Transcript
DZIEŃ 1 Neurobiologia – Genetyka Medyczna Grupa ćw. Nazwiska:
1.A. IZOLACJA DNA Materiał: komórki ludzkie (fibroblasty mrożone -80˚C) Metoda: komercyjny zestaw kolumienkowy opiera się na zdolności wiązania DNA do złóż krzemionkowych w wysokich stężeniach soli chalotropowych. Komórki lizowane są w buforze zawierającym detergenty niejonowe oraz proteazę (Proteinaza K). W tych warunkach dochodzi do lizy komórek i degradacji wszelkich białek. Następnie mieszanina nanoszona jest na mini kolumnę ze złożem krzemionkowym. Dna przechodząc przez złoże osiada na nim, podczas gdy zanieczyszczenia przechodza niezwiązane. Po wypłukaniu z kolumny resztek zanieczyszczeń, oczyszczony DNA wymywany jest z niej niskojonowymi buforami lub ddH2O. Izolacji dokonujemy zgodnie z procedurą dostarczoną z zestawem. Uwagi:
2. POMIAR STĘŻENIA DNA, OCENA JAKOŚCI Pomiar spektrofotometryczny za pomocą urządzenia NanoDrop. Pomiaru dokonuje się w objętości 1,5 μl po uprzedniej kalibracji urządzenia z użyciem tego samego buforu, w którym rozpuszczony jest DNA. Długość fali (nm)
substancje absorbujące:
260
DNA, RNA
280
białka
Stosunek absorpcji A260/A280 (ratio) świadczy o zanieczyszczeniu kwasów nukleinowych białkami. Wartości optymalne A260/A280 przy których izobat DNA uznaje się za czysty to: 1,8-2,0 (ratio). DNA………………….. (ng/μl) Ratio A260/A280……………………
1
DZIEŃ 1 Neurobiologia – Genetyka Medyczna Grupa ćw. Nazwiska:
Co powinieneś umieć (Sylabus): Homogenizacja materiału biologicznego (homogenat, lizat, ekstrakt, sonikacja, permeabilizacja). Metody oczyszczania białek (chromatografia powinowactwa, żelowa, kolumnowa, jonowymienna, hydrofobowa; wirowanie różnicowe, wirowanie w gradiencie gęstości; sedymentacja szybkościowa, równowagowa; frakcjonowanie; dializa; supernatant).
Metody oczyszczania kwasów nukleinowych (ekstrakcja fenol/chloroform; odsalanie białek, metody kolumienkowe; elektroforeza w żelu agarozowym). Metody analizy jakościowej i ilościowej białek (elektroforeza w żelu poliakrylamidowym, Western blotting; elektroforeza dwukierunkowa; ogniskowanie izoelektryczne; sekwencjonowanie białek, spektroskopia mas, krystalografia rentgenowska, spektroskopia NMR, spektroskopia dichroizmu kołowego, termostabilność białek).
Metody analizy jakościowej i ilościowej RNA (Technika northern-blot; RT-PCR; RT-qPCR; SAGE (serial analysis of gene expression); Mikromacierze; Hybrydyzacja in situ (tech. mikroskopowa); RNAseq: Wysokoprzepustowe sekwencjonowanie transkryptomów).
Metody analizy jakościowej i ilościowej DNA (Enzymy restrykcyjne; Hybrydyzacja (renaturacja): Southern Blotting, DNA fingerprinting, Northern blotting, In situ hybridization (FISH); Amplifikacja DNA metodą PCR (łańcuchowej reakcji polimerazy); Wizualizacja produktów PCR następuje poprzez rozdział elektroforetyczny: PCR-Multiplex; PCR-RFLP (analiza polimorfizmu długości fragmentów restrykcyjnych); Sekwencjonowanie enzymatyczne metodą Sangera; Sekwencjonowanie równoległe, Next Generation Sequencing).
2
