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RESUMO PROVA 1 Otimização de parâmetros cromatográficos para uma boa separação O objetivo principal de uma análise por CG é obter picos estreitos e bem separados em um tempo relativamente rápido . Tal objetivo só pode ser alcançado através de uma avaliação correta dos parâmetros que determinam a utilização otimizada das capacidades da coluna. Tais parâmetros são, em resumo, os seguintes: a) Parâmetros relacionados a velocidade de migração dos solutos: Coeficiente de partição - K A relação segundo a qual uma substância se reparte entre a fase móvel e a fase estacionária é dada pelo coeficiente de partição. Tempo de retenção – tr Corresponde ao tempo total que a molécula necessita para migrar através da coluna desde a injeção até o detector Velocidade linear média de migração Fator capacidade – k’: k' descreve o quanto o soluto é retido em relação ao metano em uma determinada coluna. k’ pode ser variado trocando a temperatura da coluna e/ou fase estacionária. Seletividade Indica quanto uma coluna é mais seletiva para um componente em relação ao outro. Sua principal utilidade é fornecer uma medida de como a coluna irá separar os dois componentes. Quanto maior a seletividade, maior a separação entre dois componentes. A seletividade pode ser variada trocando a fase móvel, composição da fase estacionária e/ou temperatura da coluna. b) Eficiência da coluna e alargamento da banda A eficiência de uma coluna é medida em termos de altura equivalente a um prato teórico (H) e o número de pratos teóricos (N). Um prato corresponde a uma etapa de equilíbrio da substância entre a fase estacionária e a fase móvel; portanto, quanto maior o número de pratos, maior será a eficiência (picos mais estreitos). Durante o percurso na coluna, a zona inicialmente ocupada pela substância vai-se alargando gradualmente. Este fato é traduzido no registrador (diferencial) pela obtenção de uma curva do tipo gaussiano, que traduz a distribuição da população molecular que emerge da coluna durante um intervalo de tempo definido pela base da curva. A relação entre a largura do pico e o tempo de retenção, ambos medidos em unidades de tempo, definem a altura equivalente a um prato teórico. N = número de pratos teóricos H = altura equivalente a um prato teórico H=L/N Uma maior eficiência é atribuída a colunas com menor diâmetro interno, a partículas da fase estacionária com tamanho pequeno e uniforme e, no caso de fase estacionária líquida, a uma menor espessura e viscosidade do filme. Maiores massas moleculares do gás de arraste também aumentam a eficiência da coluna. Variáveis cinéticas que afetam a largura da banda (alteram a eficiência) O alargamento da banda é uma conseqüência da velocidade finita na qual muitos processos de transferência de massa ocorrem durante a migração da espécie através da coluna. Algumas dessas velocidades são controladas pelo ajuste dos parâmetros experimentais, permitindo uma melhor separação. O efeito dessas variáveis sobre a eficiência da coluna, medida pela altura do prato H, estão relacionadas na equação de van Deemter: Resolução da coluna (separação) Resolução (Rs) é a medida quantitativa para avaliar a capacidade de separação da coluna em relação a dois analitos, considerando a distância relativa entre bandas cromatográfica vizinhas e suas respectivas larguras. Rs é calculada como o dobro da razão da diferença dos tr de duas substâncias adjacentes no cromatograma pela soma da largura de seus picos: Para análises quantitativas, valores de resolução considerados bons são aqueles superiores a 1,5. Para análises qualitativas resoluções superiores a 1,0 já são consideradas boas. A natureza da coluna, a velocidade do gás de arraste e as temperaturas empregadas no sistema de CG são fatores que afetam a resolução Técnicas de otimização - diminuir o tamanho da partícula de empacotamento; o diâmetro da coluna; a temperatura da coluna; a espessura do filme líquido; otimizar a velocidade de fluxo da fase móvel.; aumentar o comprimento da coluna (aumenta N). - Aumenta a temperatura -> mais rápido -> piora a separação - Diminuiu a temperatura -> melhor separação Quando k’, N e assimetria do pico mudam é porque ocorreu degradação da coluna. Aspectos teóricos Índice