Ekspresja Genów Heterogenicznych W Drożdżach Pichia Pastoris

Transcript

Ekspresja genów heterogenicznych w drożdżach Pichia pastoris Ekspresja genów heterogenicznych w drożdżach Pichia pastoris  Drożdże Pichia pastoris należą do drożdży metanolotroficznych tj. zdolnych do wykorzystywania metanolu jako jedynego źródła węgla Ekspresja genów heterogenicznych w drożdżach Pichia pastoris   Pierwszą reakcją na drodze asymilacji metanolu przez drożdże Pichia pastoris jest reakcja utleniania metanolu do formaldehydu i H2O2 katalizowana przez enzymy oksydazę alkoholową 1 (AOX1) i oksydazę alkoholową 2 (AOX2) CH3 OH HCOH + H2O2 AOX1 (szybka utylizacja metanolu) AOX2 (wolna utylizacja metanolu)  Białko AOX1 może stanowić aż do 30% wszystkich białek komórkowych Pichia pastoris podczas wzrostu tych drożdży na pożywce zawierającej metanol. Pichia pastoris Ze względu na podobieństwo do S. cerevisiae istnieje możliwość zastosowania opracowanych protokołów  W przeciwieństwie do większości komercyjnych systemów ekspresji genów w drożdżach Saccharomyces cerevisiae, systemy ekspresji genów w Pichia pastoris opierają się na integracji DNA wektora plazmidowego z DNA genomowym tych drożdży, uzyskane szczepy rekombinantowe Pichia pastoris są znacznie bardziej stabilne niż szczepy rekombinantowe Saccharomyces cerevisiae  Obecność promotora genu alkoholowej oksydazy – 5% mRNA w komórce  Pichia pastoris – ekspresja genów  W konstrukcji systemów ekspresyjnych Pichia pastoris można wykorzystać „elementy konstrukcyjne” wykorzystywane w konstrukcji wektorów ekspresyjnych z Saccharomyces cerevisiae np. gen URA3 wykorzystywany jako marker selekcyjny w auksotroficznych szczepach drożdży Saccharomyces cerevisiae niezdolnych do produkcji uracylu może być użyty w tej samej roli w układach ekspresyjnych dla analogicznych szczepów drożdży Pichia pastoris Pichia pastoris – ekspresja genów Gen/marker selekcyjny wektora plazmidowego z Saccharomyces cerevisiae Szczep auksotrofowy Pichia pastoris HIS4 His- LEU2 Leu- ARG4 Arg- TRP1 Trp- URA3 Ura- Pichia pastoris Możliwość prowadzenia hodowli do wysokiego OD (10 gr/litr – 1 gr/litr)  Poziom ekspresji genów heterogenicznych jest z reguły od 10- do 100- razy wyższy niż w drożdżach Saccharomyces cerevisiae  Tanie pożywki    zabezpieczone przed kontaminacją (obecność metanolu, niskie pH) Brak konieczności dodawania witamin Pichia pastoris  Możliwość sekrecji produkowanych białek do pożywki    Niewielka ilość białek gospodarza Prosty skład pożywek Modyfikacje posttranslacyjne     Mostki disiarczkowe O- glikozylacja (b. rzadko w S. cerevisiae) N-glikozylacja Odcinanie sekwencji sygnalnej do transportu na zewnątrz (pre-pro) Pichia pastoris - wady  Tworzenie nowych szczepów P. pastoris trudniejsze niż E. coli      10 µg DNA na transformację Brak możliwości przechowywania komóek kompetentnych Wolne tempo wzrostu (po transformacji 2-3 dni) Powolna ekspresja białek (do 1 tygodnia) Niewielka ilość „domen fuzyjnych” komercyjnie dostępnych Pichia pastoris - klonowanie  Wiele dostępnych wektorów, ale tylko kilka z nich ma następujące cechy:       Ori E. coli Kaseta selekcyjna dla E. coli Kaseta selekcyjna dla P. pastoris Możliwość multikopijnej integracji Silny indukowalny promotor (AOX1) MCS w ramce odczytu z sekwencją sygnalną pPIC9k pPICZα Wektory ekspresyjne Pichia pastoris Plazmidy wahadłowe  Zawierają bakteryjne ori replikacji np. ori pBR322 (pPIC3.5) lub ori pUC (pPICZ A,B,C)  Wektory ekspresyjne Pichia pastoris Plazmidy wahadłowe  Zawierają geny oporności na ampicylinę, (markery selekcyjne w E. coli) albo gen oporności na antybiotyk zeocynę (uniwersalny marker selekcyjny w E. coli i Pichia pastoris)  Wektory ekspresyjne serii pPIC