pobraną tkankę maceruje się np. w moździerzu w ciekłym azocie [15]. Można też stosować systemy do homogenizacji, a następnie inkubować materiał (55ᵒC) w buforze ekstrakcyjnym na bazie CTAB i wykorzystać automatyczne systemy ekstrakcji na 96-studzienkowych płytkach. Robocze rozcieńczenia DNA umieszczane są w mi- 628 L. SKUZA, K. DEMSKA, A. ADAMCZYK kropłytkach i po rozcieńczeniu Tris-HCl (pH 8) są gotowe do użycia w reakcji PCR [21]. Do homogenizacji tkanki w moździerzu można użyć podgrzanego do 65ᵒC buforu izolacyjnego (10xCTAB, β-merkaptoetanol). W przypadku tkanek twardych używa się dodatkowo sterylnego piasku lub żelu krzemionkowego. Po wirowaniu i rozpuszczeniu zawiesiny następuje inkubacja (65ᵒC), a po niej m.in. stosowanie mieszaniny chloroformu i alkoholu izoamylowego (24:1), oddzielanie faz, dodanie alkoholu izoamylowego, mrożenie i uzyskanie pelletu DNA [30]. AMPLIFIKACJA REGIONU BARKODOWEGO Wyizolowane DNA wykorzystuje się do amplifikacji regionu barkodowego (ang. Polymerase Chain Reaction, PCR). Należy przygotować startery, które pozwolą na powielenie tylko fragmentu DNA, który zawiera badany gen. Należy opracować startery korzystając z programów, bazy NCBI lub literatury. W celu otrzymania barkodów można użyć starterów zdegenerowanych i niezdegenerowanych. Te zdegenerowane lub ze zmodyfikowanymi zasadami mogą pomóc przy badaniach grup o dużej zmienności sekwencji amplifikowanego genui mogą zapobiec amplifikacji pseudogenów pochodzenia jądrowego [12]. Przykładowe sekwencje starterów do amplifikacji genu COI są podane w kilku pracach [6, 19], podobnie startery do amplifikacji genów matK i rbcL [21]. Startery LCO1490i HCO2198są uniwersalne do amplifikacji genu COI dla 11 gromad bezkręgowców, m.in.: Echinodermata, Mollusca, Annelida, Pogonophora, Arthropoda, Nemertinea, Echiura [10]. Na efektywność reakcji mają wpływ stężenia i proporcje komponentów PCR, głównie nukleotydów i jonów magnezu. Stężenie MgCl2 powinno być niskie, minimalnie 1,5mM. Przykładowe składniki mieszaniny na objętość 25µl są podane przez Consortium for the Barcode of Life [15]. Aby amplifikować gen w celu otrzymaniu barkodu można używać nie tylko polimerazy Taq, ale również innych, a także koktajlów enzymatycznych zawierających enzymy naprawcze, choć nie amplifikują one wydajnie dość krótkich fragmentów (155 pz). Poprawę jakości amplifikacji można osiągnąć przez dodanie trehalozy (obniża temperaturę topnienia DNA, stabilizuje działanie polimerazy Taq, może zapobiegać działaniu inhibitorów PCR np. hemoglobiny), betainy, DMSO lub albuminy surowicy bydlęcej [12]. Kluczowe jest ustalenie profilu reakcji, zwłaszcza temperatur. Prawidłowe dobranie parametrów pozwoli uzyskać produkt, którego nie trzeba oczyszczać [12]. Np. dla genu COI eksperymentalnie dobrać można różne profile termiczne. Dla starterów LCO1490 i HCO2195 kolejność etapów PCR jest typowa (denaturacja, przyłączanie starterów, elongacja) [6]. Program może być jednak skomplikowany: pierwsza seria etapów powtarzana jest 5 razy, druga 35 razy, gdzie temperatura etapów jest wyższa [15]. Profile reakcji mogą się od siebie różnić, jeżeli analizuje się geny dla różnych grup systematycznych. Cały proces może trwać krótko – 15 cykli BARKODING DNA JAKO NOWOCZESNE NARZĘDZIE BIOLOGII MOLEKULARNEJ 629 np. u larw bezkręgowców bentosowych (chruścików, jętek, muchówek), lub też być podzielony na dwie serie: 5 i 30 cykli u ptaków, gadów, ssaków czy też motyli [11, 3, 4]. Z kolei do powielania genu rbcL potrzeba 33 cykli, a dla genu matK – 40 [21]. Po reakcji PCR sprawdza się jakość produktu, prowadząc elektroforezę w 1% żelu agarozowym [12]. Różny stopień świecenia produktów w świetle UV pokazuje ilość DNA znajdującego się w danym prążku i sygnalizuje jaką ilość próbki należy pobrać w celu sekwencjonowania: słabe – 4-5 