Transcript
WIRUSY CHOROBOTWÓRCZE DLA CZŁOWIEKA TOK BADANIA WIRUSOLOGICZNEGO METODY STOSOWANE W DIAGNOSTYCE WIRUSOLOGICZNEJ
Katedra i Zakład Mikrobiologii Lekarskiej Anna Majewska Warszawa, 2016
OGÓLNA CHARAKTERYSTYKA WIRUSÓW •
Małe rozmiary (20 nm-300 średnicy)
•
Brak budowy komórkowej
•
Zależą całkowicie od żywych komórek
•
Nie rosną na podłożach sztucznych
•
Bezwzględne pasożytnictwo wewnątrzkomórkowe
•
Posiadają jeden rodzaj kwasu nukleinowego
• Nie namnażają się przez podziały •
Są niewrażliwe na antybiotyki
Budowa wirusa kwas nukleinowy (DNA lub RNA) DNA jest zwykle dwuniciowy (wyjątek parwowirusy)
RNA jest zwykle jednoniciowy (wyjątek reowirusy) jednoniciowy RNA - o dodatniej (mRNA) lub ujemnej polarności (transkrypcja
do kopii o dodatniej polarności)
kwas nukleinowy + kapsyd = nukleokopsyd
Funkcje kapsydu:
• ochronna • udział w adsorpcji i wnikaniu wirusa do komórki przez interakcje z receptorami błony komórkowej
pojedynczy segment wielosegmentowy
Nukleokapsyd o symetrii ikosaedralnej
adenowirusy herpeswirusy pikornawirusy
liczba kapsomerów jest cechą taksonomiczną
Nukleokapsyd o symetrii helikalnej (spiralnej) • kapsomery spiralnie otaczają kwas nukleinowy
• wydłużony kształt rabdowirusy filowirusy
wirus Ebola
Osłonka nabyta z błony komórkowej podczas późnych faz replikacji glikoproteiny przyleganie do receptorów komórkowych pobudzanie interakcji z białkami nukleokapsydu (dojrzewanie potomnych cząstek wirusa)
osłonka wirusa
wszystkie wirusy o symetrii helikalnej wirusy o symetrii ikosaedralnej: togawirusy herpeswirusy retrowirusy flawiwirusy
wirusy bezosłonkowe
oporne na wysuszenie, detergenty, ekstremalne pH i temperatury przenoszone droga oddechową i fekalno-oralną
wirusy osłonkowe wymagają wilgotnego środowiska, wrażliwe na kwasy i detergenty
Białka wirusowe strukturalne enzymatyczne
polimerazy wirusowe (replikacja)
proteazy
modyfikacja dużych protein w procesie translacji, uwolnienie kwasu nukleinowego z nukleokapsydu
endonukleazy i ligazy (replikacja)
Postaci pozakomórkowa spoczynkowa – wirion wewnątrzkomórkowa aktywna – pozbawiony białkowego płaszcza
komórka zarażona wirusem wścieklizny: liczne wirusy (szare, pałeczkowate struktury) i większe, ciemniejsze ciałka wtrętowe Negriego
Kryteria uwzględniane w klasyfikacji wirusów wygląd, kształt i wielkość, cechy kwasu nukleinowego,
•
typ,
•
liczba nici i ich postać (s, ds, liniowy, kolisty),
•
liczba segmentów,
•
masa cząsteczkowa,
•
polarność genomu wirusowego,
symetria nukleokapsydu,
obecność osłonki lub jej brak, stopień pokrewieństwa antygenowego,
Replikacja wirusów • adsorpcja • wniknięcie • odpłaszczenie • synteza białek wczesnych • powielenie genomu • synteza białek późnych • składanie i dojrzewanie wirionów
potomnych • uwolnienie dojrzałych wirionów
WIRUS
RECEPTOR
RECEPTOR
KOMÓRKOWY
WIRUSOWY
Reowirusy
HIV
cząstka CD4
gp120
sialyloligosacharydy
hemaglutynina
Ortomyksowirus Wirus grypy Rabdowirus Wirus wścieklizny
receptor acetylocholinowy
białko G
receptor hepatocytowy
Pre-S
Hepadnawirusy HBV
Penetracja
Fuzja wirusowej osłonki z błona komórkową
Białko fuzji, doprowadza do połączenia osłonki wirusowej z błoną komórkową, do cytoplazmy dostaje się nukleokapsyd, z którego uwalnia się kwas nukleinowy (odpłaszczanie)
Translokacja – bezpośrednie przejście wirusa przez błonę komórkową, małe wirusy
penetracja
Endocytoza
Wpuklenie błony komórkowej. Wirus zamknięty w pęcherzyku pokrytym klarytyną, który wędruje w głąb cytoplazmy
odpłaszczanie proteazy wirusowe trawią białka ochronne uwolnienie kwasów nukleinowych
synteza
Replikacja kwasu nukleinowego
Synteza białek wirusowych
DNA przemieszcza się do jądra komórkowego
Dojrzewanie – formowanie wirionów potomnych
wirusy osłonkowe egzocytoza, odzyskanie osłonki lipoproteinowej (ortomyksowirusy, paramyksowirusy)
wirusy nagie – liza komórki
Wirusy lityczne Cykl rozwojowy wirusa doprowadzający do rozpadu (lizy) atakowanej komórki
Wirus wnika do komórki, „zmusza” ją do powielenia wirusowego kwasu nukleinowego i do syntezy wirusowych białek.