do Kovats Parâmetro útil porque é impossível reproduzir tempos de retenção em dois laboratórios diferentes. Gás de arraste A escolha do gás de arrastre depende do tipo de detector que é utilizado e dos componentes a determinar. Os gases de arrastre para cromatógrafos devem ser de alta pureza e quimicamente inertes, por exemplo, hélio (He), argônio (Ar), nitrogênio (N2) e hidrogênio (H2). O sistema de gás arrastre pode conter um filtro molecular para a remoção de água e outras impurezas Injeção direta com seringa - As amostras gasosas e líquidas podem ser injetadas com uma seringa. Na forma mais simples a amostra é injetada primeiro em uma câmara aquecida, onde se evapora antes de ser transferida para a coluna. Quando são utilizadas colunas empacotadas, a primeira parte da coluna, em geral, serve como câmara de injeção, aquecida separadamente a uma temperatura adequada. A amostra líquida é injetada diretamente na coluna com uma seringa. Deixa-se então que o solvente se evapore para produzir a concentração dos componentes da amostra. Se a amostra for gasosa, a concentração é efetuada por meio do método criogênico. Injeção com válvula de amostragem/ loop - A injeção com válvulas de amostragem e Loop muitas vezes é utilizada no controle de processos, onde as amostras gasosas ou líquidas fluem continuamente através de uma espiral. A espiral de amostra enche em posição off-line com uma seringa ou uma bomba automática. Portanto, o loop é conectado em série com a coluna e a amostra é transferida à fase móvel. Às vezes é necessário concentrar a amostra. A eficiência da coluna requer que a amostra tenha um tamanho adequado e seja introduzida na forma de vapor. Injeções lentas e/ou injeção de grandes volumes de amostra resultam em picos alargados com pobre resolução. O método mais comum de injeção envolve o uso de uma microsseringa para a injeção do líquido ou amostras gasosas através de um septo de silicone para dentro do injetor. Neste caso, o sistema de injeção da amostra possui um divisor de fluxo, o qual pode ser utilizado aberto ( split ) ou fechado ( splitless ). Quando o divisor está fechado, todo o volume injetado é carregado para dentro da coluna pela fase móvel. Esse é um método de concentração da amostra, e portanto deve ser adotado para amostras diluídas. Para amostras concentradas, o divisor de fluxo é utilizado aberto. Variáveis para uma injeção sem divisor de fluxo (splitless) Relação entre solvente x Temperatura ideal da coluna para o efeito do solvente Trabalhar com solvente de ponto de ebulição próximo ao ponto de ebulição da amostra. Utilizar a temperatura do injetor com aproximadamente 20oC abaixo do ponto de ebulição do solvente, para evitar discriminação. Desta maneira, o solvente não evapora primeiro deixando a amostra para trás, evitando perdas de amostras mais pesadas na abertura do divisor de fluxo. Discriminação em injetores com divisor de fluxo Principais causas: - Vaporização seletiva de componentes da amostra na agulha da seringa; Variações na razão de divisão ocasionadas por variações na viscosidade do gás e pela condensação do solvente na entrada da coluna; Vaporização incompleta e vaporização lenta da coluna; Velocidade de difusão diferentes para moléculas de tamanhos variados; Ponto terminal da agulha muito próximo da entrada da coluna no momento da injeção. Discriminação em injeções sem divisor de fluxo Principais causas: - Vaporização seletiva de componentes da amostra na agulha da seringa; Período com o divisor fechado e a transferência de amostra para a coluna; Adsorção no encamisamento (liner) do injetor; Tempo de residência longo da amostra na câmara de vaporização pode provocar degradações de moléculas termossensíveis. Discriminação em injeções na coluna Principais causas: A frio - Perda de material na parte externa da agulha e para a câmara do injetor, ocasionada por fluxo reverso (em função do volume de amostra, diâmetro interno do capilar, diâmetro externo da agulha, gradiente de temperatura e comprimento da agulha). A quente: - Idem (com mais probabilidade de ocorrer devido a vaporização mais eficiente da amostra); Vaporização seletiva de componentes da amostra na agulha da seringa. Colunas Cromatografia gasosa: colunas empacotada e coluna tubular aberta (coluna