Białka Tnące Mikrotubule – Struktura I Regulacja

Transcript

Białka tnące mikrotubule – struktura i regulacja aktywności Ewa Wacławek Dorota Włoga * Pracownia Cytoszkieletu i Biologii Rzęsek, Zakład Biologii Komórki, Instytut Biologii Doświadczalnej im. Marcelego Nenckiego Polskiej Akademii Nauk, Warszawa Pracownia Cytoszkieletu i Biologii Rzęsek, Zakład Biologii Komórki, Instytut Biologii Doświadczalnej im. Marcelego Nenckiego Polskiej Akademii Nauk, ul. Pasteura 3, 02-093 Warszawa; tel.: (22) 589 23 38, faks: (22) 822 53 42, e-mail: [email protected] * Artykuł otrzymano 7 stycznia 2016 r. Artykuł zaakceptowano 21 stycznia 2016 r. Słowa kluczowe: białka tnące mikrotubule, katanina, spastyna, fidżetyna, mikrotubule Wykaz skrótów: ATP – adenozyno-5’-trifosforan; ATPazy AAA (ang. ATPases associated with diverse cellular activities) – grupa proteaz zależnych od ATP; ESCRT-III – ang. endosomal sorting complex required for transport-III; GTP – guanozyno-5’-trifosforan; GMPCPP (ang. guanozyno-5’-[(a,b)-metyleno]trifosforan) – nie ulegający hydrolizie analog GTP; MAP (ang. microtubule associated protein) – białko towarzyszące mikrotubulom; MEI (ang. meiosis inhibitor) – czynnik hamujący mejozę; MIT – ang. microtubule interacting and trafficking; MTBD (ang. microtubule-binding domain) – domena pośrednicząca w wiązaniu mikrotubul; NBD (ang. nucleotide binding domain) – domena pośrednicząca w wiązaniu nukleotydu; WD40 – fragment białka zawierający powtórzenie dwupeptydu tryptofan – kwas asparaginowy Podziękowania: Praca naukowa finansowana w ramach Marie Curie Reintegration Grant nr 277122 oraz ze środków finansowych na naukę w latach 2011-2015 przyznanych na realizację projektu międzynarodowego współfinansowanego przez MNiSW. STRESZCZENIE B iałka tnące mikrotubule, katanina, spastyna i fidżetyna, odznaczają się zdolnością do zależnej od ATP, miejscowej destabilizacji struktury mikrotubul. Aktywność ta prowadzi do skracania lub rozpadu istniejących mikrotubul oraz, pośrednio, przy udziale odpowiednich białek towarzyszących, do polimeryzacji licznych, nowych mikrotubul na bazie utworzonych krótkich fragmentów (matryc), a w konsekwencji do reorganizacji cytoszkieletu mikrotubularnego. Poniższy artykuł podsumowuje obecny stan wiedzy na temat budowy białek tnących mikrotubule, mechanizmu ich działania, czynników regulujących poziom kataniny i spastyny w komórkach oraz ich aktywności tnącej względem mikrotubul. WPROWADZENIE Mikrotubule to, obok aktyny i filamentów pośrednich, podstawowy element cytoszkieletu komórek eukariotycznych. Struktury te zbudowane są z heterodimerów alfa- i beta-tubuliny. Beta -tubulina jednego heterodimeru oddziałuje z alfa-tubuliną kolejnego heterodimeru tworząc protofilamenty, natomiast boczne oddziaływania pomiędzy heterodimerami umożliwiają połączenia pomiędzy protofilamentami. Mikrotubule zbudowane są przeważnie z 13-protofilamentów, a polaryzacja samych heterodimerów i sposób ich łączenia w protofilamencie powodują, że cała mikrotubula ma charakter spolaryzowany. Heterodimery tubuliny przyłączane do „rosnącego” końca mikrotubuli (tzw. „koniec plus”) związane są z dwiema cząsteczkami GTP. Po pewnym czasie cząsteczka GTP związana z beta tubuliną ulega hydrolizie do GDP. Zależnie od dostępności wolnych heterodimerów tubuliny i tempa ich przyłączania do mikrotubuli, koniec plus mikrotubuli jest zbudowany z heterodimerów, w których beta-tubulina jest związana: (i) z GTP – takie heterodimery tworzą tzw. czapeczkę (ang. GTP-cap), która zapobiega depolimeryzacji mikrotubuli, lub (ii) z GDP, co spowoduje gwałtowną depolimeryzację mikrotubuli. Nieustanna polimeryzacja i depolimeryzacja mikrotubul jest określana jako dynamiczna niestabilność. W komórkach dynamiczna niestabilność mikrotubul regulowana jest również przez białka towarzyszące końcom mikrotubul. Mikrotubule funkcjonują jako pojedyncze filamenty, wiązki lub złożone struktury (np. rusztowanie centrioli, ciałek podstawowych i rzęsek) i pełnią istotną rolę w kluczowych procesach komórkowych, takich jak: transport wewnątrzkomórkowy, segregacja chromosomów w czasie podziału, utrzymanie kształtu komórki oraz ruch komórek. By pełnić tak różnorodne funkcje, poszczególne rodzaje mikrotubul muszą różnić się swoimi właściwościami, w tym zdolnością do reorganizacji. Podczas gdy niektóre mikrotubule powinny być bardziej dynamiczne jak np. mikrotubule cytoplazmatyczne lub mikrotubule wrzeciona podziałowego, inne muszą być stabilne jak np. mikrotubule budujące rusztowanie centrioli, ciałek podstawowych i rzęsek. Właściwości mikrotubul zależą od trzech podstawowych czynników: rodzaju izoform alfa- i beta-tubuliny wbudowywanych w poszczególne mikrotubule, rodzaju i poziomu potranslacyjnych modyfikacji tubuliny w mikrotubulach oraz od oddziaływania mikrotubul