Fluorescencja Krwi Po Wzbudzeniu Porfirynowego Pasma Soreta

Transcript

Fluorescencja krwi po wzbudzeniu porfirynowego pasma Soreta Blood Fluorescence after Exitation at Phorfirins Soret Band Grzegorz Głaczyński Instytut Fizyki Uniwersytetu Jagiellońskiego ul. Reymonta 4, 30-059 Kraków, Polska Podziękowania Pragnę serdecznie podziękować Panu Prof. Dr Hab. Wojciechowi Gawlikowi za poświęcony czas, zaangaŜowanie oraz moŜliwość prowadzenia badań w tak interesującym obszarze nauki, jakim jest fotomedycyna. Panu Dr Krzysztofowi DzierŜędze za Ŝyczliwą pomoc oraz wszystkim, którzy przyczynili się do powstania niniejszej pracy. Grzegorz Głaczyński 2 Spis treści: 1. Wstęp........................................................................................................................6 1.1. Motywacje.........................................................................................................7 1.2. Cele ...................................................................................................................7 1.3. Problematyka wstępna ......................................................................................7 2. Zastosowanie światła w biologii i medycynie........................................................8 2.1. Fototerapia.........................................................................................................8 2.2. Przykłady wykorzystania światła w medycynie ...............................................9 2.3. Terapia fotodynamiczna..................................................................................11 2.4. Diagnostyka fotodynamiczna..........................................................................12 2.5. Fotochemiczne podstawy PDD i PDT ............................................................13 2.5.1. Absorpcja ................................................................................................14 Transmitancja......................................................................................................14 Absorbancja.........................................................................................................14 2.5.2. Fluorescencja...........................................................................................15 Wydajność kwantowa .........................................................................................16 Wygaszanie fluorescencji................................................................................16 2.5.3. Przejścia bezpromieniste.........................................................................17 2.5.4. Fosforescencja.........................................................................................18 2.5.5. Wysokoreaktywne związki tlenowe........................................................19 II typ fotoreakcji..................................................................................................20 I typ fotoreakcji ...................................................................................................21 Tlen singletowy...................................................................................................23 Wydajność kwantowa tlenu singletowego ......................................................24 3. Fotouczulacze.........................................................................................................25 3.1. Porfiryny i ich pochodne.................................................................................25 3.2. Porfiryny .........................................................................................................25 3.2.1. Porfiryny występujące w przyrodzie.......................................................26 3.2.2. Porfiryny otrzymywane syntetycznie......................................................27 HpD .....................................................................................................................28 Photofrin II® ........................................................................................................28 3.2.3. Kwas aminolewulinowy 5-ALA .............................................................29 3.3. Pasma absorpcyjne porfiryn ............................................................................30 3.3.1. Pasmo Soreta...........................................................................................31 3.3.2. Pasmo Q ..................................................................................................31 3.4. Cechy fotouczulaczy .......................................................................................32 3.5. Zastosowanie...................................................................................................33 3.5.1. Dawki ......................................................................................................33 3.5.2. Efekty uboczne i przeciwwskazania .......................................................35 3.5.3. Efektywność PDT i PDD ........................................................................35 3.6. Krew................................................................................................................36 3.6.1. Budowa ...................................................................................................36 3.6.2. Znaczenie i funkcja krwi .........................................................................37 3.6.3. Hemoglobina ...........................................................................................38 Hematoporfiryna .................................................................................................39 3.6.4. Absorpcja i fluorescencja krwi................................................................39 4. Źródła światła ........................................................................................................43 3 4.1. Znaczenie światła ............................................................................................43 4.2. LED – diody elektroluminescencyjne.............................................................44 4.2.1. Półprzewodniki .......................................................................................45 4.2.2. Złącze pn .................................................................................................45 4.2.3. Charakterystyka.......................................................................................46 4.2.4. Właściwości ............................................................................................47 4.3. Diody laserowe................................................................................................48 4.3.1. Charakterystyka.......................................................................................48 4.5. Porównanie LED z diodami laserowymi ........................................................49 4.6. Diody elektroluminescencyjne 405 nm...........................................................50 4.6.1. Widmo diody...........................................................................................50 4.6.2. Moc diody ...............................................................................................52 4.6.3. Jednorodność natęŜenia...........................................................................53 4.7. Urologia – PDD...............................................................................................59 4.8. Diody LED 740 nm .........................................................................................60 5. Aparatura i pomiar fluorescencji krwi ...............................................................62 5.1. Widmo hemoglobiny – spektrometr SM520-USB..........................................62 5.2. Aparatura pomiarowa......................................................................................64 5.2.1. Kamera CCD...........................................................................................66 5.2.2. Dane otrzymywane ze spektrometru .......................................................66 5.3. Kalibracja układu pomiarowego .....................................................................67 5.3.1. Kalibracja I – długości fali......................................................................68 5.3.2. Kalibracja czułości kamery CCD............................................................71 5.3.3. MONOSpectrometr - program