capilar). A temperatura ótima da coluna depende do ponto de ebulição da amostra e do grau de separação requerido. Grosseiramente, uma temperatura igual ou ligeiramente acima do ponto de ebulição médio de uma amostra resulta em um razoável tempo de eluição. Em geral, resoluções ótimas estão associadas com temperaturas mínimas, o custo deste abaixamento de temperatura, contudo, é o aumento no tempo de eluição e portanto no tempo requerido para a análise completa. Colunas empacotadas São fabricadas com vidro, metal (aço inoxidável, cobre, alumínio) ou tubos de teflon. Esses tubos são densamente empacotados com um material uniforme e finamente dividido, ou com um suporte sólido (inerte, terras diatomáceas) recoberto por uma fina camada de fase estacionária líquida. Coluna tubular aberta ou coluna capilar São fabricadas em aço inoxidável, vidro, teflon ou sílica fundida revestida com um plástico de poliimida. - Coluna capilar de parede recoberta – as paredes dos tubos capilares são recobertas com uma fina camada da fase estacionária; - Coluna capilar de suporte recoberto – o interior da superfície do capilar é recoberto com um filme delgado de fase estacionária líquida sobre um suporte, tal como terra diatomácea. Detectores A função de um detector é produzir uma resposta que seja proporcional à quantidade ou concentração do composto que o atravessa sob a forma de um sinal que pode ser medido. Como não é possível dispor de um detector universal que responda a todos os tipos de analitos, é necessário escolher entre os detectores existentes aquele que melhor se adapta ao fim desejado. Características do detector ideal - Sensibilidade adequada; Boa estabilidade e reprodutibilidade (precisão); Intervalo de temperatura desde a temperatura ambiente até no mínimo 4000C; Tempo de resposta rápido, independente da velocidade de fluxo; Alta viabilidade e facilidade no uso; Não destruir a amostra. Não existe um detector ideal.Em geral, um detector não identifica o que é eluído pela coluna, ele mostra que somente que alguma coisa está saindo. Análise qualitativa Um cromatograma fornece somente uma informação qualitativa simples sobre cada espécie na amostra - o tempo de retenção ou a posição na fase estacionária depois de um certo tempo de eluição. Contudo, para a identificação espectroscópica ser possível, é necessário uma separação cromatográfica preliminar. A CG é amplamente utilizada para o controle da pureza de compostos orgânicos. Os contaminantes, quando presentes, aparecem como picos adicionais; a área sob esses picos dá uma estimativa da extensão da contaminação. A técnica também é utilizada para avaliar a eficiência de processos de purificação. A CG permite confirmar a presença ou ausência de um suposto componente em uma mistura que contém um número de espécies conhecidas. Neste caso, a adição da substância na mistura ou aumenta a área do pico correspondente a substância presente, ou surge um novo pico quando a substância está ausente. Esta evidência é confirmada se diferentes colunas em diferentes temperaturas exibem o mesmo efeito. Análise quantitativa A técnica cromatográfia vem sendo amplamente utilizada porque é rápida, relativamente simples e de baixo custo, e encontra muitas aplicações como instrumento de separação. O sinal obtido no detector tem sido usado para a análise quantitativa, onde a altura ou a área do pico analito écomparado com um ou mais padrões. Sob condições controladas cuidadosamente, é possível obter 1% de exatidão. Análise baseada na altura do pico A altura do pico é medida desde a base até o máximo do pico. É importante lembrar que a altura do pico é inversamente proporcional a largura do pico. As variáveis que podem ser rigorosamente controladas são a temperatura da coluna, velocidade de fluxo do eluente e velocidade de injeção da amostra. Método da normalização da área Consiste em outro método para evitar as incertezas associadas com a injeção da amostra. É necessário a eluição completa de todos os componentes da amostra. Nesse método, as áreas de todos os picos eluídos são computados. Para a correção dessas áreas para diferenças na resposta do detector para diferentes tipos de compostos, a concentração do analito é encontrada pela razão área/área total de todos os picos. A área