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VacciMonitor Año 14 No. 2 julio-diciembre de 2005 1 Evaluación de la toxicidad por dosis única de la vacunaantidiftérica antitetánica en ratas Sprague Dawley Yulieé López, Sergio Sifontes, Juan F. Infante, Daiyana Díaz, Mónica Obaya, Eduardo Álvarez, EligioSosa, Tamara Hernández, Viviana Pérez, Yolanda Valdés, Isabel García, Vismark Torres, Elina Parajón,Adriana Ponce, Niurka González, Maylén Argamasilla. Instituto Finlay, Centro de Investigación-Producción de Vacunas. Ciudad de La Habana, Cuba. E-mail:
[email protected] el presente ensayo se evaluó la toxicidad por dosis única de la vacuna antitetánica-antidiftérica (VA-DIFTET ® ) en ratas Sprague-Dawley. Para ello se utilizó la vía intramuscular porser la propuesta a usar en humanos. Se administraron 0,3 mL de la vacuna o sus componentes aun total de 20 animales por grupo (10 de cada sexo). Los mismos se observaron diariamente: semidió el consumo de agua y alimento en días alternos y se determinó el peso corporal conintervalos semanales. Se incluyó el análisis anatomopatológico de los animales al final delestudio. Ninguno murió durante el ensayo ni se observaron síntomas clínicos. No hubodiferencias estadísticamente significativas (p>0,1) en cuanto al consumo de agua, alimentos y elpeso corporal. En el estudio anatomopatológico se observaron lesiones granulomatosasmacrofágicas en las ratas tratadas con la vacuna o con el placebo, hallazgo este característico delas vacunas adyuvadas con hidróxido de aluminio. Los resultados sugirieron que la vacuna VA-DIFTET ® es potencialmente inocua al administrar la dosis única por vía intramuscular. Palabras clave : Toxicología, dosis única, difteria, tétano, toxoide, vacuna, rata, Sprague Dawley Introducción Desde tiempos remotos el hombre ha tratado deprevenir las enfermedades y una forma eficientede hacerlo es a través de la vacunación. Conrespecto a este tema existe una revolución en eltema regulatorio para evitar la salida al mercadode productos dañinos a la salud humana. Es porello que se han implementado pruebas enanimales para explorar el potencial tóxico de losproductos antes de ser probados en humanos (1,2).La vacuna antidiftérica-antitetánica VA-DIFTET ® consiste en una preparación de anatoxinasdiftérica y tetánica. La toxina diftérica se obtienepor cultivo de Corynebacterium diphtheriae (cepaPark Williams # 8), la que se somete adetoxificación y purificación para lograr laanatoxina o toxoide. Similarmente, se obtiene laanatoxina tetánica mediante cultivo de Clostridium tetani (cepa Harvard). Las anatoxinasson adsorbidas a un gel de hidróxido de aluminioy se añade tiomersal como preservante (13).Respondiendo a las exigencias de las normasinternacionales para la evaluación de vacunas,CPMP/ SWP/ 465/95 de la Agencia Europea parala Evaluación de Productos Medicinales (EMEA)se realizó, en el presente trabajo, la prueba detoxicidad por dosis única a la vacuna VA-DIFTET ® (8). Esta prueba permite estudiar la toxicidadcausada por la administración de una dosis de lassustancias de ensayo. Materiales y Métodos Animales: Se usaron ratas Sprague Dawley deambos sexos, de 5 a 6 semanas de edad y conun peso corporal de 150-200 g. Estas fueronsuministradas por el Centro Nacional para laProducción de Animales de Laboratorio de Cuba(CENPALAB). Al recibirse los animales fueroncolocados, de acuerdo con el sexo, en cajas de VacciMonitor Año 14 No. 2 julio-diciembre de 2005 2 policarbonato Tipo-IV (superficie de piso 1800cm 2 ) a razón de cinco animales por caja. Elmaterial de encamado fue bagazo de caña deazúcar (suministrado por el CENPALAB),esterilizado en autoclave (121 ° C, 20 min, 1,5Kgf/cm 2 ) (6). El encamado se cambió dos vecespor semana. Se suministró pienso peletizadopropio para ratas (igualmente suministrado ycertificado por el CENPALAB) y agua fresca “ ad libitum”. Los locales donde se alojaron losanimales mantuvieron a una temperatura de 22 ± 2 °C y una humedad relativa de 60 ± 5%. Semantuvo un ciclo de 10 h luz y 14 h deoscuridad. Se realizó una cuarentena de siete díasantes del comienzo del experimento. Todos losprocedimientos estuvieron de acuerdo con elComité de Ética vigente (3, 7). Diseño experimental: El estudio de dosis únicatuvo una duración de 21 días, incluyendo lasemana