do analizy danych ..................................75 5.4. Fluorescencja krwi ..........................................................................................76 5.4.1. Wpływ rozcieńczalnika na widmo fluorescencji ....................................78 Woda destylowana ..............................................................................................78 Krew grupy 0 Rh(-):........................................................................................78 Krew grupy 0 Rh(+):.......................................................................................79 Sól fizjologiczna..................................................................................................80 Krew grupy 0 Rh(-):........................................................................................80 Krew grupy 0 Rh(+):.......................................................................................81 PołoŜenie pików ..................................................................................................81 Amplitudy pików ................................................................................................86 5.4.2. Wzbudzenie laserem o długości fali 415 nm ..........................................90 6. Podsumowanie .......................................................................................................93 6.2. Wyniki i wnioski .............................................................................................93 6.3. Ulepszenie aparatury.......................................................................................94 6.4. Dalsze plany ....................................................................................................94 Literatura: ........................................................................................................................96 4 ABSTRAKT: Niniejsza praca szczegółowo omawia procesy fizyko-chemiczne problematyki związanej z diagnostyką fotodynamiczną (PDD) oraz terapią fotodynamiczną (PDT). Zaznaczono w niej waŜną rolę fotouczulaczy. Przedstawiono uogólnioną budowę i charakterystykę barwników fotouczulających a takŜe powiązanie z krwią, której podstawowym składnikiem jest hem. Proces fluorescencji zaprezentowano zarówno od strony teoretycznej jak i praktycznej. Przedstawiono widma fluorescencji krwi. Przeanalizowano zastosowania światła z zakresu widzialnego. Uwagę skupiono na diodach elektroluminescencyjnych, które stosowano przy oświetlaniu krwi. Przedstawiono równieŜ inne moŜliwości zastosowania diod LED do celów diagnostycznych i terapeutycznych. ABSTRACT: Physical and chemical processes involved in Photodynamic Diagnosis and Photynamic Theraphy have been described in details. Role of photosensitizers has been pointed out. General structure and characterization of dyes and their connection with blood have been presented in this work. Fluorescence was theoretically described and observed fluorescence spectras of human blood were shown. Various visible light sources from visible range and their possible applications in PDD and PDT were analyzed. This work was focused on electroluminescence light – emitting diodes (LEDs), which were used for blood excitation. Other possible use of LED’s as a light sources in PDD and PDT had been discussed. 5 1. Wstęp Obszar światła widzialnego był od zawsze szczególnie bliski człowiekowi. Badania nad jego wpływem na organizmy Ŝywe prowadzone są od ponad stu lat. Analizuje się interakcje promieniowania z materiałem biologicznym i substancjami fotouczulającymi. Poszukiwania coraz lepszych fotouczulaczy wciąŜ trwają, a ich zastosowanie, szczególnie w onkologii, moŜe zaowocować skuteczniejszą walką z chorobami nowotworowymi. Światło widzialne nie penetruje jednak tkanek głęboko, dlatego badania są skoncentrowane przede wszystkim na leczeniu i badaniu ich powierzchniowych obszarów. Diagnostyka fotodynamiczna (PDD) pozwala natomiast na obserwacje zmian w tkankach oraz związkach, które samoistnie są barwnikami i wykazują fluorescencję. Równocześnie daje moŜliwość badania niektórych biomolekuł, czy wręcz duŜych obszarów po wcześniejszym podaniu fotouczulacza. Coraz powszechniejsze w