de cada pico é medida e corrigida para a resposta do detector para diferentes eluatos. A correção envolve a divisão da área do pico por um fator de correção empiricamente determinado (fator resposta do detector). A concentração do analito é encontrada a partir da razão entre a sua área corrigida e a área total corrigida de todos os picos. Qual a relação entre a altura do prato teórico e a eficiência da coluna? Assim, número de pratos (N) e altura do prato teórico (H)) são termos usados como medidas quantitativas da eficiência da coluna cromatográfica. Mais pratos = uma melhor separação. Qual a relação entre o tamanho das partículas da fase estacionária com a altura do prato teórico? O tamanho da partícula tem relação direta com a eficiência da coluna na CLAE. Quanto menores as partículas do recheio da coluna, maior a pressão da coluna no sistema. Da mesma forma, quanto menores as partículas do recheio da coluna, mais finos serão os picos e melhor será a separação. Resumidamente, qual a regra básica para selecionar a fase móvel e a fase estacionária? Fase estacionária: fase fixa onde a substância que está sendo separada ou identificada fixa-se na superfície de outro material. Por exemplo, um papel de filtro. Fase móvel: nesta fase as substâncias que queremos isolar são “arrastadas” por um solvente fluido, que pode ser líquido ou gasoso. Por exemplo, vapor do álcool Etílico. Que características devem apresentar as amostras separadas por cromatografia gasosa? As amostras separadas por CG devem ser voláteis, estáveis termicamente na temperatura de trabalho e apresentar baixo peso molecular. A cromatografia gasosa apresenta dificuldade em analisar substâncias não voláteis, que se decompõem em altas temperaturas ou possuem elevado peso molecular. Que características devem apresentar as amostras separadas por HPLC? A amostra deve ser solúvel na fase móvel, sendo ela líquida (iônica ou covalente) ou sólida (iônica ou covalente). Quais as limitações que a cromatografia gasosa e HPLC apresentam? Enquanto a CG é mais rápida e 10x mais eficiente que o HPLC, ela é pobre em capacidade preparativa e possui menor sensibilidade (10^-12 g DIC/DCE). O HPLC possui boa capacidade preparativa e sensibilidade igual a 10^-9 g (UV) e 10^-15 g (coulométrico). Quais são os principais componentes de um equipamento de HPLC? Reservatório da Fase Móvel, bomba, injetor, pré-coluna, coluna, detector e computador. Qual o grau de pureza da fase móvel usada na técnica de HPLC? O grau de pureza deve ser maior que 99,9%. Por que é necessário filtrar e desgaseificar o eluente? As fases móveis, principalmente as polares, tem tendência a dissolver oxigênio e outros gases. Quando estes gases são liberados, dentro do equipamento, formam bolhas que podem afetar o funcionamento do detector e a eficiência da coluna. Desta forma é necessário remover os gases dissolvidos na fase móvel. Muitos equipamentos de HPLC já trazem a solução deste problema desgaseificando a fase móvel em um compartimento específico, antes que ela entre na bomba. Qual a diferença entre as separações cromatográficas com bombeamento isocrático e de gradiente? No bombeamento isocrático a composição da fase móvel permanece constante, e é capaz de separar um número limitado de picos. Enquanto que no bombeamento gradiente a composição da fase móvel varia durante a análise. Aplica-se esse sistema quando a polaridade dos compostos é muito diferente e quando se separa amostras complexas. Por que o detector de UV é o mais usado em HPLC? Esses detectores apresentam como principal atrativo o fato de se poder escolher diferentes comprimentos de onda. Permitem a análise de amostras complexas que absorvem em diferentes comprimentos de onda; assim como permitem a obtenção do espectro completo de um pico cromatográfico eluído da coluna Qual a diferença entre cromatografia em fase normal e fase reversa? Na fase normal a fase estacionária é mais polar que a fase móvel, enquanto que na fase reversa a fase estacionária é menos polar que a fase móvel. A técnica de HPLC só trabalha com cromatografia em fase normal? Não. O HPLC em fase normal utiliza as fases estacionárias quimicamente ligadas que consistem em uma fase imóvel apolar e uma fase móvel de polaridade moderada. O que são as fases