z białkami towarzyszącymi mikrotubulom (MAP, ang. microtubule associated proteins) [1,2]. Do białek MAP należą m. in. białka tnące mikrotubule (ang. microtubule severing proteins), wpływające na dynamikę mikrotubul, w tym na ich liczbę i długość [3,4]. W odróżnieniu od białek, które wpływają na dynamikę mikrotubul poprzez oddziaływanie z ich końcami i regulację tempa polimeryzacji i depolimeryzacji mikrotubul [5], białka tnące mikrotubule przy użyciu energii pochodzącej z hydrolizy ATP miejscowo destabilizują strukturę mikrotubul tworząc początkowo przerwy, a następnie tnąc mikrotubule na krótkie fragmenty [3,4]. Taka aktywność prowadzi do skracania lub rozpadu istniejących mikrotubul oraz do powstania puli niespolimeryzowanej tubuliny. Następnie przy udziale odpowiednich białek towarzyszących, może dojść do polimeryzacji nowych mikrotu- 46 www.postepybiochemii.pl bul na bazie utworzonych krótkich fragmentów (matryc), a w konsekwencji do zwiększenia liczby mikrotubul i reorganizacji cytoszkieletu mikrotubularnego. BIAŁKA TNĄCE MIKROTUBULE Rozpad mikrotubul, polegający nie tylko na depolimeryzacji ich końców, ale również na przerywaniu struktury mikrotubul na całej ich długości, został po raz pierwszy zaobserwowany podczas inkubacji mikrotubul stabilizowanych taksolem w mitotycznym ekstrakcie z oocytów żaby Xenopus laevis [6]. Zidentyfikowany w ekstrakcie czynnik powodujący cięcie mikrotubul nazwano kataniną, od nazwy samurajskiego miecza katany [7]. Obecnie znane są trzy rodziny białek tnących mikrotubule: kataniny i białka podobne do katanin, spastyny i fidżetyny. Należą one do nadrodziny ATPaz AAA (ang. ATPases Associated with diverse cellular Activities) i są dobrze zachowane w toku ewolucji. Na końcu karboksylowym białek tnących mikrotubule znajduje się pośrednicząca w oligomeryzacji, złożona z około 230 aminokwasów ATP-azowa domena AAA, natomiast na końcu aminowym – domena MIT (ang. Microtubule Interacting and Trafficking) pośrednicząca w oddziaływaniu białek tnących mikrotubule z innymi białkami oraz niezależnym od ATP oddziaływaniu z mikrotubulami [8-10]. W przypadku kataniny, fragment aminowy jest niezbędny do wiązania z białkiem regulatorowym, p80 [11], natomiast w przypadku spastyny domena MIT może pośredniczyć w oddziaływaniu z białkami kompleksu ESCRT-III (ang. endosomal sorting complex required for transport-III) [12]. Dodatkowo w spastynie pomiędzy domeną MIT a domeną AAA zidentyfikowano region nazwany domeną MTBD (ang. MicroTubule Binding Domain), pośredniczący w niezależnym od ATP wiązaniu mikrotubul [12]. Katanina jest jedynym białkiem tnącym mikrotubule, tworzącym heterodimery, w skład których oprócz samej kataniny (czyli podjednostki katalitycznej o masie około 60 kDa, p60), wchodzi również podjednostka regulatorowa (tzw. p80) o masie około 80 kDa. Białko p80 posiada na końcu aminowym 6-krotnie powtórzony motyw WD40 [7]. Analizy bioinformatyczne wykazały, że w genomie kręgowców i Drosophila oprócz genu kodującego kataninę p60 występuje również gen kodujący białko podobne do kataniny nazwane KL1 lub KATNAL1 (ang. katanin-like 1, katanin p60 subunit A-like 1). Sekwencja aminokwasowa ludzkiego białka KL1 jest w 85% podobna do sekwencji aminokwasowej kanonicznej kataniny; ma podobną budowę domenową i posiada właściwości tnące mikrotubule ale, jak wskazują badania in vitro, nie tworzy kompleksu z białkiem p80 [13]. W odróżnieniu od kataniny p60 i białka KL1, białko podobne do kataniny 2 (ang. katanin p60 subunit A-like 2, KATNAL2) posiada na końcu aminowym domenę LisH, która, jak wykazano na przykładzie innych białek, może pośredniczyć w dimeryzacji i oddziaływaniu z innymi białkami [14]. Oprócz grzybów, białka KATNAL2 występują u niemal wszystkich Eukaryota, z tym, że u roślin nasiennych w białkach podobnych do KATNAL2, brakuje fragmentu domeny LisH. Chociaż sekwencja aminokwasowa domeny AAA białek KATNAL2 jest najbardziej podobna do sekwencji domeny AAA kataniny, to w oparciu o całościową analizę struktury białek KATNAL2, wydaje się, że nadana nazwa Postępy Biochemii 62 (1) 2016 jest myląca i białka te stanowią oddzielną podrodzinę, tak jak spastyny czy fidżetyny. Spastyna i fidżetyna wykazują wysoki stopień homologii do kataniny w obrębie domeny AAA. U ssaków zidentyfikowano cztery izoformy spastyny, różniące się lokalizacją i zaangażowaniem w różne procesy komórkowe [12]. Mutacje spastyny są główną przyczyną powstawania dziedzicznej paraplegii spastycznej (ang. hereditary spastic paraplegia). Głównym objawem tej neuropatii jest postępująca spastyczność oraz osłabienie siły mięśni kończyn dolnych związane z degeneracją aksonów korowo-rdzeniowych w mózgu. Większość zidentyfikowanych mutacji wywołujących tę chorobę znajduje się w domenie AAA spastyny [15]. Fidżetyna została zidentyfikowana