de adaptación. El esquema detratamiento a evaluar constó de una inoculaciónal concluir la cuarentena a todos los animales delestudio, excepto los del grupo control. Se empleó la vía intramuscular por ser lapropuesta para uso clínico, aplicándose elmáximo volumen éticamente permisible en lasratas de esta categoría por vía intramuscular enun solo punto (0,3 mL) (11). Esta dosis en mg/Kg representó 34 veces lapropuesta a aplicar en niños de 5 Kg de peso (4,5).En la Tabla 1 se resume el diseño de los gruposexperimentales. Tabla 1. Diseño de los grupos experimentalesGrupoTratamientoNúmero deanimales porsexo IControl no inoculado10IIPlacebo10IIIAnatoxina Diftérica10IVAnatoxina Tetánica10VAnatoxina Diftérica-Tetánica10VIIIVacuna (VA-DIFTET )10 Las variables evaluadas fueron las siguientes: Peso Corporal: Los animales fueron pesados alcomienzo y al final del período de adaptación, así como una vez a la semana mientras duró elestudio.Consumo de agua: El agua se administró “ad libitum ”, no obstante se determinó en díasalternos el volumen consumido. Para ello secolocaron en cada jaula frascos con 750 mL deagua. Para estimar el consumo se calculará ladiferencia entre el volumen suministrado y elvolumen de agua remanente. Para el cálculo delconsumo medio diario por animal, esta diferenciase dividió entre el número de animales en la cajay el número de días transcurridos desde la últimamedición.Consumo de alimento: Se suministraron 500 g depienso en las tolvas de las jaulas. Para determinarla cantidad consumida se pesó el pienso residualde la tolva y se determinó la diferencia con elsuministrado. Esta operación se realizó en díasalternos. Estudio anatomopatológico: Dos semanasdespués de la inoculación todos los animalesfueron sacrificados mediante una sobredosis depentobarbital sódico (100 mg/Kg) por víaintraperitoneal y sometidos a necropsia. Serealizó el examen histopatológico a todos losórganos que mostraron alteraciones macros-cópicas durante la necropsia, se incluye el puntode inoculación (músculo y ganglio linfático). Lasmuestras fueron fijadas en formol neutro al 10%durante las primeras 24 h y luego se transfirierona una solución menos concentrada (4%). Elprocesamiento se llevó a cabo por el métodorutinario de inclusión y cortes en parafina. Loscortes histológicos fueron teñidos conhematoxilina-eosina. Análisis estadístico Peso corporal: El peso corporal se midiósemanalmente y procesó mediante la prueba deKruskal-Wallis, analizando cada sexo y tiempo porseparado. Consumo de agua y alimento: Para realizar elanálisis estadístico de estas dos variables sehicieron grupos de observaciones en el tiempo(correspondiendo a las semanas de observación)como un procedimiento de bloqueo para evitar un VacciMonitor Año 14 No. 2 julio-diciembre de 2005 3 incremento innecesario del error experimental. Secomparó el consumo mediante análisis devarianza de clasificación triple (tratamiento x sexox tiempo).Lesiones macroscópicas y microscópicas: Lafrecuencia de las lesiones se comparó medianteanálisis log-lineal y la prueba exacta de Fisher. Paquete estadístico y nivel de significación: Paratodos los análisis se empleó el paqueteestadístico STATISTICA [StatSoft, Inc. (2003).STATISTICA (data analysis software system),version 6. www.statsoft.com]. Los valores de P<0,05 se consideraron significativos desde elpunto de vista estadístico. Resultados y Discusión Mortalidad y signos clínicos: Ningún animal muriódurante el ensayo ni se observaron síntomasclínicos en ninguno de los animales.Peso corporal: Se hizo un test de Kruskal-Wallis(ANOVA por rangos) para comparar lostratamientos según sexo y tiempo y no seobservaron diferencias estadísticamentesignificativas (P>0,05) (Tabla 2). Tabla 2: Peso vivo promedio (g) de las ratas.HembrasMachosTratamientos0 días7 días14 díasMedias*0 días7 días14 díasMedias Difteria190,9205,8218,6205,1230,6276,8329,7279,1Tétanos201,7205,5219,9209,1241,5289,0335,2288,6Difteria-Tétanos201,4209,7228,1213,1237,3283,7311,9277,6Vacuna192,4202,8217,4204,2246,0273,4331,9269,8Placebo186,2202,7212,9200,6232,6279,8323,5278,6Control197,0208,2223,3209,5230,8280,4325,2278,8Medias**199,4205,8220,03206,9***229,5280,5326,2278,7**** Media por tratamiento, ** Media por tiempo, *** Media por sexoConsumo de Alimentos: El consumo de alimentosno mostró