estacionárias quimicamente ligadas? As fases estacionárias quimicamente ligadas são as fases mais importantes da cromatografia líquida. Obtidas pela reação dos grupos silanóis da sílica com compostos contendo grupos polares (Fase Normal) ou apolares (Fase Reversa). Como regra em CLAE, a maioria das separações é realizada igualando-se a polaridade do analito com aquela da fase estacionária e uma fase móvel de polaridade consideravelmente diferente é empregada. Esse procedimento é mais bem sucedido que outro no qual as polaridades do analito e fase móvel são igualadas, sendo diferentes daquela fase estacionária. Explique como este segundo procedimento altera o tempo de retenção e a resolução, não permitindo sua aplicação prática. Quando o analito e a fase móvel se unem através da polaridade, a separação na coluna é mais difícil além de mais demorada. A fase estacionária não consegue prender o analito sem prender a fase móvel também. Para qual o tipo de soluto deve ser selecionado a separação por: 1) cromatografia de exclusão molecular 2) cromatografia de partição 1) O fracionamento é baseado no tamanho das moléculas 2) Para espécies polares, mas não iônicas. A transferência de massa é mais rápida para menores espessuras de fase líquida. O primeiro a sair da coluna é o soluto apolar, nesse caso. O que é cromatografia? A cromatografia é uma técnica para analisar, identificar ou separar os componentes de uma mistura. É definida como a separação de dois ou mais compostos diferentes por distribuição entre fases, uma das quais é estacionária (fixa) e a outra, móvel. Essa técnica baseia-se no princípio da adsorção seletiva. Em todas as separações cromatográficas, a amostra é transportada por uma fase móvel, que pode ser um gás, um líquido ou um fluido supercrítico. Essa fase móvel é, então, forçada a passar através de uma fase estacionária imiscível fixa, colocada em uma coluna ou sobre uma superfície sólida. As duas fases são escolhidas de modo que os componentes da amostra distribuam-se entre as fases móvel e estacionária em graus variados. Os componentes que são retidos mais fortemente na fase estacionária movem-se mais lentamente no fluxo da fase móvel. Ao contrário, os componentes que interagem mais fracamente com a fase estacionária movem-se mais rapidamente. Como consequência dessas velocidades de migração diferentes, os componentes da amostra são separados em bandas ou zonas discretas, que podem ser analisadas quantitativa ou qualitativamente Descreva fase móvel e estacionária: .Fase móvel é a fase responsável por arrastar os componentes das amostras de acordo com seu grau de afinidade. Já a fase estacionária comporta-se como um suporte para a fase móvel que deve ser de polaridade diferente desta. Para que é utilizada a cromatografia ? A cromatografia é um método de separação que encontra aplicação em todos os ramos da ciência. Esta técnica pode ser utilizada para a identificação ou purificação de compostos e para a separação decomponentes de uma mistura. Qual o princípio da cromatografia gasosa? Como a mesma é classificada segundo a fase estacionária? Na cromatografia gasosa, os componentes de uma amostra vaporizada são separados em consequência de sua partição entre uma fase móvel gasosa e uma fase estacionária líquida ou sólida contida dentro da coluna. Ao realizar uma separação por cromatografia gasosa, a amostra é vaporizada e injetada na cabeça da coluna cromatográfica. A eluição é feita por um fluxo de fase móvel gasosa inerte.Dois tipos de cromatografia gasosa são encontrados: a cromatografia gás-líquido e cromatografia gás-sólido. No primeiro caso, a fase móvel é um gás enquanto a fase estacionária é um líquido retido, na superfície de um sólido inerte, por adsorção ou ligação química. No segundo caso, a fase móvel também é um gás e a fase estacionária é um sólido que retém os analitos por adsorção física. Cite as vantagens e desvantagens dos seguintes detectores: (a)Detector por condutividade térmica Vantagem: grande aplicabilidade geral, ampla faixa linear de resposta, simplicidade e não destrói a amostra. Desvantagem: baixa sensibilidade . (b)Detector por ionização em chama Vantagem: alta sensibilidade ampla faixa linear de resposta, baixo ruído, fácil utilização, resistência, resposta