medycynie jest zastosowanie laserów oraz róŜnego rodzaju lamp oświetlających często wykorzystujących filtry spektralne. W niniejszej pracy zwrócono uwagę na oświetlacze a takŜe zaproponowano inny ich rodzaj – jeszcze mało popularne diody elektroluminescencyjne (LED). Cechują się one stosunkowo dobrą monochromatycznością a jednocześnie niską ceną. Zastosowanie takich źródeł światła pozwoliłoby na szersze rozpowszechnienie diagnostyki i terapii fotodynamicznej oraz dalszy rozwój tej dziedziny. Stosowane w medycynie związki fotoczułe, dalej zwane barwnikami, są głównie pochodnymi porfiryny. Idea ich zastosowania związana jest z badaniami nad zaburzonym metabolizmem hemu, mogącym prowadzić do porfirii, choroby zwanej inaczej „wampiryzmem” [1]. Dolegliwość ta polega na nadwraŜliwości chorych na światło. Hem – elementarna część krwi jest głównym przedmiotem zainteresowania w niniejszej pracy. W wyniku oświetlenia odpowiednim światłem obserwuje się fluorescencję, która moŜe pozwolić na zauwaŜenie zmian międzyosobniczych, róŜnic pomiędzy wieloma grupami krwi, a takŜe być moŜe pozwoli na wczesne diagnozowanie róŜnych chorób. Krew przepływając przez cały organizm, jednocześnie ma kontakt z obszarami patologicznymi, jeśli takowe występują. Wiedza, którą być moŜe uda się zdobyć dzięki tym badaniom, pozwoliłaby na łatwą diagnostykę chorób. 6 1.1. Motywacje Wykorzystanie wiedzy otrzymanej z analizowanych widm fluorescencyjnych krwi do celów diagnostycznych moŜe zaowocować szybką techniką wykrywania zmian. Natomiast zastosowanie tanich oświetlaczy zbudowanych z diod LED pozwoliłoby na rozpowszechnienie tej metody. Coraz liczniej występujące zmiany nowotworowe mogłyby być wykrywane wcześniej i dzięki temu skuteczniej leczone. 1.2. Cele Problematyka związana z diagnostyką fotodynamiczną jest bardzo interesująca. Badania w tym kierunku powinny być nieustannie rozwijane, a wiedza rozpowszechniana. Praca badawcza, która zaowocowała niniejszą pracą, wiązała się nie tylko z pomiarem widm fluorescencji czy budowaniem układów optycznych, oświetlaczy i ich charakterystyką ale teŜ próbami rozpowszechniania tej dziedziny w coraz szerszych kręgach akademickich i nawiązywania współpracy i proponowania ewentualnego zastosowania odpowiednich źródeł światła. 1.3. Problematyka wstępna Krew, przedmiot zainteresowania w niniejszej pracy, składa się między innymi z hematoporfiryny będącej naturalnym barwnikiem występującym w obrębie ludzkiego organizmu. Cyrkuluje ona w ciele i dociera do wszystkich jego obszarów, równieŜ patologicznych. Kontakt z chorymi miejscami moŜe wpływać na zmiany fluorescencji krwi co było celem badań. Obserwacja fluorescencji wymaga układu zbudowanego ze źródła światła dopasowanego do pasm absorpcyjnych hemu. Tanim oświetlaczem jest dioda elektroluminescencyjna. W tej pracy scharakteryzowano i opisano świecenie tego obiektu. Kolejnym elementem jest spektrometr, który musi być wyposaŜony w wystarczająco czuły detektor by móc rejestrować słabe widmo wyświetlane z krwi. 7 2. Zastosowanie światła w biologii i medycynie 2.1. Fototerapia KaŜdy spotkał się z określeniem „depresja zimowa”, która jest znana w literaturze medycznej jako SAD (seasonal affective disorder) . Jest to zaburzenie, będące formą depresji, najczęściej związane z niedostatkiem światła słonecznego. Procesy fizjologiczne odpowiedzialne za ten stan nie są obecnie znane. Podejrzewa się działanie melaniny, która prawdopodobnie wpływa na tzw. „zegar biologiczny” organizmu ludzkiego. W okresie krótszego dnia powstaje zwiększona ilość melatoniny, co prawdopodobnie jest odpowiedzialne za te stany depresyjne. Czasami wspomina się o „odwróconym” SAD, który występuje w okresie letnim, dlatego SAD leczy się niczym innym jak światłem. Naświetla się pacjenta przez okres ok. 30 minut światłem 50 krotnie mocniejszym, aniŜeli stosowanym do oświetlania pomieszczeń [2]. Znaczenie promieni słonecznych doceniane jest juŜ od czasów staroŜytnych. Egipcjanie [3], nie bez powodów, czcili boga słońca – Ra, staroŜytni Grecy doceniali biologiczną aktywność promieniowania słonecznego, rozumieli zarówno terapeutyczne jak i szkodliwe jego działanie [4,5]. Im równieŜ zawdzięczamy określenie helioterapia, czyli