jako białko, którego mutacje powodują nieskoordynowane ruchy głowy określane w literaturze jako „fidget phenotype” [16,17]. U myszy mutacje fidżetyny prowadzą do zaburzeń w rozwoju narządu wzroku (zmniejszone oczy oraz niedorozwinięty nabłonek siatkówki oka), słuchu i równowagi (brak lub zmniejszone kanały półkoliste) oraz szkieletu (polidaktylia, zrośnięcie kości czaszki), często również do rozszczepienie podniebienia [17]. Oprócz fidżetyny w genomie kręgowców znaleziono 2 geny kodujące białka podobne do fidżetyny, FIGNL1 i FIGNL2 (ang. Fidgetin-like 1 and 2) [17]. MECHANIZM DZIAŁANIA BIAŁEK TNĄCYCH MIKROTUBULE Aktywność katalityczna białek tnących mikrotubule zależy od energii uwalnianej podczas hydrolizy ATP [3]. Wiążąca ATP domena AAA posiada klasyczny region wiążący nukleotydy, z dwoma charakterystycznymi, silnie zachowanymi w toku ewolucji motywami: Walker A i Walker B odpowiedzialnymi za wiązanie i hydrolizę cząsteczki ATP [8,10]. Białka tnące mikrotubule związane z cząsteczką ADP występują jako monomery. Po wymianie ADP na ATP, białka te ponad 20 razy bardziej wydajnie wiążą się z mikrotubulami i ulegają oligomeryzacji, tworząc pierścienie zbudowane z 6 podjednostek. Każdy oligomer posiada kanał centralny i sześć symetrycznych ramion [3,9,10,18,19]. W przeciwieństwie do samego związania cząsteczki ATP, zdolność do hydrolizy ATP nie jest konieczna do oddziaływania białek tnących mikrotubule z mikrotubulami; spastyna z mutacją w motywie Walker B (E442Q), uniemożliwiającą hydrolizę związanej cząsteczki ATP, przyłącza się do mikrotubul i tworzy oligomery. W przypadku kataniny, zarówno sama podjednostka p60 jak i w kompleksie z p80, posiada zdolność do tworzenia heksameru, natomiast sama podjednostka p80 nie tworzy oligomerów w formie pierścieni [20]. Heksamery tworzone przez białka tnące mikrotubule są strukturami niestabilnymi. Hydroliza cząsteczki ATP do ADP, powoduje zmniejszenie powinowactwa heksameru do mikrotubuli, a następnie jego rozpad. Również zbyt niskie stężenie białek tnących mikrotubule nawet w obecności ATP powoduje rozpad heksameru [10,18,20]. Podobnie jak w przypadku innych ATPaz z nadrodziny białek AAA [21], kontaktująca się ze środowiskiem powierzchnia kanału centralnego heksameru spastyny [9,10] i kataniny [19], charakteryzuje się obecnością reszt aminokwasowych o 47 charakterze aromatycznym oraz zasadowym. Uważa się, że kanał centralny heksameru oddziałuje z negatywnie naładowanym końcem karboksylowym tubuliny wbudowanej w mikrotubule. Potwierdzają to dane doświadczalne. Mikrotubule poddane działaniu subtylizyny, proteinazy serynowej, która odcina ujemnie naładowane końce karboksylowe alfa- i beta-tubuliny [22], są odporne na działanie kataniny [7] i spastyny [8]. Podobny efekt powoduje usunięcie z końca karboksylowego tubuliny zaledwie 22 ostatnich reszt aminokwasowych (fragmentu bogatego w reszty kwasu glutaminowego) [9]. Z drugiej strony wykazano, że dodanie do spolimeryzowanych mikrotubul krótkiego, zbudowanego z 23 reszt aminokwasowych, peptydu odpowiadającego końcowi karboksylowemu beta-tubuliny, hamuje fragmentację mikrotubul przez spastynę [10]. Rolę końca karboksylowego tubuliny w regulacji wrażliwości mikrotubul na aktywność katalityczną kataniny wykazano również w badaniach nad mutantem sb26 nicienia Caenorhabditis elegant. Genom nicienia koduje kilka izotypów beta-tubuliny, różniących się kilkunastoma resztami aminokwasowymi w obrębie końca karboksylowego. Pojedyncza mutacja w obrębie końca karboksylowego beta tubuliny tbb2, która powoduje zamianę kwasu glutaminowego na lizynę, obniża wrażliwość mikrotubul na podwyższony poziom kataniny [23]. Zwiększona odporność mikrotubul może być spowodowana zmniejszeniem ujemnego ładunku końca karboksylowego zmutowanej tubuliny, a w konsekwencji słabszym oddziaływaniem między końcem tubuliny a kanałem centralnym heksameru kataniny. Obecnie proponowany model cięcia mikrotubul zakłada, że eksponowany na powierzchni mikrotubuli koniec karboksylowy tubuliny jest przesuwany przez kanał centralny heksametru, a oddziaływanie pomiędzy heksamerem a mikrotubulą jest dodatkowo wzmacniane przez niezależne od ATP wiązanie heksameru do mikrotubuli za pośrednictwem domeny MIT [10]. Przesuwanie końca karboksylowego tubuliny przez kanał centralny heksameru miałoby powodować częściową zmianę konformacji tubuliny (jej rozwinięcie) i osłabienie oddziaływań pomiędzy sąsiadującymi monomerami tubuliny oraz związaną z tym miejscową destabilizację struktury ściany mikrotubuli, a w konsekwencji powstanie przerwy w strukturze ściany i przecięcie mikrotubuli [10,24]. Postulowane tworzenie przerw w ścianie mikrotubuli jest zgodne z obserwacjami mikroskopowymi pokazującymi, że podłużne przerwy obserwowane w strukturze mikrotubul w oocytach nicienia C. elegans szczepu