Powstają potomne cząsteczki wirusa, które opuszczają komórkę, niszcząc ją.
Wirusy lizogenne Wirus nie powoduje śmierci komórki, ulega włączeniu do komórkowego DNA. DNA wirusa jest przekazywany komórkom potomnym w procesach podziałów komórkowych. Zjawisko to uznaje się za przyczynę niektórych zmian nowotworowych, a wirusy je wywołujące nazywamy wirusami onkogennymi.
Drogi zakażenia powietrzna inhalacyjna
pokarmowa fekalno-oralna wertykalna krwiopochodna kontakt płciowy wektory autoinokulacja kontakt bezpośredni (zakażone powierzchnie)
Zakażenie pierwotne Zakażenie wtórne (latencja)
Zakażenie miejscowe
Zakażenie narządowe
Wiremia
zakażenie narządów docelowym (tropizm OUN, wątroba, płuca, jelita, skóra, wirusy pantropowe)
latencja zakażenie latentne, utajone
komórki nerwowe – HSV-1, HSV-2, HHV-3 limfocyty B – HHV-4 (EBV) limfocyty T – HHV-5 (CMV) reaktywacja ze stanu latencji – czynniki reaktywacji: bodźce termiczne, psychiczne, fizyczne, hormonalne, zakaźne
OBJAWY ZAKAŻENIA pierwsze objawy: gorączka, bóle mięśniowe, złe samopoczucie – aktywacja dopełniacza i uwalnianie cytokin objawy miejscowe – wysypka, obrzęk ślinianek, nieżyt nosa – działanie cytopatogenne wirusa
objawy narządowe – ostra faza choroby procesy nowotworowe
zakażenia przetrwałe – retrowirusy, papillomawirusy
zakażenia wertykalne – zakażenie płodu, noworodka
materiał diagnostyczny wczesna postekspozycja faza objawów klinicznych (wirusy oddechowe) ozdrowieńcy kontrola postępów leczenia
wymaz z błony śluzowej nosa i gardła plwocina krew/surowica krwi moc, kał wymazy ze zmian skórnych, zeskrobiny aspiraty fragmenty tkanek
metody diagnostyczne obraz kliniczny hodowla komórkowa,
obserwacja mikroskopowa: CPE, immunofluorescencja, mikroskopia
elektronowa wykrywanie „składników” wirusowych
wykrywanie przeciwciał
Hodowla wirusów diagnozowanie zakażeń badania naukowe
produkcja antygenów (szczepionki, testy diagnostyczne)
Metody hodowli hodowle komórkowe żywe układy: zwierzęta laboratoryjne zarodki ptasie
ZARODKI PTASIE KURZE - 1931 rok - KACZE, PRZEPIÓRKI JAPOŃSKIE
wirus świnki wirus grypy
zwierzęta laboratoryjne (myszy, świnki morskie, króliki, chomiki)
HODOWLE KOMÓRKOWE (1925rok – WIRUS KROWIANKI W HODOWLI TKANKOWEJ, F. PARKER )
Hodowle komórkowe PIERWOTNE
Komórki uzyskane ze świeżo izolowanych tkanek lub narządu WTÓRNE - USTABILIZOWANE
PÓŁCIĄGŁE
CIĄGŁE
diploidalne,
aneuploidalne,
ograniczona liczba pasaży (40-50),
najczęściej wywodzą się
utrzymują swój garnitur chromosomalny,
z tkanki nowotworowej,
ulegają aberracji i degeneracji,
VERO, HeLa,
(MRC-5, WI-38),
Hodowle komórkowe Hodowla w naczyniach – szkło, nietoksyczny plastik – przyleganie do powierzchni tworząc jednowarstwową hodowlę – monolayer
Hodowla w zawiesinie – mieszadła magnetyczne
Pożywki do hodowli komórkowych zawierają - cukry, - aminokwasy, - witaminy, - sole mineralne, - związek buforujący (do pH 7,2-7,4), - wskaźnik barwny pH, - antybiotyki, - surowicę (najczęściej płodową cielęcą) w stężeniu 10-20%
pożywka wzrostowa
w stężeniu 2-5%
pożywka utrzymująca
WARUNKI HODOWLI
temperatura 37ºC,
stężenie CO2 5%,
wilgotność
Permisywność
Wirus zakaża się i replikuje tylko w tych liniach komórkowych, których
komórki zawierają odpowiedni dla gatunku wirusa receptor (komórki permisywne, zezwalające)
NAZWA
TKANKA
POCHODZENIE
WIRUS MORFOLOGIA
HeLa
człowiek
rak szyjki macicy
nabłonkowa
Polio 1, adenowirusy, herpeswirusy
Hep-2
człowiek
rak krtani
nabłonkowa
Polio 1, adenowirusy, flawiwirusy
nerka
fibroblasty
adenowirusy, herpeswirusy
BHK-21 chomik
Vero
małpa
nerka
nabłonkowa
SV 40, herpeswirusy
WI-38
człowiek
płuca
fibroblasty
Polio 1, 2, VSV, adenowirusy
PK
świnia
nerka
nabłonkowa
VSV, Coxsackie B2 - B6, flawiwirusy, herpeswirusy
nie wszystkie wirusy mogą namnażać się we wszystkich liniach komórkowych, wirus replikuje się tylko w komórce permisywnej tj. zezwalającej, która posiada odpowiedni dla danego wirusa receptor.
