Transcript
Aby manipulować genami niezbędne są odpowiednie narzędzia molekularne, które pozwalają uzyskać tzw. zrekombinowane DNA (umożliwiają rekombinację materiału genetycznego in vitro czyli w próbówce) Najważniejsze z nich to: • enzymy restrykcyjne • wektory DNA • inne enzymy np. ligazy, fosfatazy, polimerazy, kinazy, nukleazy
•Ligazy Katalizują tworzenie wiązań fosfodiestrowych między sąsiednimi grupami 3’ OH i 5’ PO4 w kwasach nukleinowych – DNA lub RNA. W reakcji tworzą się wysokoenergetyczne pośredniki z udziałem NAD+ lub ATP w zależności od typu ligazy. Funkcja in vivo: udział w replikacji opóźnionego pasma DNA, rekombinacja genetyczna, naprawa DNA
Zastosowanie ligazy w inżynierii genetycznej: Rekombinacja DNA in vitro – łączenie cząsteczek kwasów nukleinowych lepkich lub tępych końców oraz szereg innych bardzo specyficznych zastosowań.
Własności ligaz używanych w rekombinacji in vitro Ligazy
Substraty
kofaktory
temperatura
lepkie tępe końce DNA-RNA RNA-RNA _______________________________________________________________________________________ E.coli tak tak* nie nie NAD+ Mg2+ (1-3 mM) 10-15 C
T4 faga
tak
tak*
tak*
tak*
ATP Mg2+ (10 mM)
Bakterii termofilnych
tak
nie
nie
nie
NAD+ Mg2+ (10 mM)
4C 15-25 C
24-37 C
Ligacja tępych końców jest znacznie mniej efektywna
Fosfataza alkaliczna Usuwa 5’-fosforan z ssDNA, dsDNA i RNA, rNTP i dNTP. Metaloenzym (Zn II)
Bakteryjna fosfataza alkaliczna (BAP) najbardziej efektywna, ale jest oporna na ogrzewanie i detergenty. Z tego powodu trudno zakończyć reakcję defosforylacji. Peryplazmatyczny enzym, działa w buforze Tris pH 8.0-9.0 w obecności niskich stężeń Zn+2 (poniżej 1 mM). Alkaliczna fosfataza cielęca (CIAP –calf intestinal alkaline phosphatase) – mniejsza aktywność niż BAP, ale łatwiejsza do usunięcia (ogrzewanie 65 C – 30 min lub 75 C – 10 min) w obecności 10 mM EDTA. Alkaliczna fosfataza z arktycznych krewetek (SAP – shrimp alkaline phosphatase) – aktywność podobna do CIAP, ale inaktywacja 65 C –15 min (zalecane 70 C – 20 min).
Zastosowanie fosfatazy alkalicznej w inżynierii genetycznej:
•defosforylacja tj. usuwanie 5’ fosforanów z wektorów trawionych enzymami restrykcyjnymi •jeżeli DNA wektora zostało strawione jednym enzymem restrykcyjnym defosforylacja zapobiega jego zamykaniu się (autoligacji) wektora bez wstawki •traktowanie DNA fosfatazą zmniejsza niestety wydajność klonowania
Polimerazy DNA Polimerazy są enzymami, których główną funkcją jest kataliza tworzenia polimerów kwasów nukleinowych RNA i DNA na matrycy istniejących jednoniciowych DNA lub RNA. Proces ten to polimeryzacja.