dzikiego, nie występują w mikrotubulach w oocytach mutantów z nieaktywną kataniną [25]. REGULACJA AKTYWNOŚCI BIAŁEK TNĄCYCH MIKROTUBULE Białka tnące mikrotubule mogą powodować rozpad mikrotubul w czasie krótszym niż kilka minut [6]. Biorąc pod uwagę potencjalnie „niszczycielski” charakter białek tnących mikrotubule, zarówno poziom syntezy jak i aktywność tych białek, muszą być ściśle kontrolowane. Dotychczasowe badania doprowadziły do zidentyfikowania szeregu czynników, które regulują poziom i aktywność białek tnących mikrotubule. Z jednej strony czynniki te wynikają z właściwości samych mikrotubul (np. obecność defektów w strukturze mikrotubul, poziom modyfikacji potranslacyjnych tubuliny oraz wiązanie niektórych białek MAP), z drugiej strony, są to czynniki, które regulują poziom enzymu w komórce i jego aktywność poprzez kontrolę poziomu ekspresji i degradacji, modyfikacje potranslacyjne lub, jak w przypadku kataniny, oddziaływanie z białkiem regulatorowym. Chociaż białka tnące mikrotubule mogą ciąć mikrotubule w dowolnych miejscach, pewne fragmenty mikrotubul wydają się być preferencyjnie rozpoznawane i cięte przez te białka. Jednym z czynników zwiększających prawdopodobieństwo przecięcia, są defekty w strukturze ściany mikrotubul. Mikrotubule polimeryzowane in vitro w obecności analogu GTP, GMPCPP, są zbudowane z 14 protofilamentów [26]. Krótkie 14-filamentowe mikrotubule użyte jako matryce, w obecności taksolu, czynnika stabilizującego mikrotubule, ulegają wydłużeniu, prowadząc do powstania odcinków zbudowanych jedynie z 12-13 protofilamentów [27]. W efekcie powstaje przesunięcie między protofilamentami na granicy dwóch odcinków mikrotubuli: fragmentu polimeryzowanego w obecności GMPCPP przy braku taksolu oraz fragmentu dobudowanego w obecności taksolu. Użycie tak otrzymanych mikrotubul jako substratu dla kataniny pokazało, że przecięcie mikrotubul jest około 1,5-2 razy bardziej prawdopodobne w miejscu defektu w strukturze mikrotubul, tj. przesunięcia pomiędzy protofilamentami na granicy dwóch fragmentów, niż w sąsiadujących odcinkach mikrotubuli o jednolitej strukturze ściany [28]. Różnice między mikrotubulami wynikają przede wszystkim, z różnic pomiędzy izoformami alfa- i beta-tubuliny oraz z modyfikacji potranslacyjnych wbudowanej tubuliny. Tubulina podlega różnym modyfikacjom potranslacyjnym, zwłaszcza w rejonie końca karboksylowego [29]. Zgodnie z obecnie proponowanym modelem, ujemnie naładowany koniec karboksylowy tubuliny oddziałuje z dodatnio naładowanym kanałem centralnym heksameru spastyny lub kataniny [3]. Glutamylacja tubuliny jest modyfikacją polegającą na przyłączeniu do reszt kwasu glutaminowego (E), znajdującego się w sekwencji pierwszorzędowej końców karboksylowych zarówno alfa- jak i beta-tubuliny, łańcuchów bocznych zbudowanych z jednej (monoglutamylacja) lub wielu (poliglutamylacja) reszt kwasu glutaminowego [29]. Glutamylacja powoduje zatem znaczący wzrost ujemnego ładunku końca karboksylowego tubuliny, a tym samym zwiększa powinowactwo spastyny i w mniejszym stopniu kataniny, do mikrotubul oraz tempo cięcia mikrotubul przez spastynę, zarówno in vitro jak i in vivo, zwłaszcza w przypadku poliglutamylacji [30]. „Maskowanie” końców karboksylowych tubuliny przez przeciwciała skierowane przeciwko glutamylowanej tubulinie obniża poziom cięcia mikrotubul [10]. W odróżnieniu od glutamylacji, acetylacja jest modyfikacją końca aminowego alfa- tubuliny, polegającą na przyłączeniu grupy acetylowej do reszty lizyny 40 eksponowanej do wnętrza mikrotubuli [29]. W fibroblastach poziom acetylacji tubuliny wzdłuż długich mikrotubul jest nierównomierny, a nadprodukowana katanina preferencyjnie tnie mikrotubule w rejonach charakteryzujących się wyższym poziomem acetylacji. Natomiast obniżenie poziomu acetylacji, zmniejsza wrażliwość mikrotubul na aktywność tnącą kataniny [31]. Podobną zależność pomiędzy poziomem acetylacji mikrotubul a aktywnością kataniny obserwowano 48 www.postepybiochemii.pl w dendrytach komórek nerwowych (w aksonach działanie kataniny jest hamowane przez białko tau (opis niżej) [31]. Wyciszenie poziomu ekspresji genu kataniny w komórkach tłuszczowych opóźnia reorganizację cytoszkieletu komórek tłuszczowych w czasie ich różnicowania. Podobny efekt w komórkach tłuszczowych powoduje synteza zmutowanej, niepodlegającej acetylacji alfa-tubuliny (K40R). Wyniki te sugerują, że katanina bierze udział w reorganizacji cytoszkieletu komórek tłuszczowych oraz, że aktywność tnąca kataniny może być regulowana przez poziom acetylacji tubuliny [32]. Właściwy poziom acetylacji mikrotubul i aktywności kataniny odgrywają również ważną rolę w prawidłowym rozwoju połączeń nerwowo-mięśniowych w czasie rozwoju muszki owocowej Drosophila melanogaster [33]. Niestety, brak równoległych badań in vitro