diferencias estadísticamentesignificativas entre los grupos de tratamientos(P>0,5) (Tabla 3). Los machos consumieron másque las hembras (P<0,05) y no hubo interacciónsignificativa entre los sexos y los tratamientos(P>0,1). Las medias de todos los grupos fueronde 15-21 g para las hembras y de 25-30 g paralos machos, con una media general de 23,8 g. Tabla 3: Consumo promedio de alimento (g) por animal / día según sexo, grupo, tratamiento y tiempopostinoculación (semanas)HembrasMachosTratamientosSemana 1Semana 2Media*Semana 1Semana 2Media* Difteria17,118,818,025,627,026,3 Tétanos15,318,116,726,130,328,2 Difteria-Tétanos18,520,919,726,328,528,6 Vacuna20,019,819,926,330,828,6 Placebo16,817,817,326,028,827,4 Control17,618,918,325,228,426,8 Media**17,619,118,3***25,929,027,4*** Media general: 23,8 mg * : Media por tratamiento. **: Media por semana. ***: Media por sexo. VacciMonitor Año 14 No. 2 julio-diciembre de 2005 4 Consumo de Agua: El consumo de agua nomostró diferencias estadísticas entre los gruposexperimentales [P>0,1 (Tabla 4)]. En general, losmachos consumieron más que las hembras(P<0,01) y el consumo medio diario fue de35,5 mL por animal. Lo mismo el consumopromedio de agua que el de alimento seencontraron entre los rangos normales descritospara esta especie y categoría de animales (12). Tabla 4: Consumo medio diario de agua (mL) por animal según sexo, grupo tratamiento y tiempopostinoculaciónHembrasMachosTratamientosSemana 1Semana2Media*Semana 1Semana2Media* Difteria27,935,831,940,137,038,6Tétanos31,134,833,040,640,740,7Difteria-Tétanos31,032,731,942,437,840,1Vacuna28,931,530,245,438,542,0Placebo32,934,333,634,336,735,5Control30,432,831,637,637,237,4Media**30,433,732,0***40,138,039,1***Media general: 35,5 mL*: Media por tratamiento, **:Media por semana, ***:Media por sexoEstudio Anatomopatológico: Ninguno de losanimales en el ensayo mostró alteracionesmacroscópicamente visibles de valor diagnóstico.Desde el punto de vista microscópico seobservaron formaciones granulomatosas de tipomacrofágico, bien encapsuladas, en hembras ymachos de los grupos vacunados y placebo(Figura 1). Figura 1: Músculo de una hembra SpragueDawley del grupo placebo. La frecuencia de presentación de los granulomasfue similar en los animales vacunados y en losplacebos (P>0,5). Estos granulomas se hanobservado en múltiples vacunas, por lo que se hacomprobado que el hidróxido de aluminio utilizadocomo adyuvante es el responsable del desarrollode las lesiones granulomatosas (9). Se hademostrado que los granulomas desempeñan unimportante papel en la duración de la respuestainmune (10). Es interesante que las hembras mostraron mayorfrecuencia de lesiones en el músculo que losmachos (P<0,01). Esto pudiera deberse a que lahembra tiene menor masa muscular, por lo quesería proporcionalmente mayor la dosis a nivel depunto de inoculación con respecto al macho. Noobstante, a nivel del ganglio linfático regionalestas diferencias no fueron significativas(P>0,1).El peso vivo de los animales, así como elconsumo de agua y alimentos no mostrarondiferencias entre grupos de tratamiento queindicaran toxicidad del producto probado; laslesiones anatomopatológicas observadasresponden y son atribuibles al adyuvante devacunas actualmente en uso clínico. VacciMonitor Año 14 No. 2 julio-diciembre de 2005 5Tabla 5: Frecuencia de aparición de las lesiones durante el estudio anatomopatológico. Lesiones (%)SexoGrupoMúsculoGanglioFrecuenciaGeneral (%)Difteria000Tétanos000Difteria-Tétanos000Vacuna402030Placebo304035MachosControl000Difteria000Tétanos000Difteria-Tétanos000Vacuna806070Placebo804060HembrasControl000Teniendo en cuenta que en este estudio no seobservaron muertes, ni se registraron síntomasque indicaran toxicidad local ni sistémica,llegamos a la conclusión de que bajo lascondiciones de este estudio y según las variablesmedidas, la vacuna VA-DIFTET ® espotencialmente inocua por administraciónintramuscular a dosis única en ratas SpragueDawley de esta categoría. Referencias 1. Las nuevas vacunas y los aspectos regulatorios.Boletín para Profesionales ANMAT. 1999; 7(4):61- 2.2. Normas sobre Medicamentos de la ComunidadEuropea, Vol. III. “Directrices sobre la calidad,seguridad y eficacia de los medicamentos de usohumano”. 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