µl próbki, średnio widoczne – 2-3 µl próbki, intensywne – 1,5 µl [15].Prążek należy wyciąć i oczyścić z agarozy przy użyciu gotowych zestawów. Do określania ilości produktów PCR można także użyć bioanalizatorów, jednak są one drogie, dość powolne i mają pewne ograniczenia w ich zastosowaniu w barkodingu [12]. Po oczyszczeniu próbek należy je zsekwencjonować. Wówczas otrzymany będzie barkod DNA. Dzięki sekwencjonowaniu obu nici można uniknąć błędów podczas prowadzenia PCR. ZALETY I WADY METODY Zaletą barcodingu jest możliwość oznaczania przynależności gatunkowej różnych organizmów, co rzuca nowe światło na identyfikację nowych oraz opis już istniejących gatunków roślin i zwierząt (np. gatunki kryptyczne). Co więcej, identyfikacja ta nie jest zależna od etapu rozwoju, na którym znajduje się organizm [1]. Ponadto wymaga niewielkiej ilości tkanki do przeprowadzenia badań i jest metodą szybką i wiarygodną. Pewnego rodzaju ograniczenie wynika z wykorzystania poszczególnych genomów. Mianowicie genom jądrowy nie zawiera takiej sekwencji, aby na jej podstawie możliwa była identyfikacja różnych organizmów. Ponadto w komórkach znajduje się znaczna ilość mitochondriów czy chloroplastów. W jednej komórce zwierzęcej występuje więcej niż jedno mitochondrium (np. w komórkach wątroby znajduje się do 1000 mitochondriów, w każdym z nich 5-10 kopii mtDNA; dużą ilość mitochondriów można znaleźć też w komórkach skóry i mięśni) [31]. W komórce roślinnej natomiast – więcej niż jeden chloroplast (można znaleźć do 300 chloroplastów w każdej komórce, przeciętna ich ilość to 20-40, zawierają one najczęściej ok. 300 kopii cpDNA w zależności od gatunku) [24, 28, 29]. Z większym powodzeniem wykorzystuje się zatem genomy organellowe – mitochondrialne i chloroplastowe, przy czym u roślin kolejne ograniczenie związane jest z możliwością krzyżowania poszczególnych osobników (zmienność, rekombinacja DNA), zatem w ich przypadku stosowany jest tylko genom chloroplastowy [1]. Dzięki zapewnieniu standaryzacji i łatwych procedur barkoding może stać się idealnym narzędziem dopełniającym pracę taksonomów, którzy będą mogli ustalać zależności między gatunkami, a także opisywać nowo zidentyfikowane gatunki. Barkoding pozwala na badanie wpływu człowieka na środowisko, oznaczanie ga- 630 L. SKUZA, K. DEMSKA, A. ADAMCZYK tunków grzybów powodujących zatrucia, monitorowanie stanu środowiska naturalnego, orzekanie o składzie produktów pochodzenia zwierzęcego i roślinnego. Ponadto umożliwia on dostęp do zaawansowanych narzędzi identyfikujących gatunki dla np. rolnictwa – identyfikacja szkodników roślin, kontrola handlu zwierzętami – identyfikacja gatunków zagrożonych, kłusownictwo, entomologia sądowa – identyfikacja wczesnych stadiów rozwojowych organizmów np. larwy muchówek, medycyna – identyfikacja pasożytów oraz umożliwi dostęp do bazy gatunków ludziom niezwiązanym ze światem naukowym [9, 23, 26, 17]. Barkoding DNA daje informacje, które czynią systematykę i taksonomię bardziej zrozumiałą i przystępną dla odbiorców. PODSUMOWANIE Barkoding DNA jest techniką stosunkowo młodą i na początku podchodzono do niej sceptycznie. Jednakże dzisiaj barkoding DNA jest narzędziem stosowanym w wielu badaniach i jego popularność rośnie. Zasadniczą różnicą między otrzymywaniem barkodów z roślin a uzyskiwaniem ich od zwierząt jest wykorzystanie dwóch starterów w przypadku amplifikacji regionu barkodowego zwierząt i czterech w przypadku roślin. Wynika to z faktu, iż barkod DNA u zwierząt uzyskuje się z jednego genu mitochondrialnego (COI), a u roślin z dwóch genów chloroplastowych (matK i rbcL). Oprócz tego w przypadku roślin najlepsze próbki DNA uzyskuje się z suszonych części roślin, a od zwierząt z materiału świeżego. Dodatkowo w czasie izolacji DNA z roślin tkankę najpierw maceruje się, a w przypadku