uniemożliwia stwierdzenie czy poziom acetylacji tubuliny wpływa bezpośrednio, czy też pośrednio (np. przez zmiany poziomu innych modyfikacji potranslacyjnych lub oddziaływań z białkami MAP) na wrażliwość acetylowanych mikrotubul na kataninę. W przeciwieństwie do kataniny, wydaje się, że poziom acetylacji mikrotubul nie wpływa na aktywność spastyny [31]. Oddziaływanie białek tnących mikrotubule z mikrotubulami jest regulowane również przez strukturalne białka MAP. Mikrotubule w aksonach neuronów charakteryzują się wysokim poziomem acetylacji, jednak w przeciwieństwie do mikrotubul zlokalizowanych w ciele komórki i w dendrytach są one bardziej odporne na fragmentację przez kataninę. Odporność ta związana jest z obecnością białka tau [34]; usunięcie białka tau powoduje fragmentację mikrotubul w aksonach podobnie jak ma to miejsce w pozostałych przedziałach komórki. Analiza cytoszkieletu mikrotubularnego neuronów z eksperymentalnie obniżonym poziomem ekspresji genów białek MAP (MAP1B, MAP2, MAP4) i jednocześnie podwyższonym poziomem ekspresji genu kataniny oraz cytoszkieletu mikrotubularnego fibroblastów, w których poddano nadprodukcji kataninę oraz neuronalne białka MAP (w tym również białko tau) wykazała, że obecność białek MAP2, MAP4 oraz tau chroni mikrotubule przed aktywnością kataniny, podczas gdy obecność MAP1B nie wpływa na ten proces [34,35]. W komórkach roślinnych podobną „ochronną” rolę pełni należące do białek MAP, białko SPR2 [36]. Tempo cięcia mikrotubul zależy również od poziomu syntezy i poziomu aktywności enzymów tnących mikrotubule. W oocytach nicienia C. elegans katanina p60, kodowana przez gen MEI-1, musi ulec degradacji przed rozpoczęciem pierwszego podziału mitotycznego zarodka. Synteza nowego białka MEI-1 w okresie między mejozą a pierwszym podziałem mitotycznym jest hamowana przez przyłączenie represorów translacji, białek OMA-1 i OMA-2, do niepodlegającego translacji końca 3’ (3’UTR) mRNA kataniny MEI-1. Przypuszcza się, że związane z 3’UTR białko OMA-1, rekrutuje do miejsca wiązania białko SNP-2, które z kolei, wiążąc się z czynnikiem inicjującym translację, elF4E, hamuje inicjację translacji [37]. Regulacja na poziomie inicjacji translacji (i transkrypcji) może prowadzić do powstania różnych izoform tego samego białka. W komórkach ssaków zidentyfikowano cztery izoformy spastyny różniące się lokalizacją i zaangaPostępy Biochemii 62 (1) 2016 żowaniem w procesy komórkowe. Izoformy te różnią się miejscem inicjacji translacji (Met1 i Met87) oraz dodatkowo posiadaniem lub brakiem 32-aminokwasowego fragmentu kodowanego przez ekson 4 [12]. We wszystkich badanych organizmach, aktywność kataniny p60 jest modulowana przez białko adaptorowe/regulatorowe, p80, które zwiększa aktywność kataniny oraz jej powinowactwo do mikrotubul [11,20]. Chociaż katanina była zidentyfikowana jako heterodimer, badania poziomu syntezy obu podjednostek podczas rozwoju zarodka szczura oraz w różnych tkankach osobników dorosłych szczura i myszy wykazały wahania w stosunku ilościowym tych białek, co sugeruje, że aktywność kompleksu kataniny może być kontrolowana przez regulację poziomu syntezy p80 w stosunku do p60 [38,39]. Stabilność i aktywność kompleksu kataniny p60 z podjednostką regulatorową p80 zależy w dużym stopniu od właściwości tych białek i ich modyfikacji potranslacyjnych. Przyłączenie podjednostki regulatorowej p80 zwiększa nie tylko aktywność, ale i stabilność kompleksu kataniny [40]. Wydaje się, że rola białka p80 w regulacji aktywności kataniny p60 jest jednak bardziej złożona. Badania in vitro i in vivo wykazały, że nadprodukcja karboksylowego fragmentu białka p80, pozbawionego motywów WD-40, zwiększa aktywność kataniny p60 bardziej niż nadprodukcja białka p80 o pełnej długości. Z drugiej strony, nadprodukcja końca aminowego zawierającego 6 motywów WD40, hamuje aktywność kataniny p60 [11]. Z kolei badania na Drosophila melanogaster wykazały, że aminowy fragment kataniny obejmujący domenę MIT oraz słabo zachowaną w toku ewolucji, część łącznikową, pełni ważną rolę w regulacji degradacji kataniny. Po pierwsze, fragment ten intensyfikuje zależną od aktywności proteasomu, degradację kataniny (lub osłabia degradację po przyłączeniu podjednostki p80); po drugie, region ten bierze udział w niezależnym od ATP wiązaniu do mikrotubul, wzmacniając oddziaływanie między kataniną a ciętą mikrotubulą [40]. W oocytach żaby z rodzaju Xenopus, aktywność kataniny ulega zahamowaniu w wyniku fosforylacji stosunkowo słabo zachowanej w toku ewolucji reszty seryny 131 [41,42]. Białko MEI-1, homolog kataniny p60 nicienia u C. elegans występuje w sześciu izoformach, różniących się poziomem fosforylacji [43]. Zatem wpływ fosforylacji jako modyfikacji na aktywność i stabilność kataniny jest zachowany w toku ewolucji przy czym, modyfikacja