Hodowle komórkowe stosowane w celach diagnostycznych, naukowych, produkcyjnych
VERO
Vero (komórki nabłonkowe z zielonej małpy afrykańskiej)
wielojądrowe komórki olbrzymie
Micrograph showing the viral cytopathic effect of herpes simplex virus (multi-nucleation, ground glass chromatin).
A – okołojądrowe „halo” , powiększone hyperchromatyczne jądro B – duże jądro, nieregularne rozmieszczenie chromatyny, nieregularna osłonka
HAdV – ludzkie adenowirusy
Metody wykrywania wirusów
ZMIANY CYTOPATYCZNE (CPE) WTRĘTY- ciałka wtrętowe, widoczne w barwionych, zakażonych komórkach za pomocą mikroskopu świetlnego. Są to skupiska wirusów lub wirusy otoczone komórkowymi elementami białkowymi i lipidowymi lub składniki komórkowe powstałe pod wpływem zmienionego metabolizmu zakażonej komórki.
wtręty cytoplazmatyczne
wtręty jądrowe (herpeswirusy) Wtręty A (HSV, VZV) – ostro odgraniczone, otoczone jasną przestrzenią od chromatyny jądrowej Wtręty B (poliowirus, żółtej febry) – mniejsze.
Wtręty jądrowe i cytoplazmatyczne (wirus odry)
CPE - wirus odry w linii komórkowej HeLa, syncytia, wtręty cytoplazmatyczne (barwienie hematoksyliną)
Hepatocyt – wewnatrzjądrowe wtręty, otoczone strefą „halo”. barwienie H&E.
Wielojądrzaste komórki olbrzymie syncytia np. paramyksowirusy, herpeswirusy
Skupiska powiększonych i zaokrąglonych komórek, utrata mostków cytoplazmatycznych (grona winogron) - adenowirusy
zaokrąglenie i obkurczenie komórek. liza (zniszczenie warstwy komórek) np. poliowirus
Efekt cytopatyczny powodowany przez wirusa HHV-1 hodowla prawidłowa (linia Vero)
CPE
Efekt cytopatyczny powodowany przez poliowirusy
hodowla prawidłowa (linia Vero)
CPE c
Efekt cytopatyczny powodowany przez cytomegalowirusa
Efekt cytopatyczny powodowany przez wirusa Coxsackie A hodowla prawidłowa (linia PMK)
CPE
Transformacja nowotworowa komórek wzrost jednowarstwowy zastąpiony jest chaotycznym i wielowarstwowym, grudkowate skupiska, aberracje chromosomów
HHV-8
Mięsak Kaposiego
HPV – typy onkogenne
HHV-4 (EBV) Chłoniak Burkitta
ZMIANY NIECYTOPATYCZNE
1. Hemadsorpcja ortomyksowirusy, paramyksowirusy
2. Interferencja podwójne zakażenie = oporność na zakażenie komórki innym wirusem
Hemaglutynacja [Hirst 1941] Stosowania do wykrywania wirusów posiadających na swej otoczce hemaglutyniny np. wirusa grypy
Uwolnione wirusy w pożywce hodowlanej
+ krwinki czerwone = aglutynacja erytrocytów konglomeraty erytrocytarnowirusowe
Dokładna identyfikacja wirusa namnożonego w hodowli komórkowej wymaga zastosowania dodatkowych technik diagnostycznych
zdjęcia wykorzystane w prezentacji pochodzą z ogólnie dostępnych stron internetowych