Polimeraza I – polimeraza Kornberga (m.cz. 109 kD) Odkryta w 1958 r. Kodowana przez gen polA. Funkcja in vivo: enzym naprawczy Średnia szybkość polimeryzacji 20 nukleotydów/sec,
niska procesywność – 20-50 nukleotydów, 400 cząstek na komórkę. 1. Aktywność: 5’
3’ polimeryzacja DNA
Substrat: jednoniciowe DNA i starter z wolną grupą 3’OH. Reakcja: DNAOH
DNA- (pdN)n +PP
Wymagania: Mg+2 dATP, dTTP, dGTP, dCTP
Struktura krystaliczna Taq DNA polimerazy
2. Aktywność:
3’
5’ egzonukleolityczna-sprawdzająca
Substrat: dsDNA lub ssDNA z wolnym 3’OH końcem. Degraduje DNA od 3’OH. Ta aktywność na dsDNA jest blokowana przez aktywność polimeryzacyjną 5’—3’. Reakcja:
dsDNA lub ssDNA
5’pdNOH
Wymagania: Mg+2 3. Aktywność: 5’
3’ egzonukleolityczna
Substrat: dsDNA lub RNA-DNA hybrydy. Degraduje dsDNA od 5’ końca; degraduje RNA w hybrydzie z DNA - aktywność RNAzy H Wymagania: Mg+2
Zasosowanie polimerazy I (holoenzymu) 1. Znakowanie DNA przez przesunięcie przerwy (ang. nick-translation). Tylko ta polimeraza może przeprowadzać tę reakcję ze względu na aktywność egzonukleazy 5’— 3’
Fragment Klenowa DNA polimerazy I polimeraza I pozbawiona N-końcowej domeny stanowi tzw. fragment Klenowa. Polimeraza (46 kD)
3’—5’ egzonukleaza (22 KD)
5’—3’ egzo nukleaza
N
C Fragment Klenowa (605 aa)
Zastosowanie polimerazy Klenowa: 1. Synteza dsDNA na matrycy ssDNA: Warunki reakcji: matryca ssDNA, startery - oligonukleotydy 6-20 n komplementarne do określonego fragmentu DNA z wolną grupą OH, bufor, dNTPs,
Reakcja może z powodzeniem służyć do znakowania sond molekularnych, jeśli do buforu reakcyjnego doda się nukleotydów radioaktywnych lub znakowanych innymi markerami.
2. Wypełnianie cofniętych 3’- końców we fragmentach DNA (fill-in reaction): Stosuje się w celu tworzenia „tępych końców” we fragmentach powstałych po trawieniu enzymami restrykcyjnymi tworzącymi 5’-wystające końce.
3’
Reakcja może z powodzeniem służyć do znakowania sond molekularnych, jeśli do buforu reakcyjnego doda się nukleotydów radioaktywnych lub znakowanych innymi markerami.
3. Wytrawianie wystających 3’ – końców: Stosuje się również w celu tworzenia „tępych końców” we fragmentach powstałych po trawieniu enzymami restrykcyjnymi tworzącymi 3’-wystające końce.
Aktywność egzonukleazowa 3’→ 5’ polimerazy Klenowa wytrawia wystające nadmierności.
DNA polimeraza bakteriofaga T7 •zawiera dwie podjednostki, o aktywnościach takich samych jak polimeraza Klenowa. •Szczególnie użyteczna ponieważ charakteryzuje się znacznie większą procesywnością i wysoką wiernością (~1000 x większą niż polimeraza Klenowa). •Używana jest do sekwencjonowania DNA metodą Sangera, także pod nazwą Sequenase lub Sequenase 2.0
Termostabilne DNA polimerazy DNA-zależna polimeraza DNA - mają podobne aktywności jak polimeraza I, ale maksymalną aktywność katalityczną wykazują w 75 – 80 C (Taq polimeraza ma tylko 10% maks. aktywności w 37 C). -szybkość reakcji w optymalnej temp. 150 dNTP/sec/cząsteczkę enzymu. ____________________________________________________________________________
Polimeraza
3’ – 5’ egzonukleaza
Żródło i własności
____________________________________________________________________________ Taq nie Termus aquaticus. Okres półtrwania 95 C - 1.6 h; wierność 1x10 -4 - 2x10 –5; procesywność: 42 n Pfu
tak
Pyrococcus furiosus. Największa wierność: 1.5x10-6
Thermococcus litoralis. Okres półtrwania 95 C - 7 h; wierność pośrednia _____________________________________________________________________________ Vent
tak
Zastosowanie termostabilnych polimeraz: Łańcuchowa reakcja polimerazy (PCR) w różnych odmianach.
Odwrotna transkryptaza – RNA-zależna polimeraza DNA Obecna w retrowirusach, gdzie kopiuje wirusowe RNA przed integracją do genomu. Ma dwie aktywności: -RNA zależnej DNA polimerazy – w warunkach laboratoryjnych syntetyzuje DNA na matrycy ssRNA i ssDNA z jednakową wydajnością. W obu przypadkach wymaga startera RNA lub DNA. Nie ma aktywności 3’→ 5’ egzonukleazy (1/500 n jest błędny). - Rnazy H - jest rybonukleazą, która degraduje RNA z RNA-DNA hybrydów. Funkcjonuje zarówno jako endo- i egzonukleaza. Najczęściej wykorzystuje się dwa różne enzymy najczęściej otrzymywane jako białka rekombinowane w E. coli.