ta może dotyczyć różnych reszt aminokwasowych. Badania mutantów C. elegans wykazały, że defosforylacja MEI-1 pod wpływem kompleksu fosfatazy serynowo-treoninowej, PP4 (ang. protein phosphatase 4) powoduje wzrost aktywności kataniny podczas mejozy [43,44], natomiast fosforylacja MEI-1 przez kinazę MBK-2 (ang. minibrain kinase homolog 2), negatywnie reguluje aktywność kataniny i poprzedza jej degradację [45,46]. Kinaza MBK-2 należy do rodziny kinaz o podwójnej aktywności (DYRK2, ang. dual-specificity tyrosine-phosphorylation-regulated kinase), regulowanych przez autofosforylację reszty tyrozynowej. Również w komórkach ssaczych fosforylacja przez kinazę DYRK2 jest niezbędna do inaktywacji i degradacji kataniny [47]. Fosforylacja białek często poprzedza ich ubikwitylację i degradację [48], a w konsekwencji usunięcie zbędnego lub 49 nieprawidłowego białka z komórki. U nicienia C. elegans, katanina jest zaangażowana w regulację wrzeciona mejotycznego, ale musi być usunięta z komórki przed rozpoczęciem mitozy, tj. w ciągu około 15 minut od ukończenia mejozy [49,50]. Proces ten odbywa się na dwóch poziomach: (i) zahamowania syntezy nowego białka, o którym wspomniano powyżej i (ii) degradacji MEI-1. Degradacja MEI-1 zależy od dwóch równolegle zachodzących procesów, fosforylacji MEI-1 przez kinazę MBK-2, która osiąga najwyższy poziom tuż po ukończeniu mejozy [45,46] oraz od obecności białka adaptorowego MEL-26, którego poziom w komórce wzrasta również tuż po ukończeniu mejozy [51]. Białko adaptorowe MEL-26 rekrutuje kataninę MEI-1 do białka Cullin 3, które stanowi rusztowanie dla ligazy E3 ubikwityny, [45,46,51], prowadząc do degradacji MEI-1 na drodze zależnej od proteasomów. Zależna od ubikwityny degradacja kataniny wydaje się być mechanizmem zachowanym w toku ewolucji. Homologiczna do MBK-2, ssacza kinaza DYRK2 nie tylko fosforyluje kataninę p60, ale również stanowi rusztowanie dla kompleksu ligazy E3 ubikwityny, EDD, która jest zaangażowana w degradację kataniny [47]. W ssaczych fibroblastach poziom kataniny p60 podczas mitozy jest regulowany również przez kompleks Cul3 / ligaza E3 ubikwityny [52], a w szczurzych neuronach stabilność kataniny jest regulowana przez dwa antagonistycznie działające białka, ligazę E3 ubikwityny, CHIP (ang. C-terminus of Hsp70-interacting protein) i deubikwitynazę USP47 [53]. U C. elegans białko adaptorowe MEL-26 i tworzące rusztowanie białko Cullin 3 biorą również udział w degradacji białka podobnego do fidżetyny [54]. Nasza wiedza na temat regulacji poziomu i aktywności białek tnących mikrotubule w różnych typach komórek jest niepełna, jeśli nie szczątkowa. Wydaje się, że dopiero zaczynamy poznawać i rozumieć złożoność i wielopoziomowość mechanizmów regulujących działanie tych białek, zarówno na poziomie mikrotubul jak i samych enzymów. ROLA BIAŁEK TNĄCYCH MIKROTUBULE W odróżnieniu od białek depolimeryzujących mikrotubule, które działają jedynie na ich końce, białka tnące mikrotubule, przecinając mikrotubule, prowadzą do powstania wielu krótkich mikrotubul, które mogą służyć jako matryce do polimeryzacji nowych mikrotubul i / lub być transportowane w miejsca reorganizacji cytoszkieletu [3,55]. W ciągu ostatnich dwudziestu lat dokonał się ogromny postęp w poznaniu i zrozumieniu funkcji białek tnących mikrotubule w różnorodnych procesach komórkowych. Wykazano, że białka te biorą udział w reorganizacji cytoszkieletu, są zaangażowane w regulację wrzeciona podziałowego i ruch chromosomów w trakcie mejozy oraz mitozy, cytokinezę, migrację komórek, funkcjonowanie oraz plastyczność neuronów, powstawanie wici i rzęsek oraz organizację cytoszkieletu mikrotubularnego roślin [4]. PIŚMIENNICTWO 1. Lyle K, Kumar P, Wittmann T (2009) SnapShot: Microtubule Regulators I. Cell 136: 380, 380.e1 2. Lyle K, Kumar P, Wittmann T (2009) SnapShot: Microtubule regulators II. Cell 136: 566, 566.e1 3. Roll-Mecak A, McNally FJ (2010) Microtubule-severing enzymes. Curr Opin Cell Biol 22: 96-103 4. Sharp DJ, Ross JL (2012) Microtubule-severing enzymes at the cutting edge. J Cell Sci 125: 2561-2569 5. Howard J, Hyman AA (2007) Microtubule polymerases and depolymerases. Curr Opin Cell Biol 19: 31-35 6. Vale RD (1991) Severing of stable microtubules by a mitotically activated protein in Xenopus egg extracts. Cell 64: 827-839. 