Transcript
57 Julio-diciembre 2007 EVALUACIÓN POR MÉTODO ECOMÉTRICO DE AGAROBTENIDO DE ALGAS ROJAS COLOMBIANASEVALUATION FOR ECOMÉTRIC METHOD OF AGAROBTAINED OF COLOMBIAN RED ALGAE 1 A. Villalobos, 1 L. Calderón, 1 C. Figueroa, 1 J. Fierro, 1 G. Otálora, 2 R. Álvarez, 1 B.Quevedo-Hidalgo, 1 M. Mercado-Reyes, 1 M. Huertas-Valero, 1 A. Trespalacios-Rangel 1 Departamento de Microbiología, Facultad de Ciencias, Pontificia Universidad Javeriana. Carrera 7 No 43-82, Bogotá, Colombia 2 Fundación Maguare. Manizales (Caldas)
[email protected] Resumen La finalidad de este estudio fue evaluar la productividad del agar-agar obtenido a nivel de laboratorio dedos especies de algas rojas del género Gracilaria provenientes de la costa Caribe de Colombia ( G.cylindrica y G. mammillaris ). La productividad del medio de cultivo elaborado con base agar - agar sedeterminó utilizando el método ecométrico con 20 especies bacterianas diferentes. Los valores del índicede crecimiento absoluto (ICA) e índice de crecimiento relativo (ICR) obtenidos mostraron que el agarbase Gracilaria mammillaris y Gracilaria cylindrica son igualmente productivos, con lo cual se demuestraque ambas especies se pueden utilizar en la producción de agar Palabras clave: agar, algas marinas, Gracilaria cylindrica, Gracilaria mammillaris . Abstract The purpose of this study was to evaluate the productivity on agar-agar of two species of red algae of thegenera Gracilaria belonging from the Colombiam Caribean coast ( G. cylindrica and G. mammillaris )obtained in laboratory. Productivity of culture media elaborated with base agar - agar was determinedusing the ecometric method with 20 different bacterial species. Results obtained from ICA and ICRshowed that agar extracted from Gracilaria cylindrica and Gracillaria mammillaris are equally productive,this shows that both species can be used for agar production. For better results, it is still necessary tooptimize extraction processes and purification of agar in both species of algae. Key words: agar, marine algae, Gracilaria cylindrica , Gracilaria mammillaris. UNIVERSITAS SCIENTIARUM Revista de la Facultad de Ciencias Vol. 12, edición especial III, 57-65 58 Universitas Scientiarum, Vol 12, edición especial III, 57-65 INTRODUCCIÓN El agar es un polisacárido constituido deagarosa y agaropectina que se extrae de lasparedes de las algas Rhodophyta . Se deno-minan algas rojas a los miembros del filo Rodophyta , un grupo de algas con más de4000 especies agrupadas en 650 géneros.Las algas rojas se caracterizan por tenerpigmentos ficobilínicos que les confierenel color rojizo (ficoeritrina y ficocianina),y que enmascaran el color de las clorofilas.La mayoría de las especies crecen cerca delas costas tropicales y subtropicales deba- jo de la línea intermareal (Freile-Pelegrin et al., 1995; Cognetti et al. , 2001).La demanda de algas especialmente para laelaboración de algunos ficocoloides impor-tantes (alginatos, agar, carragenano) ha cre-cido con rapidez en los últimos diez años.Este desarrollo no muestra señales de dis-minución debido al potencial de las algascomo fuente directa de proteína, productosfarmacéuticos y la demanda de gomas ve-getales que será el factor que más influiráen la explotación futura de los recursosmundiales de algas marinas (McHugh,2002).El agar es utilizado principalmente comobase para los medios de cultivo microbio-lógicos, aunque también tiene muchas apli-caciones en la industria alimenticia yfarmacéutica a nivel mundial (Kirk, 1998).La idea de utilizar el agar como soporte demedio de cultivo bacteriano sólido, fueconcebida por la alemana Frau FannyEilshemius Hesse en 1881. El descubri-miento fue dado a conocer a Robert Koch,quien empleó esta sustancia como mediode cultivo en sus famosos experimentossobre el bacilo de la tuberculosis. En sunota preliminar acerca de dicho