Document

Transcript

2a. Podstawy wirusologii Cechy wirusów: specyfika budowy cząstki wirusa, budowa morfologiczna (kształt, wymiary), właściwości struktur wirusa, udział struktur w patomechanizmie zakażenia. Definicja, budowa wirionu- genom DNA i RNA, struktura i morfologia kapsydu- rodzaje symetrii, budowa i funkcja osłonki. Enzymy cząstek wirusowych (odwrotna transkryptaza, neuraminidaza). Systematyka wirusów- wirusy DNA- Herpesviridae (Herpes simplex, Varicella zoster-VZV, CMV, EBV, HHV6, HHV7), Adenoviridae, Papovaviridae, (HPV, JC wirus), Parvoviridae (B19), Hepadnaviridae- WZW typu B (HBV),Poxviridae (Variola- ospy prawdziwej, Vaccinia- krowianki); wirusy RNA- Orthomyxoviridae, Paramyxoviridae, Rabdoviridae, Filoviridae, Bunyaviridae, Picornaviridae, Retroviridae, Togaviridae, Coronaviridae, Calciviridae, Flaviviridae, wirusy gorączki krwotocznej, zapalenia opon mózgowordzeniowych, zapalenia mózgu. Bakterio i mykofagi, liza i lizogenia. Replikacja wirusowa- fazy replikacji (adsorpcji, penetracji, powielania komponentów wirusa, dojrzewania, uwolnienia wirionów); Przebieg zakażenia wirusowego- wrota zakażenia, zakażenie miejscowe, uogólnione, Relacje wirus- komórka gospodarza- typy zakażeń- lityczne, nielityczne, latentne, apoptoza, transformacja nowotworowa. Zapobieganie zakażeniom wirusowym- profilaktyka preekspozycyjna, immunologiczna, chemioprofilaktyka. Uodparnianie czynne, rodzaje szczepionek- inaktywowane, żywe atenuowane, rekombinowane, zawierające DNA. Uodpornianie bierne- surowice odpornościowe. Diagnostyka wirusologiczna- metody: izolacji- hodowle tkankowe, komórkowe, zarodki ptasie; metody wykrywania namnożonych wirusów: efekt cytopatyczny, metoda łysinkowa, odczyn hemaglutynacji, hemadsorpcji, bezpośredniego wykrycia wirusa- mikroskopia elektronowa, EIA, IF, hybrydyzacja in-situ, PCR; serologiczne- wykrycie przeciwciał IgM, IgG- EIA, IF. Hodowle komórkowe, zmiany w morfologii komórek linii, tworzenie CPE. Pobieranie i transport próbek klinicznych- w najwcześniejszej fazie zakażenia, czas dostarczenia próby, podłoża transportowe. Opracowanie materiału klinicznego- usuwanie bakterii z materiału (filtracja, dodatek antybiotyków), dobór systemu hodowli, metody idetyfikacji wirusa: amplifikacja-PCR z udziałem odwrotnej transkryptazy; interpretacja wyników. Diagnostyka wirusologiczna 1. Metody izolacji i namnażania wirusów. Wirusy nie replikują poza komórką żywą, zatem hodowla wirusów odbywa się in vivo w komórkach organizmów żywych lub in vitro poprzez namnażanie cząstek wirusa w hodowlach komórkowych albo tkankowych. Metoda namnażania wirusa w zarodkach kurzych. Rozwijające się zarodki ptasie zakażane są w różnych fazach rozwojowych. Dokonuje się zakażenia błony kosmówkowo-omoczniowej, jamy owodni, omoczni lub woreczka żółtkowego. Po określonym czasie inkubacji w odpowiednich warunkach z zakażonego jaja pobiera się płyn lub tkankę i bada na obecność wirusów. Metoda namnażania w hodowlach tkankowych, komórkowych- hodowle mogą pochodzić z tkanek ludzkich lub zwierzęcych świeżo pobranych (hodowle pierwotne), lub z tzw. heteroploidalnych, ustabilizowanych linii komórkowych- pasażowane in vitro wielokrotnie. Komórki zmienione są nowotworowo i namnażają się nieograniczenie. Półciągłe linie komórkowe, diploidalne- zawierają komórki wywodzące się z tkanki płodowej ludzkiej lub zwierzęcej (fibroblasty), o ograniczonym czasie życia do ok. 30–50 pasaży. Komórka pozwalająca na namnożenie wirusa to komórka permisywna, zatem hodowla komórkowa musi być permisywna dla danego wirusa. 2. Metody wykrywania wirusów Efekt cytopatyczny CPE – zmiany morfologiczne i degeneracyjne w komórkach, w których zachodzi replikacja wirusa. Cykl ten jest skutkiem zahamowania replikacji RNA i syntezy białek gospodarza, jak również toksycznego wpływu białek wirusa. Obserwowany może być jako: - zmiana kształtu, wielkości i typowego układu komórek, zmiany wewnątrzkomórkowe (zmiany barwliwości i typowej morfologii struktur komórkowych, wewnątrzjądrowe i wewnątrzplazmatyczne wtręty, wakuolizacja jądra i cytoplazmy), powstanie zespólni komórkowych. Metoda łysinkowa. Łysinka jest to obszar przejaśnienia w hodowli komórkowej (eukariotycznej) lub bakteryjnej, powstający