7. McNally FJ, Vale RD (1993) Identification of katanin, an ATPase that severs and disassembles stable microtubules. Cell 75: 419-429 8. Roll-Mecak A, Vale RD (2005) The Drosophila homologue of the hereditary spastic paraplegia protein, spastin, severs and disassembles microtubules. Curr Biol 15: 650-655 9. White SR, Evans KJ, Lary J, Cole JL, Lauring B (2007) Recognition of C-terminal amino acids in tubulin by pore loops in Spastin is important for microtubule severing. J Cell Biol 176: 995-1005 10. Roll-Mecak A, Vale RD (2008) Structural basis of microtubule severing by the hereditary spastic paraplegia protein spastin. Nature 451: 363-367 11. McNally KP, Bazirgan OA, McNally FJ (2000) Two domains of p80 katanin regulate microtubule severing and spindle pole targeting by p60 katanin. J Cell Sci 113: 1623-1633 12. Lumb JH, Connell JW, Allison R, Reid E (2012) The AAA ATPase spastin links microtubule severing to membrane modelling. Biochim Biophys Acta 1823: 192-197 13. Sonbuchner TM, Rath U, Sharp DJ (2010) KL1 is a novel microtubule severing enzyme that regulates mitotic spindle architecture. Cell Cycle 9: 2403-2411 14. Kim MH, Cooper DR, Oleksy A, Devedjiev Y, Derewenda U, Reiner O, Otlewski J, Derewenda ZS (2004) The structure of the N-terminal domain of the product of the lissencephaly gene Lis1 and its functional implications. Structure 12: 987-998 15. Salinas S, Carazo-Salas RE, Proukakis C, Schiavo G, Warner TT (2007) Spastin and microtubules: Functions in health and disease. J Neurosci Res 85: 2778-2782 16. Grüneberg H (1943) Two new mutant genes in the house mouse. J Genet 45: 22-28 17. Cox GA, Mahaffey CL, Nystuen A, Letts VA, Frankel WN (2000) The mouse fidgetin gene defines a new role for AAA family proteins in mammalian development. Nat Genet 26: 198-202 18. Hartman JJ, Vale RD (1999) Microtubule disassembly by ATP-dependent oligomerization of the AAA enzyme katanin. Science; 286: 782785 19. Johjima A, Noi K, Nishikori S, Ogi H, Esaki M, Ogura T (2015) Microtubule severing by katanin p60 AAA+ ATPase requires the C-terminal acidic tails of both α- and β-tubulins and basic amino acid residues in the AAA+ ring pore. J Biol Chem 290: 11762-11770 20. Hartman JJ, Mahr J, McNally K, Okawa K, Iwamatsu A, Thomas S, Cheesman S, Heuser J, Vale RD, McNally FJ (1998) Katanin, a microtubule-severing protein, is a novel AAA ATPase that targets to the centrosome using a WD40-containing subunit. Cell 93: 277-287 21. Ogura T, Matsushita-Ishiodori Y, Johjima A, Nishizono M, Nishikori S, Esaki M, Yamanaka K (2008) From the common molecular basis of the AAA protein to various energy-dependent and -independent activities of AAA proteins. Biochem Soc Trans 36: 68-71 22. Paschal BM, Obar RA, Vallee RB (1989) Interaction of brain cytoplasmic dynein and MAP2 with a common sequence at the C terminus of tubulin. Nature 342: 569-572 23. Lu C, Srayko M, Mains PE (2004) The Caenorhabditis elegans microtubule-severing complex MEI-1/MEI-2 katanin interacts differently with two superficially redundant beta-tubulin isotypes. Mol Biol Cell 15: 142-150 24. Matsushita-Ishiodori Y, Yamanaka K, Hashimoto H, Esaki M, Ogura T (2009) Conserved aromatic and basic amino acid residues in the pore region of Caenorhabditis elegans spastin play critical roles in microtubule severing. Genes Cells 14: 925-940 25. Srayko M, O’Toole ET, Hyman AA, Müller-Reichert T (2006) Katanin disrupts the microtubule lattice and increases polymer number in C. elegans meiosis. Curr Biol 16: 1944-1949 50 www.postepybiochemii.pl 26. Hyman AA, Chretien D, Arnal I, Wade RH (1995) Structural changes accompanying GTP hydrolysis in microtubules: information from a slowly hydrolyzable analogue guanylyl-(alpha,beta)-methylene-diphosphonate. J Cell Biol 128: 117-125 27. Arnal I, Wade RH (1995) How does taxol stabilize microtubules? Curr Biol 5: 900-908 28. Díaz-Valencia JD, Morelli MM, Bailey M, Zhang D, Sharp DJ, Ross JL (2011) Drosophila katanin-60 depolymerizes and severs at microtubule defects. Biophys J 100: 2440-2449 29. Verhey KJ, Gaertig J (2007) The tubulin code. Cell Cycle 6: 2152-2160 30. Lacroix B, Van Dijk J, Gold ND, Guizetti J, Aldrian-Herrada G, Rogowski K, Gerlich DW, Janke C (2010) Tubulin polyglutamylation stimulates spastin-mediated microtubule severing. J Cell Biol 189: 945-954 31. Sudo H, BaaS PW (2010) Acetylation of microtubules influences their sensitivity to severing by katanin in neurons and fibroblasts. J Neurosci 30: 7215-7226 32. Yang W, Guo X, Thein S, Xu F, Sugii S, Baas PW , Radda GK, Han W (2013) Regulation of adipogenesis by cytoskeleton remodelling is facilitated by acetyltransferase MEC-17-dependent acetylation of α-tubulin. Biochem J 449: 605-612 41. Loughlin R, Wilbur JD, McNally FJ, Nédélec FJ, Heald R (2011) Katanin contributes to interspecies spindle length scaling in Xenopus. Cell 147: 1397-1407 42. Whitehead E, Heald R, Wilbur JD (2013) N-terminal phosphorylation of p60 katanin directly regulates microtubule severing. J Mol Biol 425: 214-221 43. Gomes JE, Tavernier N, Richaudeau B, Formstecher E, Boulin T, Mains PE, Dumont J, Pintard L (2013) Microtubule severing by the katanin complex is activated by PPFR-1-dependent MEI-1 dephosphorylation. J Cell Biol 202: 431-439 44. Han X, Gomes JE, Birmingham CL, Pintard