microor-ganismo, publicada en 1882, Koch anun-ció el agar como un nuevo medio sólidopara cultivo microbiológico. Desde enton-ces se ha convertido en el uso más comúnpara el mismo (Freile-Pelegrin et al. , 1995).Actualmente la totalidad del agar para usomicrobiológico que se consume en Colom-bia se importa de otros países como EstadosUnidos, Chile y Portugal. En cuanto a la di-versidad de algas disponible en el Caribecolombiano, tanto en la zona costera comoen las zonas oceánicas se dice que actual-mente existen 565 especies de algas (16 ver-de-azuladas, 165 verdes, 70 pardas y 314rojas) (Díaz-Pulido y Díaz-Ruiz, 2003).El análisis ecométrico establece la eficien-cia con la cual un medio de cultivo sirvepara recuperar una cepa, mediante la com-paración que se realiza entre el medio aevaluar y un medio control. Esta técnicaevalúa tanto la sensibilidad de los mediosa la colonización por los microorganismosbuscados (productividad) como también laresistencia a la colonización por las cepasque interfieren (selectividad). Un parámetroútil para interpretar los resultados ecomé-tricos es el índice de crecimiento absoluto(ICA). Éste denota el último sector de laplaca en el cual ha habido un crecimientosignificativo. Otro parámetro es el índicede crecimiento relativo (ICR) que relacio-na los valores de ICA del medio a evaluarcon el ICA del medio control (Mossel,2003).El objetivo de este trabajo fue evaluar laproductividad de un medio de cultivo pre-parado con agar obtenido de algas marinas Gracilaria mamillaris y Gracilaria cylin-drica. Se plantearon dos hipótesis, en laprimera se propuso que no debía existir di-ferencia de proporciones de cepas con re-sultados de ICA alta y medianamenteproductivos entre los medios prueba y losmedios control y la segunda hipótesis plan-teó que los medios prueba con resultado deICR=1, tienen una capacidad de recupera-ción de cepas superior al 80%. 59 Julio-diciembre 2007 MATERIALES Y MÉTODOSAlgas rojas La colecta de las algas se realizó, en el sitiodenominado “Punta La Loma”, municipiode Santa Marta, departamento de Magda-lena - Colombia, Coordenadas geográficas11º 07’ 34’’ N, 74º 14’ 00’’ W; en un arrecifecoralino fósil, con restos de moluscos y raí-ces de mangle litificadas. Se realizaron me-diciones de salinidad, temperatura yoxígeno. Los parámetros medidos en elagua fueron temperatura (26,8º C), salinidad(38,0 ups), pH (7,0 unidades) y oxígeno (7,5ml/l). Luego se procedió a la clasificacióntaxonómica de las algas colectadas median-te morfometría, por parte del biólogo mari-no Ricardo Álvarez León, y luego fueroncomparadas y confirmadas con la colecciónde algas del Instituto de InvestigacionesMarinas y Costeras “José Vives D’Andreis”INVEMAR, Universidad de Bogotá JorgeTadeo Lozano – seccional Caribe y la co-lección de algas del profesor Germán BulaMeyer (q.p.d.) en la Universidad del Mag-dalena, en donde además se realizó un de-pósito de las especies de algas utilizadasen este estudio. Las especies escogidas fue-ron clasificadas como G. mamillaris y G.cylindrica . Agar El agar empleado en este estudio fue obte-nido a partir de un proceso de extracciónácido basado en la decoloración previa delas algas con hipoclorito de sodio 3%. Lasalgas decoloradas y lavadas fueron cocina-das en agua (8,333 ml/g alga) por un tiem-po de 6 horas, en la extracción se empleóvinagre como coadyuvante en una propor-ción de 10 g de vinagre por cada 1000 g dealga a cocinar. El extracto líquido obteni-do fue congelado y descongelado, y final-mente secado en bandejas a 70 ºC (Coello,2004). Microorganismos Se utilizaron 20 especies bacterianas comomicroorganismos referentes para los análi-sis de productividad por el método ecomé-trico: Bordetella bronchiseptica CMDM-PUJ039 , Citrobacter freundii CMDM-PUJ 044 , Enterobacter aglomerans CMDM-PUJ032 , Escherichia coli CMDM-PUJ 034 ,Klebsiella pneumoniae CMDM-PUJ 041 , Morganella morganii CMDM-PUJ 052 ,Providencia stuartii CMDM-PUJ 053 ,Pseudomonas aeruginosa CMDM-PUJ054 , Pseudomonas aeruginosa CMDM-PUJ 055 , Salmonella cholerasuis CMDM-PUJ 074 , Salmonella paratiphy A CMDM-PUJ 009 , Salmonella paratiphy BCMDM-PUJ 009A, Salmonella typhi CMDM-PUJ 045 , Salmonella typhimurium CMDM-PUJ 031 , Shigella flexneri CMDM-PUJ 005 , Shigella disenteriae CMDM-PUJ006 , Staphylococcus epidermidis CMDM-PUJ 058, Streptococcus agalactiae CMDM-PUJ 043 , Streptococcus mutans CMDM-PUJ 022 y Streptococcus pyogenes CMDM-PUJ 079. Streptococcus pneumo-niae CMDM-PUJ 024, fue utilizado comomicroorganismo interferente. Todas las ce-pas fueron obtenidas en la Colección deMicroorganismos del Departamento deMicrobiología de la Pontificia UniversidadJaveriana en Bogotá, DC; (CMDM – PUJ).Como microorganismos referentes se selec-cionaron bacterias de crecimiento rápido,poco exigentes en sus requerimientosnutricionales y de fácil desarrollo en me-dios de cultivo simple. Como microor-ganismo interferente se seleccionó unmicroorganismo de crecimiento exigente,incapaz de desarrollarse en medios de cul-tivo simples.Con el fin de asegurar la viabilidad de lasdistintas especies bacterianas y determinarla fase exponencial de cada una de ellas, se 60Universitas Scientiarum, Vol 12, edición especial III, 57-65 realizaron curvas de crecimiento por tripli-cado en caldo BHI. Los cultivos iniciales decada una de las especies se incubaron por 18horas a 37°C en agar McConkey para lasenterobacterias y en agar sangre para loscocos Gram positivos y para B. bronchisep-tica . El inóculo se preparó con 2 ml de lasuspensión de la respectiva bacteria en so-lución salina 0,85% (p/v) llevada al tubo n°1 de la escala de Mc Farland y 18 ml decaldo BHI (infusión cerebro corazón), y seincubó por 12 horas a 37°C a 150 rpm. Parala fermentación discontinua, se mezcló elanterior inóculo con 180 ml de BHI estéril(10% del volumen total del inóculo) y semantuvo durante 24 horas en las mismascondiciones del inóculo (37°C a 150 rpm).Se realizaron muestreos cada dos horas pararealizar las curvas de crecimiento.El medio nutritivo para las pruebas micro-biológicas se preparó según el protocoloPNT-ME-010 y la composición final delmedio fue: peptona 5 g/l, extracto de leva-dura 5 g/L y cloruro de sodio 5 g/L. Paralos diferentes procedimientos del métodoecométrico se utilizó agar bacteriológicode dos casas comerciales diferentes y agarbacteriológico obtenido de G. cylindrica y G. mammillaris . Concentración de agar-agar Con el agar-agar extraído de las algas rojascolombianas, se realizaron diferentes con-centraciones (g/l): 1,5, 2,0, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0y 5,0% (p/v), se hidrataron durante 1 horaen agua tibia, y se dejaron a fuego lentohasta alcanzar su ebullición. Posteriormentese hicieron pruebas de gelificación para de-terminar la concentración ideal o de mayorconsistencia. Pruebas microbiológicas El agar-agar sin adición de nutrientes fueinoculado con S. epidermidis, E. coli y B.bronchiseptica con el fin de verificar si elagar aportaba nutrientes a los microorga-nismos. Método ecométrico La selección del método ecométrico se rea-lizó teniendo en cuenta la comparación conotros como: Miles-Misra, y el de estrías(Michanie, 1992). Según Kornacki et al (2003), entre las ventajas del método eco-métrico se destacan la facilidad y rapidez enla ejecución de la prueba, la eficiencia paraevaluar varios lotes de medios de cultivo yel uso de un inóculo estandarizado en don-de se garantiza la misma cantidad de micro-organismo en todas las siembras.La evaluación de la productividad del me-dio de cultivo se realizó a través del análi-sis del método ecométrico (Mossel, 2003)el cual se procesó por triplicado para cadauna de las especies bacterianas.Se inoculó el medio de prueba (agar nutri-tivo con agar base G. mammillaris