w wyniku lizy komórek jako skutek działania pojedynczego, wyjściowego wirionu („negatywna kolonia wirusa”). Policzenie łysinek umożliwia wyliczenie stężenia wirusów w roztworze (PFU – plaque forming unit, jednostka tworząca łysinkę). Hemaglutynacja wirusowa - zachodzi wskutek działania niektórych wirusów na receptory powierzchni krwinki czerwonej. Enzymatyczna aktywność hemaglutyniny i neuraminidazy wirusowej wywołuje zjawisko polegające na łączeniu się krwinek czerwonych za pomocą mostków w większe skupienia. Jest to reakcja odwracalna. Hemadsorpcja- wykorzystuje zjawisko przylegania erytrocytów (różnych gatunków zwierząt lub ludzkich) do powierzchni komórek zakażonych wirusem produkującym hemaglutyninę. Efekt ten wyprzedza w hodowli komórkowej efekt cytopatyczny. Podczas namnażania wirusa z osłonką i po wbudowaniu jego hemaglutynin w błonę komórkową komórki gospodarza metoda hemadsorpcji pozwala na pośrednie wykrycie wirusa. Po dodaniu do hodowli zawiesiny krwinek czerwonych nastąpi w przypadku obecności wirusa hemaglutynującego adsorpcja erytrocytów do powierzchni komórek widoczna w postaci „kiści winogron”. Swoiste przeciwciała hamujące ten proces pozwalają na identyfikację gatunkową danego wirusa. Hybrydyzacja in situ- metoda wykrywania wirusa w materiale biologicznym. Metoda cytogenetyczna polegajaca na wykryciu w danym materiale specyficznej sekwencji DNA za pomocą sond znakowanych barwnikiem fluorescencyjnym. Odpowiednio przygotowane komórki lub tkanki do badania umieszcza się szkiełku podstawowym. Fluorescencyjna sonda jest nanoszona na preparat i całość poddawana jest denaturacji (wysoka temperatura), a następnie kilkugodzinnej hybrydyzacji. Po przepłukaniu preparatu w celu usunięcia niezhybrydyzowanych cząstek sondy preparat wybarwia się i analizuje pod mikroskopem fluorescencyjnym. Interferencja wirusowa - stosowana do wykrycia wirusa, który nie wywołuje zmian morfologicznych zakażonych komórek, ale pozwala na zakażenie linii komórkowej innym wirusem powodującym efekt cytopatyczny. Np. interferencja wirusa różyczki wirusem ECHO. Komórki zakażone wirusem różyczki nie wykazują zmian cytopatycznych, a taka linia komórkowa, zakażona również wirusem ECHO zmian takich nadal nie wykazuje, pomimo faktu, iż wirus ECHO zawsze powoduje efekt cytopatyczny. 3. Izolacja i identyfikacja wirusa Techniki i metody serologiczne a) zahamowanie hemaglutynacji- pożywkę z hodowli zakażonej miesza się ze swoistymi przeciwciałami i z tą mieszaniną wykonuje odczyn hemaglutynacji wirusowej; b) zahamowanie hemadsorpcji- pożywkę z hodowli zakażonej miesza się ze swoistymi przeciwciałami i tą mieszaniną zakaża się nową hodowlę. Brak zjawiska hemadsorpcji takiej hodowli świadczy o neutralizacji przez dodane przeciwciała i pozwoli na identyfikację wirusa. c) neutralizacja- dodanie znanych przeciwciał do nieznanego wirusa. Taką mieszaniną zakaża się nową linię komórkową, gdy nie wystąpią zmiany cytopatyczne świadczy to o neutralizacji przeciwciałami nieznanego wirusa i umożliwia identyfikację. d) zahamowanie interferencji wirusowej- dodanie przeciwciał do pożywki hodowli zawierającej wirus interferujący i zakażenie taką mieszaniną nowej hodowli. Po 2 dniach do hodowli dodany zostaje wirus cytopatyczny. Efekt cytopatyczny to wynik świadczący o związaniu pierwszego wirusa przez dodane przeciwciała. e) odczyn immunofluorescencji bezpośredniej - do rozmazu komórek z zakażonej hodowli komórkowej dodaje się przeciwciała wzorcowe znakowane fluorochromem. Zakażenie komórki wirusem stwierdza się na podstawie obserwacji fluorescencji komórek w mikroskopie fluorescencyjnym. f) odczyn immnoenzymatyczny ELISA- (ang. Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) jest testem immunologicznym; reakcją barwną enzymu sprzężonego z przeciwciałami do jakościowego i ilościowego wykrycia przeciwciał, jak i antygenów. Służy on do wykrycia określonych białek w badanym materiale z użyciem przeciwciał skoniugowanych z odpowiednim enzymem. Po utworzeniu kompleksu immunologicznego-, czyli unieruchomieniu przeciwciała i dodaniu substratu dla enzymu związanego z przeciwciałem wytworzy się produkt, którego obecność świadczy o obecności określonego białka- np. wirusowego. Antygen wirusowy nakłada się na podłoże, dodaje się badana surowicę i swoiste przeciwciało- jeśli jest w niej obecne to wiąże się z antygenem, następnie dodaje sie antyglobulinę znakowana enzymem wiążącym się ze związanym przeciwciałem badanej surowicy. W ostatnim etapie dodaje się substrat enzymu i mierzy kolorymetrycznie zmianę barwy. Wykorzystanie odwrotnej transkrypcji w metodzie PCR Enzym odwrotna transkryptaza - występuje u wirusów RNA np. retrowirusów. Umożliwia ona przepisanie ich materiału genetycznego z RNA na DNA, który następnie integruje do genomu gospodarza i wraz z nim ulega replikacji. Również niektóre wirusy DNA (hepadnawirusy) wykorzystują odwrotną transkrypcję podczas replikacji. Metoda ta umożliwia: utworzenie DNA na matrycy RNA, ampifikację DNA za pomocą metody PCR. Hybrydyzacja DNA- wykrycie genomu wirusa za pomocą hybrydyzowania wirusowego DNA z nicią komplementarną, znakowaną enzymami lub substancjami radioaktywnymi. Metoda rozdziału elektroforetycznego pozwala na porównanie nici DNA komplementarnej z powstałym kompleksem DNA wirusa- DNA-komplementarne. Immunoblotting- technika Western blot polega na rozdzieleniu antygenu na żelu poliakrylamidowym za pomocą elektroforezy w obecności dodecylu sodu (SDS), co pozwala na rozdzielenie cząsteczek na podstawie ich wielkości. Cząsteczki te są następnie przenoszone na błonę nitrocelulozową celu stworzenia identycznego wzoru jak na żelu (blotting). Kolejnym krokiem jest dodanie surowicy pacjenta przeciwciał znakowanych enzymem, a przeciwciała niezwiązane są odpłukiwane i dodawana zostaje surowicę skierowaną przeciwko ludzkim Ig znakowaną enzymem. Znakowane przeciwciała łączą się ze wszystkimi przeciwciałami wychwyconymi przez antygen. Dodany na końcu substrat pozwala na wizualizację. Kompleksy antygen- przeciwciało przejawiają się jako plamy(spots). Test ten pozwala na stworzenie profilu przeciwciał obecnych w badanej surowicy przeciwko określonym białkom jak również pozwala na potwierdzenia obecności przeciwciał np przeciwko wirusowi HIV. Najczęściej stosowane metody wykrywania przeciwciał p/wirusowychRozpoznanie zakażenia wirusowego ustala się serologicznie przez wykazanie wzrostu miana przeciwciał skierowanych przeciw wirusowi lub przez wykazanie obecności przeciwciał klasy IgM. Metody ilościowej oceny przeciwciał polegają na reakcjach pomiędzy antygenem a przeciwciałem. Stosuje się przede wszystkim odczyny:      neutralizacji- dodanie surowicy badanej do zawiesiny wirusa i zakażenie tą mieszanką wrażliwej hodowli komórkowej. Brak efektu cytopatycznego (względem kontroli dodatniej z surowica bez przeciwciał) świadczy o obecności przeciwciał zobojętniających. Odczyn taki wykonuje się również z użyciem zwierząt doświadczalnych- np. diagnostyka w kierunku Coxackie wirus typu A, lub z użyciem zarodków kurzych- wirus świnki. wiązania dopełniacza- antygeny wirusowe uzyskuje się w hodowlach komórkowych, zarodków kurzych czy tkanek zakażonych zwierząt. Przeciwciała przeciw antygenom wirusowym mogą występować w różnych okresach zakażenia. Interpretacja wyników odczynu dopełniacza zależy od użytego antygenu i wzrostu miana przeciwciał. hamowania hemaglutynacji immunofluorescencji- służy do wykrywania obecności przeciwciała swoistego w seryjnych rozcieńczeniach surowicy przy użyciu znanego antygenu wirusowego. immunoenzymatyczne Do rzadziej stosowanych technik należą:     odczyn biernej hemaglutynacji techniki immunodyfuzyjne- antygen i przeciwciało dyfundują ku sobie w półstałym ośrodku np. agarze tworząc linię precypitacyjną immunoelektroforeza przeciwbieżna- stosowana gdy antygen wirusowy ma ładunek ujemny, porusza sie w kierunku anody, globulina z kolei porusza się w przeciwnym kierunku; w miejscu spotkania antygenu z przeciwciałem tworzy się w żelu agarozowym linia precypitacyjna (np. wykrywanie przeciwciał przeciwko WZW typu B) techniki radioimmunologiczne- do oceny aktywności immunologicznej, są szeroko stosowane do wykrywania przeciwciał (znakowanych radioizotopem) w ilościach pikogramowych Interpretacja wyników na przykładzie enterowirusa Izolacja Przeciwciało Przeciwciało wirusa wiążące zobojętniające IgM Zakażenie + + - dopełniacz + + - + + + + + - brak wczesny okres w toku świeże stare