L, Sugimoto A, MainS PE (2009) The role of protein phosphatase 4 in regulating microtubule severing in the Caenorhabditis elegans embryo. Genetics 181: 933-943 45. Lu C, Mains PE (2007) The C. elegans anaphase promoting complex and MBK-2/DYRK kinase act redundantly with CUL-3/MEL-26 ubiquitin ligase to degrade MEI-1 microtubule-severing activity after meiosis. Dev Biol 302: 438-447 46. Stitzel Ml, Pellettieri J, Seydoux G (2006) The C. elegans DYRK kinase MBK-2 marks oocyte proteins for degradation in response to meiotic maturation. Curr Biol 16: 56-62 33. Mao CX, Xiong Y, Xiong Z, Wang Q, Zhang YQ, Jin S (2014) Microtubule-severing protein Katanin regulates neuromuscular junction development and dendritic elaboration in Drosophila. Development 141: 1064-1074 47. Maddika S, Chen J (2009) Protein kinase DYRK2 is a scaffold that facilitates assembly of an E3 ligase. Nat Cell Biol 11: 409-419 34. McNally KP, Buster D, McNally FJ (2002) Katanin-mediated microtubule severing can be regulated by multiple mechanisms. Cell Motil Cytoskeleton 53: 337-349. 49. Clark-Maguire S, Mains PE (1994) Localization of the mei-1 gene product of Caenorhaditis elegans, a meiotic-specific spindle component. J Cell Biol 126: 199-209 35. Qiang L, Yu W, Andreadis A, Luo M, Baas PW (2006) Tau protects microtubules in the axon from severing by katanin. J Neurosci 26: 3120-3129 50. Yang HY, McNally K, McNally FJ (2003) MEI-1/katanin is required for translocation of the meiosis I spindle to the oocyte cortex in C elegans. Dev Biol 260: 245-259 36. Wightman R, Chomicki G, Kumar M, Carr P, Turner SR (2013) SPIRAL2 determines plant microtubule organization by modulating microtubule severing. Curr Biol 23: 1902-1907 51. Johnson JL, Lu C, Raharjo E, McNally K, McNally Fj, Mains PE (2009) Levels of the ubiquitin ligase substrate adaptor MEL-26 are inversely correlated with MEI-1/katanin microtubule-severing activity during both meiosis and mitosis. Dev Biol 330: 349-357 37. Li W, Debella LR, Guven-Ozkan T, Lin R, Rose LS (2009) An eIF4E-binding protein regulates katanin protein levels in C. elegans embryos. J Cell Biol 187: 33-42 38. Yu W, Solowska JM, Qiang L, Karabay A, Baird D, Baas PW (2005) Regulation of microtubule severing by katanin subunits during neuronal development. J Neurosci 25: 5573-5583 39. O’Donnell L, Rhodes D, Smith SJ, Merriner DJ, Clark BJ, Borg C, Whittle B, O’Connor AE, Smith LB, McNally FJ, De Kretser DM, Goodnow CC, Ormandy CJ, Jamsai D, O’Bryan MK, Ogura T (2012) An essential role for katanin p80 and microtubule severing in male gamete production. PLoS Genet 8: e1002698 40. Grode KD, Rogers SL (2015) The non-catalytic domains of Drosophila katanin regulate its abundance and microtubule-disassembly activity. PLoS One 10: e0123912 48. Hunter T (2007) The age of crosstalk: phosphorylation, ubiquitination, and beyond. Mol Cell 28: 730-738 52. Cummings CM, Bentley CA, Perdue SA, Baas PW, Singer JD (2009) The Cul3/Klhdc5 E3 ligase regulates p60/katanin and is required for normal mitosis in mammalian cells. J Biol Chem 284: 11663-11675 53. Yang SW, Oh KH, Park E, Chang HM, Park JM, Seong MW, Ka SH, Song WK, Park DE, Baas PW, Jeon YJ, Chung CH J (2013) USP47 and C terminus of Hsp70-interacting protein (CHIP) antagonistically regulate katanin-p60-mediated axonal growth. Neurosci 33: 12728-12738 54. Luke-Glaser S, Pintard L, Tyers M, Peter M (2007) The AAA-ATPase FIGL-1 controls mitotic progression, and its levels are regulated by the CUL-3MEL-26 E3 ligase in the C. elegans germ line. J Cell Sci 120: 3179-3187 55. Baas PW, Karabay A, Qiang L (2005) Microtubules cut and run. Trends Cell Biol 15: 518-524 Microtubule severing proteins – structure and activity regulation Ewa Wacławek, Dorota Włoga* Laboratory of Cytoskeleton and Cilia Biology, Department of Cell Biology, Nencki Institute of Experimental Biology, Polish Academy of Sciences, Warsaw; 3 Pasteur St., 02-093 Warsaw, Poland * e-mail: [email protected] Key words: microtubule severing proteins, katanin, spastin, fidgetin, microtubules ABSTRACT Microtubule severing proteins, katanin, spastin and fidgetin cause local destabilization of the microtubules structure. This ATP-dependent activity leads to the shortening or disassembly of the existing microtubules. The generated short microtubule fragments may serve as templates to polymerize new microtubules and in consequence, the activity of the microtubule severing proteins leads to the reorganization of the microtubular cytoskeleton. This review summarizes current knowledge concerning structural organization of the microtubule severing proteins, the molecular mechanism of their action, factors that regulate the level of the katanin and spastin within the cells and their microtubule severing activity. Postępy Biochemii 62 (1) 2016 51