altamente dependente da vazão. Desvantagem: destrói a amostra . (c)Detector por captura de elétrons Vantagem: alta sensibilidade, seletividade para compostos que contém halogênio e muitos outros. Desvantagem: faixa linear estreita . (d)Detector termiônico Vantagem: alta sensibilidade para compostos que contenham fósforo e nitrogênio, boa faixa linear. Desvantagem: destrói o analito, não é aplicável a muitos analitos . (e)Detector por fotoionização Vantagem: faixa linear alta e detector mais sensível para hidrocarbonetos aromáticos e compostos organossulfurados ou organofosforados. Desvantagem: compostos com potenciais de ionização mais elevados não são detectados. Descreva as características dos seguintes métodos de separação em cromatografia líquida. (a)Adsorção ou líquido-sólida : processo baseado em interações eletrostáticas, dipolares (Van DerWaals) ou ligações de hidrogênio que ocorrem entre grupos ativos presentes na superfície da fase estacionária sólida e a fase móvel . (b)Partição : a fase estacionária é um segundo líquido que é imiscível com o líquido da fase móvel. Quando a fase estacionária é um líquido, espalhado na superfície de um suporte sólido e inerte ou nas paredes de um tubo, o processo é interfacial, ocorrendo por absorção ou partição, que se baseia nas diferentes solubilidades dos componentes da amostra na fase estacionária . (c)Troca iônica : a fase estacionária é constituída de uma matriz onde são adicionados grupos funcionais ionizáveis. A fase móvel é geralmente uma solução iônica com propriedades tamponantes escolhidas de forma a ser compatível com o tipo de trocador usado. (d)Exclusão de tamanho : baseia-se em um processo puramente mecânico. A fase estacionária é uma matriz de composição inerte, com textura, superfície e distribuição de tamanho dos poros controlados. Os componentes presentes na fase móvel podem ser separados pela diferença de tamanho das partículas no qual partículas menores conseguem penetrar nos poros da fase estacionária enquanto as partículas maiores não. Quais as misturas que podem ser separadas por cromatografia gasosa? Podem ser separadas por cromatografia gasosa as misturas cujos constituintes sejam termicamente estáveis e voláteis e que dissolva, pelo menos parcialmente, no gás da fase móvel. Qual é o princípio da cromatografia em papel? A cromatografia em papel é uma técnica de partição líquido-líquido, estando um deles fixado a um suporte sólido. Baseia-se na diferença de solubilidade das substâncias em questão entre as duas fases imiscíveis, sendo geralmente a água um dos líquidos. O solvente é saturado em água e a partição se dá devido à presença de água em celulose (papel filtro). Na cromatografia em papel, uma amostra líquida flui por uma tira de papel adsorvente vertical. A organização molecular que compõe as cadeias de celulose do papel é polar. Como pode ser manipulado o fator de separação na: (a)Cromatografia gasosa : O fator de separação pode ser manipulado na cromatografia gasosa através de variações: na temperatura, nos tamanhos das partículas, nas composições das fases móveis e estacionárias . (b)Cromatografia líquida: O fator de separação pode ser manipulado na cromatografia líquida através de variações: na pressão, nos tamanhos das partículas, nas composições das fases móveis e estacionárias. Como é realizada a confirmação da identidade (análise qualitativa) de compostos quando a análise emprega CLAE ? Cromatografia Líquida de Alta Eficiência a confirmação da identidade de um composto é feita através da comparação entre os tempos de retenção das substâncias e dos padrões, ou seja, compostos iguais apresentam o mesmo tempo de retenção. Quais espécies podem ser separadas por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência, mas não podem ser separadas por Cromatografia Gasosa? Substâncias não-voláteis ou termicamente frágeis podem ser separadas por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência e não por Cromatografia Gasosa. Discuta por que a combinação da cromatografia gasosa com a espectrometria de massas é tão vantajosa: A combinação da cromatografia gasosa com a espectrometria de massas, por ser uma técnica hifenizada, pode ser usada para a identificação de misturas complexas, com tempos de retenção próximos.