i pHIL Pichia pastoris  W wektorach plazmidowych serii pHIL i pPIC ekspresja genów heterogenicznych odbywa się spod silnego promotora PAOX1 genu AOX1 kodującego oksydazę alkoholową metanolu AOX1 Wektory ekspresyjne serii pPIC i pHIL Pichia pastoris  Ekspresja spod promotora PAOX1 jest regulowana przez obecność glukozy, glicerolu i metanolu w pożywce glukoza (represja) – konieczność odwirowania hodowli (m.in. z bioreaktorów np. 200 l) glicerol (represja, ale łatwiejsza indukcja) metanol (indukcja) Wektory ekspresyjne serii pPIC i pHIL Pichia pastoris  W wektorach plazmidowych serii pHIL i pPIC ekspresja genów heterogenicznych jest hamowana przez terminator genu AOX1: 3’AOX1(TT) Wektory ekspresyjne serii pPIC i pHIL Pichia pastoris   W wektorach plazmidowych serii pHIL i wektorach pPIC3.5K oraz pPIC9K rolę eukariotycznego markera selekcyjnego pełni gen kodujący dehydrogenazę histydynylową HIS4 W wektorach pPICZ A(B,C) oraz pPICZalfa A(B,C,E) stosowany jest „uniwersalny” marker selekcyjny: gen kodujący oporność na antybiotyk zeocynę Wektory ekspresyjne serii pPIC i pHIL Pichia pastoris Ekspresja genu oporności na zeocynę zachodzi w komórkach:  E. coli spod promotora PEM7  Pichia pastoris spod promotora PTEF1(ten promotor działa we wszystkich drożdżach)  Expression of beta-galactosidase form pPICZ Szczepy Pichia pastoris Z wektorami plazmidowymi serii pHIL, pPIC są najczęściej wykorzystywane dwa szczepy Pichia pastoris tj.:  Pichia pastoris GS115  Pichia pastoris KM71  Oba szczepy są mutantami auksotrofowymi Hisniezdolnymi do syntezy endogennej histydyny na skutek mutacji w genie HIS4 kodującym dehydrogenazę histydynylową Szczep Pichia pastoris GS115    Szczep Pichia pastoris GS115 opisywany jest jako mutant fenotypowy His-, Mut+ Szczepy Pichia pastoris Mut+ są to szczepy, które posiadają taką samą zdolność do wykorzystywania metanolu jako źródło węgla jak dzikie szczepy Pichia pastoris (Methanol utilization plus strain) Szczepy te posiadają dzikie kopie genów AOX1 i AOX2 kodujących obie „wersje” oksydazy alkoholowej Pichia pastoris Szczep Pichia pastoris KM71  Szczep Pichia pastoris KM71 opisywany jest jako mutant fenotypowy His-, MutS, Arg+  Szczepy Pichia pastoris MutS są to szczepy, które ze względu na dezaktywację genu AOX1 rosną znacznie wolniej niż szczepy dzikie na pożywce zawierającej metanol jako jedyne źródło węgla tzw: (Methanol utilization slow strain)  Szczep KM71 powstał poprzez insercję genu AOX1, w celu przerwania jego ciągłości, genu liazy argininobursztynianowej ARG4 (aox1::ARG4), która nadała szczepowi wyjściowemu KM71 o fenotypie His-, Mut+, Arg- fenotyp His-, MutS, Arg+ Integracja DNA wektora z DNA genomowym  1. 2. 3. Niezależnie od tego czy jako szczep gospodarza dla rekombinantowego wektora np. pPIC3.5K użyjemy szczepu GS115 czy też KM71 integracja DNA tego plazmidu z DNA genomowym tych szczepów Pichia pastoris może zajść na drodze rekombinacji homologicznej w obrębie: genu AOX1 szczepu GS115 lub genu aox1:ARG4 szczepu KM71 defektywnego genu his4 w obu powyższych przypadkach może również dojść do wielokrotnej rekombinacji homologicznej więcej niż jednej kopii DNA plazmidu z DNA genomowym gospodarza Integracja DNA plazmidowego w obrębie genu AOX1 szczepu GS115 i genu aox1: ARG4 szczepu KM71  Selekcja rekombinantów odbywa się na płytkach ze złożem nie zawierającym histydyny Wielokrotna rekombinacja homologiczna DNA plazmidowego z DNA genomowym szczepów Pichia pastoris  Rekombinacja wielokrotna może zachodzić w przypadku od 110% komórek rekombinantowych szczepów Pichia pastoris uzyskanych po transformacji DNA plazmidu rekombinantowego Integracja plazmidowego DNA z genomem Pichia pastoris poprzez podwójny „crossing