zwierząt nie trzeba przeprowadzać tego zabiegu. Powstało 200 ośrodków grupy CBOL na świecie w celu stworzenia bazy barkodów. Stworzono projekt iBOL (ang. the international Barcode Of Life project), który ma za zadanie tworzyć bibliotekę barkodów, na podstawie której stworzony będzie system, z którego będzie mógł korzystać każdy kto chciałby zidentyfikować gatunek. Powstała baza danych BOLD (ang. Barcode Of Life Data systems) w której do tej pory znajduje się 238 565 gatunków roślin, zwierząt, grzybów i protista opatrzonych barkodem DNA. W Polsce w 2006 r. stworzono Bank DNA, zrzeszający instytucje wykorzystujące barkody DNA. Wszystkie te inicjatywy dążą do utworzenia ogólnodostępnego systemu, który umożliwiłby szybką identyfikację badanego organizmu. LITERATURA [1] Ajmal Ali M, Gyulai G, Hidwegi N, Kerti B, al Hemaid F, Pandey AK, Lee J. The changing epitome of species identification – DNA barcoding. Saudi J Biol Sci 2014; 21: 204-231. BARKODING DNA JAKO NOWOCZESNE NARZĘDZIE BIOLOGII MOLEKULARNEJ [2] [3] [4] [5] [6] [7] [8] [9] [10] [11] [12] [13] [14] [15] [16] [17] [18] [19] [20] [21] [22] 631 Alberts CC, Ribeiro-Paes JT, Aranda-Selverio G, Cursino-Santos JR. Moreno-Cotulio VR, OliveiPorchia BFMM, Santos WF, Souza EB. DNA extraction from hair shafts of wild Brazilian felids and canids. Genet Mol Res 2010; 9: 2429-2435. Arif IA, Khan HA, al Sadoon M, Shobrak M. Limited efficiency of universal mini-barcode primers for DNA amplification from desert reptiles, birds and mammals. Genet Mol Res 2011; 10: 3559-3564. Ashfag M, Akhtar S, Khan AM, Adamowicz SJ, Hebert PDN. DNA barcode analysis of butterfly species from Pakistan points towards regional endemism. Mol Ecol Resour 2013; 13: 832-843. Boore JL. Animal mitochondrial genomes. Nucleic Acids Res 1999; 27: 1767-1780. Chen J, Li Q, Kong L, Yu H. How DNA barcodes complement taxonomy and explore species diversity: The case study of a poorly understood marine fauna. PLOS ONE 2011; 6: e21326. Christensen AC. Plant mitochondrial genome evolution can be explained by DNA repair mechanisms. Genome Biol Evol 2013; 5: 1079-1086. Clarke JL, Daniell H. Plastid biotechnology for crop production: present status and future perspectives. Plant Mol Biol 2011; 76: 211-220. Dentinger BTM, Margaritescu S, Moncalvo J-M. Rapid and reliable high-throughput methods of DNA extraction for use in barcoding and molecular systematics of mushrooms. Mol Ecol Resour 2010; 10: 628-633. Folmer O, Black M, Hoeh W, Lutz R, Vrijenhoek R. DNA primers for amplification of mitochondrial cytochrome c oxidase subunit I from diverse metazoan invertebrates. Mol Mar Biol Biotechnol 1994; 3: 294-299. Hajibabaei M, Spall JL, Shokralla S, van Konynenburg S. Assessing biodiversity of a freshwater benthic macroinvertebrate community through nondestructive environmental barcoding of DNA from preservative ethanol. BMC Ecology 2012; 12: 28. Hajibabaei M, Dewaard JR, Ivanova NV, Ratnasingham S, Dooh RT, Kirk SL, Mackie PM, Hebert PDN. Critical factors for assembling a high volume of DNA barcodes. Philos Trans R Soc B Biol Sci 2005; 360: 1959-1967. Henry RJ. Plant diversity and evolution: genotypic and phenotypic variation in higher plants. CABI Publishing, Cambridge, 2005. Hollingsworth PM, Grahan SW, Little DP. Choosing and using a plant DNA barcode. PLOS One 2011; 6: e19254. Ivanova NV, Dewaard JR, Hajibabaei M, Hebert PDN. Protocols for high volume DNA barcoding. Draft submission to: DNA Working Group Consortium for the Barcode of Life, Washington, DC (www.barcoding.si.edu, downloaded 2014) Jiao Y, Guo H. Chapt er Nine. Prehistory of the angiosperms: characterization of the ancient genomes. In Paterson AH eds. Advances in Botanical Research. London: Elsevier-Academic Press, 2014; 69: 223-246. Joseph I, Mathew DG, Sathyan P, Vargheese