•z wirusa mysiej białaczki Moloneya z wirusa ptasiej mieloblastozy
Transformation
Zastosowanie odwrotnej transkryptazy: 1. Kopiowanie RNA na DNA: szczególnie przydatna podczas przepisywania eukariotycznych transkryptów mRNA eukariotycznych genów na tzw. cDNA
(komplementarne DNA). Funkcję starterów pełnią wówczas krótkie 12-18 n
polimery
(oligo dT), komplementarne z ogonkami poliA mRNA.
2. Tworzenie kopii cDNA z mRNA przed amplifikacją PCR, w reakcji zwanej RT-PCR, w której używa się starterów komplementarnych do sekwencji kodującej mRNA
Terminalna transferaza •Katalizuje dodawanie nukleotydów dNTP do 3’ OH końca DNA. •Działa na ssDNA, dsDNA z wystającymi końcami (preferuje wystający koniec 3’), jest mniej efektywna w przypadku cząsteczek z tępymi końcami.
•Jest to jedyna polimeraza DNA, która nie wymaga matrycy. •Niezbędny jest kobalt jako kofaktor w reakcji dodawania pirymidyn lub Mg+2 w dodawaniu puryn. •W odpowiednich warunkach terminalna transferaza może dodać wiele tysięcy dNTP lub tylko jeden nukleotyd jeśli jest odpowiednio zmodyfikowany np. ddNTP
3’ 3’
Zastosowanie: 1. Znakowanie 3’ końców DNA np. znacznikami radioaktywnymi (takie fragmenty DNA wyznakowane tylko na końcach są często wykorzystywane w technice pozwalającej na wizualizację oddziaływania DNA białko – technika EMSA)
2. Dodawanie homopolimerowych ogonków do DNA: Stosowany np. do rekombinowania i klonowania cDNA w wektorach plazmidowych. Terminalna transferaza pozwala na tworzenie homopolimerowych ogonków komplementarnych do siebie w liniowych fragmentach DNA.
Kinaza polinukleotydowa (PNK) •PNK jest enzymem, który katalizuje przeniesienie - fosforanu z ATP na 5’ koniec DNA lub RNA. •Najczęściej stosuje się rekombinowany enzym faga T4 nadprodukowany w E. coli.
Zwykle są stosowane dwa typy reakcji : forward - w której - fosforan z ATP jest przenoszony na 5’ koniec defosforylowanego DNA. W reakcji wymiany – exchange, w obecności nadmiaru ADP, PNK przenosi terminalny fosforan z ufosforylowanego DNA na ADP i ponownie przenosi radioaktywny - fosforan z [32P] ATP. Reakcja typu wymiany jest mniej wydajna.
Zastosowanie: głównie znakowanie np. radioaktywne cząsteczek DNA używanych jako sond w hybrydyzacji oraz w technice EMSA
Nukleazy (inne niż ER) DNazy i RNazy Dzielą się na endo- i egzonukleazy. Ich specyficzność substratowa zależy wyłącznie od stężenia enzymu im większe stężenie tym niższa specyficzność.
Dnazy 1. DNaza I - endonukleaza, tnie dsDNA i ssDNA preferencyjnie w sąsiedztwie C lub T tworząc 5’-fosforylowane di-, tri-, i tetranukleotydy. Nie trawi RNA Zastosowanie: 1. Usuwanie DNA z preparatów RNA; 2. Analiza interakcji DNA-białko (tzw. footprinting); 3. Nadtrawianie DNA w reakcji przesunięcia przerwy
RNazy 1. Rybonukleaza A – endorybonukleaza, trawi ssRNA w 3’ końcu reszty pirymidynowej Degraduje RNA do 3’ufosforylowanych mono- i oligonukleotydów Zastosowanie rybonukleaz: 1.
Usuwanie kontaminacji RNA w preparatach plazmidowego DNA