over”  W przypadku szczepu Pichia pastoris GS117 prowadzi to do utraty przez ten szczep cechy fenotypowej Mut+ na Muts (ułatwiona selekcja rekombinantów) Integracja DNA wektora z DNA genomowym  UWAGA !!! Ze względu na transformację Pichia pastoris zlinearyzowanym DNA plazmidu rekombinantowego dominuje integracja z DNA genomowym poprzez podwójny „crossing over” Ekspresja wewnątrzkomórkowa i zewnątrzkomórkowa w komórkach Pichia pastoris Wektory plazmidowe używane do ekspresji genów heterologicznych w Pichia pastoris możemy podzielić na dwie grupy:  Wektory kierujące eksprymowane białko do cytoplazmy  Wektory kierujące eksprymowane białko do pożywki  Ekspresja wewnątrzkomórkowa i zewnątrzkomórkowa w komórkach Pichia pastoris W celu „transportu” białek z komórek Pichia pastoris do pożywki należy je wyposażyć w specyficzną sekwencję sygnalną na N-końcu, w tym celu można użyć: - sekwencję sygnalną białka obecną w „natywnej sekwencji nukleotydowej” genu je kodującego - sekwencję sygnalną rozpoznawaną przez Pichia pastoris np. sekwencja -faktora z Saccharomyces cerevisiae  Kierowanie eksprymowanego w Pichia pastoris białka do pożywki ułatwia proces oczyszczania białka rekombinowanego - Pichia pastoris produkuje niewiele białek zewnątrzkomórkowo  Wektory ekspresyjne Pichia pastoris serii pGAP   Do wektorów tej serii należą wektory plazmidowe pGAP A, B, i C oraz pGAPα A,B i C Wektory te różnią się od wektorów serii pHIL i serii pPIC wykorzystaniem silnego konstytutywnego promotora PGAP Pichia pastoris do ekspresji genów heterogenicznych oraz integracją z DNA genomowym Pichia pastoris w loci GAP Wektory ekspresyjne Pichia pastoris serii pGAP PGAP promotor PGAP promotor w komórkach Pichia pastoris jest odpowiedzialny za ekspresję genu kodującego dehydrogenazę aldehydu-3fosfoglicerolu  Integracja DNA plazmidowego wektorów serii pGAP z DNA genomowym Pichia pastoris Możliwa jest także wielokrotna integracja Szczepy Pichia pastoris  Z wektorami plazmidowymi serii pGAP najczęściej wykorzystywane są dwa szczepy   Pichia pastoris GS115 Pichia pastoris KM71 Szczepy Pichia pastoris Ze względu na obecność uniwersalnego markera selekcyjnego w wektorach plazmidowych serii pGAP (genu oporności na antybiotyk zeocynę) istnieje możliwość jego stosowania do ekspresji w „dzikich” szczepach Pichia pastoris tj.:  Pichia pastoris X-33  Z pozostałych serii plazmidów tylko wektory pPICZ A,B,C i pPICZ A,B,C,E mogą wykorzystać ten szczep jako gospodarza Uwagi  Produkcję białek rekombinowanych w Pichia pastoris powinno prowadzić się w odpowiednich bioreaktorach (pełne wykorzystanie „potencjału ekspresyjnego P. pastoris)  Glikozylacja białek posiadających w swej sekwencji motyw Asn-X-Ser/Thr, może prowadzić do utraty aktywności enzymatycznej lub właściwości strukturalnej (epitopy antygenowe) eksprymowanego białka heterogenicznego w Pichia pastoris Pichia pastoris – ekspresja genów Możliwość uzyskania dużej biomasy (100 - 200 g z litra hodowli) P. pastoris – ekspresja w kolbach     Jedna kolonia do 50 ml pożywki minimalnej z glicerolem (24-48 h) Przenieść komórki do 200 ml (24-48h, OD=10) Przenieść komórki do 1 litra pożywki z metanolem (0,5%) Po pierwszym dniu od indukcji dodawać 0,5% metanolu na kolejne 1-2 dni Hansenula polymorpha Hansenula polymorpha http://www.artes-biotechnology.com/expres/hansenula/hansenula01.jsp Hansenula polymorpha       Stabilność szczepów Multikopijnosć wektorów (do 120 na komórkę) Możliwość koekspresji trzech różnych genów Dosępne wektory nbez genów kodujących oporność na antybiotyki Promotor FMD – glicerol jest induktorem Promotor MOX – metanol jest induktorem Inne systemy - Artes  Arxula adeninivorans  Aspergillus sojae  Sordaria macrospora