medyczne określenie światłolecznictwa - metody leczenia wykorzystującej naświetlanie organizmu pacjenta światłem naturalnym. Czasy nowoŜytne, a w szczególności koniec XIX wieku, to okres, w którym rozpoczęto badania nad wpływem światła na tkanki biologiczne, jak i zastosowaniem fotouczulaczy. W tym czasie wiedziano, Ŝe światło z zakresu ultrafioletu ma właściwości bakteriobójcze, udowodniono równieŜ, Ŝe ten obszar światła odpowiedzialny jest za oparzenia oraz opaleniznę. Niels Ryberg Finsen z doskonałym rezultatem leczył gruźlicę skórną wykorzystując lampę łukową (tzw. lampa Finsena). XIX wiek przynosi juŜ pierwsze wzmianki o negatywnych interakcjach niektórych podawanych pacjentom leków i roślin a światłem. W tym okresie Baumstark opisywał negatywny wpływ światła na osoby chore na porfirię. Jean Prime opisuje wpływ światła na osoby, którym podawano leki utworzone na bazie substancji fotouczulającej – eozyny. 8 W 1900 roku Oscar Raab badał zachowanie drobnoustrojów pod wpływem akrydyny jak i jej pochodnych przy naświetlaniu światłem słonecznym. Zaobserwował, Ŝe badane pantofelki (Paramecium) giną, w przeciwieństwie do grupy kontrolnej, na której nie stosował tego fotosensybilizatora. Badanie, po przeprowadzeniu setek eksperymentów, doprowadziły go do wniosku, Ŝe na śmierć osobników bardziej wpływała dawka światła aniŜeli stęŜenie fotouczulacza. Niespełna dwa lata później, w 1902 r. zauwaŜono, Ŝe w reakcjach fototoksycznych niezbędna jest obecność tlenu. W 1911 r. zauwaŜono fotodynamiczne działanie hematoporfiryny. Natomiast w 1924 roku badania Polikarda wniosły waŜną informację. ZauwaŜył on, Ŝe zmiany nowotworowe w postaci guzów, po oświetleniu lampą Wooda (emitującą promieniowanie nadfioletowe), charakteryzują się silniejszą czerwoną fluorescencją aniŜeli pozostałe obszary. Kolejne lata badań przyniosły nowe odkrycia. W obszarach patologicznych zauwaŜono większą ilość endogennych porfiryn, które wykazywały fotouczulenie na światło z zakresu UV. Następowały pierwsze próby wykorzystania kumulacji endogennych porfiryn w obszarach nowotworowych do celów diagnostycznych. Aczkolwiek dopiero szersze wykorzystanie laserów i badania nad pochodnymi hematoporfiryny (HpD - Hematoporphirin Derivatives) szerzej otwarło drogę rozwoju fototerapii. Właściwości lecznicze światła znane są od setek lat, ale obecny rozwój technologiczny pozwala na szczegółowe badanie mechanizmów i procesów mających wpływ na tkankę biologiczną pod wpływem kwantów światła. Poszukuje się równieŜ optymalnych rozwiązań, by uzyskać najbardziej poŜądane efekty leczenia i diagnostyki przy uŜyciu światła. 2.2. Przykłady wykorzystania światła w medycynie Terapia, jak i diagnostyka fotomedyczna nie są jedynymi moŜliwościami oddziaływania kwantów promieniowania świetlnego z obiektami biologicznymi. W zaleŜności od stosowanych gęstości mocy uzyskuje się róŜne efekty oddziaływań światła laserowego z biomateriałami: fotochemiczne, fototermiczne, fotojonizacyjne, fotodysocjacyjne (polegające na rozerwaniu biostymulacyjne (rys. 2.1.) [4,6,7] . 9 wiązań chemicznych) czy Rys. 2. 1. Wpływ gęstości mocy i szerokości impulsu na ludzką tkankę [4,6]. Coraz powszechniejsze w medycynie jest zastosowanie laserów. Wśród wielu dziedzin najczęściej stosuje się światło (bez wykorzystania fotouczulaczy) w: 2. Chirurgia, wykorzystującej głównie efekty termiczne. Zastosowanie lasera w tej dziedzinie ma szereg zalet. Jest bezkontaktowe (nie wymaga kontaktu z ciałem pacjenta), co wpływa na sterylność zabiegu. Wiązką światła moŜna precyzyjnie manipulować selektywnie niszcząc obszary wymagające leczenia. Przykłady: ° chirurgia refrakcyjna – operacje okulistyczne: modelowanie soczewki, zbiegi na dnie oka, usuwanie jaskry ° stomatologia – chirurgia tkanek miękkich i twardych jamy ustnej ° usuwanie tkanek prostaty ° ginekologia – sterylizacja ° onkologia – usuwanie zmian nowotworowych ° laryngologia – wycinanie migdałków 3. Światło lasera jest równieŜ wykorzystywane w dermatologii i kosmetyce. Najczęstsze zastosowania to: ° usuwanie przebarwień skórnych, blizn, tatuaŜy ° usuwanie owłosienia – poprzez niszczenie cebulek włosa ° „zgrzewanie” skóry – spajanie tkanek bez uŜycia szwów ° leczenie trądziku ° ablacja kosmetyczna – usuwanie zmarszczek 10 4. Właściwości koagulacyjne światła znalazły zastosowanie pulmonologiczne – do leczenia guzów tarczycy, i podobnie jak w laryngologii, zmian naczyniowych: naczyniaków, krwiaków, miejsc krwawienia. 