y G.cylindrica respectivamente) y dos contro-les comerciales (control 1 y control 2)Por medio de este método se evaluó la efi-ciencia con la cual el medio de cultivosirve para recuperar los diferentes microor-ganismos, mediante la comparación que serealiza entre un microorganismo referentey un microorganismo interferente. En esteestudio el microorganismo interferente fue S. pneumoniae , y los referentes fueron los20 restantes mencionados anteriormente.Un parámetro útil para interpretar los resul-tados es el índice de crecimiento absoluto(ICA), el cual se calculó para determinar laproductividad de los medios. La interpre-tación de este índice se fundamenta en lasiguiente clasificación: ICA menor a 2,5(bajamente productivo), ICA entre 2,5-4,0(medianamente productivo) e ICA mayor a4,0 (altamente productivo). Medios con 61 Julio-diciembre 2007 ICA menor a 2,5 no deben utilizarse, ni sa-lir al mercado.Los valores de ICA obtenidos se expresa-ron como índice de crecimiento relativo(ICR), para comparar el medio prueba conun medio de referencia, en este caso conlos dos controles comerciales. Éste se ob-tuvo con la fórmula; ICR = ICA prueba/ ICA control. Interpretando el ICR>1 comoresultado altamente favorable para el me-dio prueba. Análisis estadístico Con el fin de probar si existían diferenciasen la proporción de productividad (ICA eICR) se realizó una prueba de hipótesis parala proporción a un nivel de significanciadel 5%, y para determinar la capacidad quetiene el medio prueba de recuperar cepas,se probó la hipótesis de:Ho = La proporción de cepas con ICR ma-yor o igual a 1 es mayor o igual a 80%.H1 = la proporción de cepas con ICR ma-yor o igual a 1 es mayor a 80%. RESULTADOSConcentración de agar-agar Los resultados de los ensayos preliminaresdemostraron que las mejores consistenciasfueron las concentraciones de 5,0, 4,5 y4,0%; debido a que los resultados obteni-dos fueron muy similares, se tomó la menorconcentración (4,0%) para un mejor apro-vechamiento del agar. El aspecto del agaren todas las concentraciones fue transpa-rente y sin precipitados, obteniéndose re-sultados igualmente satisfactorios. Pruebas microbiológicas No se observó crecimiento de S. epidermi-dis, E. coli y B. bronchiseptica en los me-dios que sólo contenían agar y a los cualesno se les adicionó ningún tipo de nutrientes.Esto demuestra que el agar-agar producidono contiene nutrientes que favorezcan elcrecimiento de las bacterias. Método ecométrico Los resultados obtenidos mediante elmétodo ecométrico permitieron evaluarlos medios elaborados con agar de G. cylin-drica y G. mammillaris y compararlos conlos medios preparados con agares comer-ciales. Los valores de ICA e ICR (valoresno mostrados) permitieron clasificar losmicroorganismos en productividad baja,media o alta (tabla 1).La tabla 2 muestra la proporción de mi-croorganismos con resultados de alta y me-diana productividad para los mediospreparados con agares de las dos especiesde algas G. cylindrica y G. mammillaris ylos controles comerciales (1 y 2). Estos re-sultados no evidenciaron diferenciasestadísticamente significativas (tabla 3).Con respecto a la comparación de la pro-porción de cepas recuperadas por el me-dio de G. cylindrica y con los controles 1y 2 (ICR =1), no se observó diferenciaestadísticamente significativa en amboscasos (p = 0,90) y (p = 0,69) respectivamen-te. En cuanto a la proporción de cepas re-cuperadas por el medio de G. mammillaris con respecto a los controles 1 y 2 (ICR =1)tampoco se observó diferencia significati-va (p= 0,99) y (p=0,32) respectivamente.Los resultados se muestran en la tabla 4. DISCUSIÓN La concentración óptima de agar-agar paralograr la gelificación de los medios de cul-tivo en este estudio fue alta (4%) compara-da con la concentración de los agarescomerciales 1,5%. A este respecto podemosdecir que es influenciada por el método de