G. The use of insects in forensic investigations: An overview on the scope of forensic entomology. J Forensic Dent Sci 2011; 3: 89-91 Kaniak-Golik A, Skoneczna A. Mitochondria–nucleus network for genome stability. Free Radic Biol Med 2015; 82: 73-104. Kim DW, Yoo WG, Park HC, Yoo HS, Kang DW, Jin SD, Min HK, Paek WK, Lim J. DNA barcoding of fish, insects, and shellfish in Korea. Genomics Inform 2012; 10: 206-211. Kitazaki K, Kubo T. Cost of having the largest mitochondrial genome: evolutionary mechanism of plant mitochondrial genome. J Bot 2010; 2010: 1-12. Kress WJ, Erickson DL, Jones FA, Swenson NG, Perez R, Sanjur O, Bermingham BE. Plant DNA barcodes and a community phylogeny of a tropical forest dynamics plot in Panama. Proc Natl Acad Sci USA 2009; 106: 18621-18626. Kuac S, Ruan J, Harting J, Ye CX, Helmus MR, Yu J, Cannon CH. Reference-free comparative genomics of 174 chloroplasts. PLOS ONE 2012; 7:e48995. ra ALD, 632 L. SKUZA, K. DEMSKA, A. ADAMCZYK [23] Laiou A, Mandolini LA, Piredda R, Bellarosa R, Simeone MC. DNA barcoding as a complementary tool for conservation and valorisation of forest resources. ZooKeys 2013; 365: 197-213. [24] Lutz KA, Wang W, Zdepski A, Michael TP. Isolation and analysis of high quality nuclear DNA with reduced organellar DNA for plant genome sequencing and resequencing. BMC Biotechnol 2011; 11: 54. [25] Mach J. Cool as the cucumber mitochondrial genome: complete sequencing reveals dynamics of recombination, sequence transfer, and multichromosomal structure. Plant Cell 2011; 23: 2472. [26] Newmaster SG, Grguric M, Shanmughanandhan D, Ramalingam S, Ragupathy S. DNA barcoding detects contamination and substitution in North American herbal products. BMC Medicine 2013; 11: 222. [27] Notsu Y, Masood S, Nishikawa T, Kubo N, Akiduki G, Nakazono M. The complete sequence of the rice (Oryza sativa L.) mitochondrial genome: frequent DNA sequence acquisition and loss during the evolution of flowering plants. Mol Genet Genom 2002; 268: 434-445. [28] Okazaki K, Kabeya Y, Miyagishima C. The evolution of the regulatory mechanism of chloroplast division. Plant Signal Behav 2010; 5: 164-167. [29] Pogson BJ, Albrecht V. Genetic Dissection of Chloroplast Biogenesis and Development: An Overview. Plant Physiol 2011; 155: 1545-1551. [30] Powell M, van Der Bank M, Maurin O, Savolainen V. DNA barcoding: a practical guide. African Centre for DNA Barcoding (http://www.acdb.co.za/, downloaded 2014). [31] Scheffler IE. Mitochondria- second edition. John Wiley & Sons Inc., Hoboken, New Jersey, 2008. [32] Sloan DB, Alverson AJ, Chuckalovcak JP, Wu M, Mccauley DE, Palmer JD Taylor DR. Rapid evolution of enormous, multichromosomal genomes in flowering plant mitochondria with exceptionally high mutation rates. PLoS Biol 2012; 10: e1001241. [33] Stoeckle MY, Thaler DS. DNA barcoding works in practice but not in (neutral) theory. PLOS ONE 2014; 9: e100755. [34] Swart EC, Nowacki M, Shum J, Stiles H, Higgins BP, Doak TG, Schotanus K, Magrini VJ, Minx P, Mardis ER, Landweber LF. The Oxytricha trifallax mitochondrial genome. Genome Biol Evol 2012; 4: 136-154. [35] Thyssen G, Svab Z, Maliga P. Cell-to-cell movement of plastids in plants. PNAS 2012; 109: 2439-2443. [36] Wu Z, Ge S. The whol e chl or opl ast genome of wil d r ice (Oryza australiensis). Mitochondrial DNA 2014; 24: 1-2. [37] Zhang T, Fang Y, Wang X, Deng X, Zhang X, Hu S, Yu J. The complete chloroplast and mitochondrial genome sequences of Boea hygrometrica: Insights into the evolution of plant organellar genomes. PLOS ONE 2012; 7: e30531. Redaktor prowadzący – Jerzy Kawiak Otrzymano: 11.05.2015 Przyjęto: 16.07.2015 Lidia Skuza Katedra Biologii Komórki, Wydział Biologii Uniwersytet Szczeciński ul. Wąska 13, 71-415 Szczecin tel.: 91 444 16 37 fax: 91 444 16 41 email: [email protected]