5. Fotomedyczne właściwości światła ultrafioletowego wykorzystywane są w terapii Ŝółtaczki u noworodków, czy np. terapii łuszczycy. ° Ŝółtaczka występująca wśród noworodków wynika z nadmiaru bilirubiny w organizmie pacjenta. Promieniowanie z zakresu 425-475 nm jest absorbowane, a pochłonięta energia ma wpływ na rozerwanie wiązań wodorowych w bilirubinie, co prowadzi do prawidłowego usuwania jej z ciała pacjenta. ° terapia leczenia łuszczycy, podobnie jak terapia fotodynamiczna, wymaga substancji endogennej, którą aktywuje się światłem. Metoda znana jest od długiego czasu. W pierwotnej formie stosowano promieniowanie UV i smołę, którą obecnie zastępuje się 8-methoxypsoralenem. Współczesna literatura mówi równieŜ o efektach biostymulacyjnych światła przy niskich gęstościach mocy (LLLT – low level laser therapy). Mechanizmy tego procesu są wciąŜ słabo poznana, a efekty prezentowane w publikacjach poddawane wątpliwościom [6,7,8]. 2.3. Terapia fotodynamiczna Terapia fotodynamiczna PDT (photodynamic therapy) jest to metoda leczenia za pomocą podawanych egzogennych fotouczulaczy i naświetlaniu światłem o określonej długości fali, dostosowanym do pasm absorpcyjnych danego fotosensybilizatora. W wyniku złoŜonych procesów fizyko-chemicznych w tkankach, którym został podany zewnętrznie fotouczulacz po naświetleniu a zarazem zaabsorbowaniu odpowiedniej energii przenoszonej przez kwant światła, następuje destrukcja komórek. Pozwala to na selektywne niszczenie zmian patologicznych. Jest to tzw. reakcja fotocytotoksyczna [9]. Fotouczulacze, czyli pochodne związków porfirynowych, dobiera się tak, aby gromadziły się w obszarach chorych, minimalizując w ten sposób ryzyko zniszczenia obszarów zdrowych. 11 Największym obszarem zainteresowania cieszy się moŜliwość wykorzystania PDT do leczenia zmian nowotworowych. Aktualne badania w tej dziedzinie koncentrują się na znajdowaniu coraz bardziej selektywnie działających barwników (fotouczulaczy), które nie będą powodowały szkody dla całego organizmu. Wykorzystanie PDT do leczenia zmian nowotworowych pozwala na skuteczne niszczenie obszarów patologicznych, gdyŜ właśnie tam występuje największe stęŜenie fotosensybilizatora, przy jednoczesnym pozostawieniu nienaruszonymi zdrowych miejsc. Ograniczeniem jest moŜliwość naświetlania. Zmiany skórne w sposób łatwy moŜna oświetlić. Problem pojawia się w momencie naświetlania wewnątrz organizmu. W niektórych wypadkach moŜna stosować światłowody np. podczas zabiegów przy uŜyciu endoskopów, czy naświetlać podczas operacji na „odsłoniętych” organach. JednakŜe sporym problemem jest fakt wynikający z charakteru stosowanego światła – penetruje tkanki na głębokości rzędu kilku milimetrów [4,6,7,9,10,11]. 2.4. Diagnostyka fotodynamiczna Diagnostyka fotodynamiczna PDD (photodynamic diagnostyka fluorescencji FD (fluorescence diagnosis) [5] diagnosis) oraz polega na określaniu i obserwowaniu obszarów patologicznych – najczęściej zmian nowotworowych. Podobnie jak PDT polega na podaniu fotouczulacza, który selektywnie trafia do obszarów chorych i tam się kumuluje. Następnie oświetlając odpowiednim światłem, dostrojonym do pasma absorpcji fotouczulacza, emitowany jest kwant światła o innej długości fali. Fluorescencja ta pozwala na wyznaczenie obszarów zmienionych chorobowo i jednocześnie pozwala na znajdowanie zarówno duŜych obszarów patologicznych, jak i mikrorozsiewów, które często są niewidoczne przy świetle dziennym. Dzięki PDD moŜna określić sposób leczenia, moŜe być to PDT albo inny sposób usunięcia zmian nowotworowych np. chirurgiczny. WaŜnym aspektem, poprawiającym czułość detekcji, jest inna długość fali fluorescencji uczulacza od długości fali światła wzbudzającego. 12 2.5. Fotochemiczne podstawy PDD i PDT Najłatwiejszym sposobem opisu zjawisk towarzyszącym zarówno terapii jak i diagnostyki fotodynamicznej jest opis z wykorzystaniem diagramu Jabłońskiego (rys. 2.2.). Rys. 2. 2. Diagram Jabłońskiego. Oznaczenia na rysunku: S0, S1, S2 – stany singletowe; T1 – stan tripletowy; vr – bezpromieniste przejście; ic – konwersja wewnętrzna, isc – przejście interkombinacyjne; qu – przejścia związane ze stratą energii wskutek zderzeń; nr – relaksacja bezpromienista; FLUOR – fluorescencja, PHOS – fosforescencja [5,12,15]. Po naświetleniu fotouczulacza odpowiednią energią, następuje przechwycenie przez substancje fotoczułą kwantu światła. Cząsteczka przechodzi z podstawowego stanu singletowego (S0) do wzbudzonego stanu singletowego (Sn). W przypadku organicznych cząsteczek aromatycznych, czyli równieŜ fotouczulaczy, będących najczęściej pochodnymi porfiryny, energia przejścia do wysokoenergetycznego stanu singletowego (Sn) odpowiada długościom fali mniejszym aniŜeli 300 nm. Przejście ze stanu S0 do podstawowego wzbudzonego stanu singletowego odpowiada zakresowi 300 – 800 nm. Jak widać, obszar wykorzystywany w fototerapii jest obszarem światła widzialnego, w takich przypadkach najwygodniej jest wyraŜać energię za pomocą długości fali wyraŜonej w nm [4,9,12]. Energia zaabsorbowanych fotonów jest odwrotnie proporcjonalna do długości fali λ: E= hc λ , gdzie: stała Plancka wynosi h=6,625*10-36 [Js] oraz prędkość światła w próŜni c=3*108 [m/s] 13 2.5.1. Absorpcja Absorpcja światła w fotouczulaczu jest związana z przejściem elektronu ze stanu podstawowego (S0) do stanu wzbudzonego (Sn). Fotosensybilizatory mają szerokie pasmo absorpcji wynikające z silnego rozszerzenia oscylacyjnego elektronów. Energia wymagana do absorpcji, czyli wzbudzenia cząsteczki wynosi ∆Ε: ∆E = E (S n ) − E (S0 ) . Efektywność absorpcji jest ściśle związana z dopasowaniem energii padającej a pasmami absorpcji fotouczulacza. Im lepsze dopasowanie tym większa wydajność zachodzącego procesu. Najlepsze efekty uzyskuje się przy stosowaniu (quasi) monochromatycznego światła [5]. Transmitancja W najprostszych przypadkach, kiedy tylko część natęŜenia światła padającego (I0) zostaje pochłonięta, a część światła przechodzi dalej, mówimy o transmitancji (lub współczynniku transmisji – T). MoŜe ona przyjmować wartości od 0 do 1. Transmitancja określa się wyraŜeniem [10,13]: T= I . I0 Absorbancja Charakteryzując światło pochłonięte wprowadza się wielkość absorbancji (A). W prosty sposób jest powiązana z transmitancją [10,13]: 1 A = log   . T  14 2.5.2. Fluorescencja Fluorescencję moŜna opisać za pomocą poniŜszych wzorów: S0 + hν → S1 S1 → S0 + hν , gdzie S0,1 oznaczają odpowiednio stan podstawowy i pierwszy wzbudzony stan singletowy, hν energię pochłoniętą i wyemitowaną. Wzbudzone stany singletowe (Sn) są krótkoŜyciowe i po ok. 10-15 s przechodzą do najniŜszego wzbudzonego stanu singletowego (S1) a stamtąd (ze stałą czasową ~ 10-8 – 10-10 s) do stanu podstawowego. Takim przejściom moŜe towarzyszyć fluorescencja, czyli emisja kwantów o określonej energii, lub bez promieniowania – wskutek wewnętrznej konwersji. Zjawisko fluorescencji jest waŜne z punktu widzenia diagnostyki fotodynamicznej. Emisja światła w obszarach zawierających wzbudzany fotouczulacz pozwala na dobre zlokalizowanie i określenie słabo widocznych gołym okiem obszarów zaatakowanych przez chorobę nowotworową. Rys. 2. 3. Zwierciadlane odbicie emisji względem absorpcji oraz reguła Franka Condona [5,12-14]. Wiele fotouczulaczy wykazuje symetrie odbicia lustrzanego widma absorpcji względem fluorescencji (po lewej). Reguła Franka Condona (po prawej) mówi, Ŝe przejścia związane ze zmianą stanu elektronu cząsteczki są „pionowe”, tzn. pojawiają się bez zmian geometrycznych w atomie. Długość fali wyemitowanego światła jest dłuŜsza od długości fali zaabsorbowanej. Jest to tzw. przesunięcie stokesowskie. Ze względu na róŜnice w długościach fali łatwiej moŜna zauwaŜyć obszary fotouczulone, wykazujące fluorescencję [4,9,10,13,15]. 15 Wydajność kwantowa Wydajność kwantowa – jest to prawdopodobieństwo wystąpienia danego procesu w stosunku do prawdopodobieństw wszystkich procesów zachodzących w danym procesie. W najprostszym przypadku jest to stosunek energii kwantów powstałych w wyniku fluorescencji do całkowitej energii podanej na układ. Przejście fotouczulacza ze stanu wzbudzonego niekoniecznie musi być związane z emisją kwantu światła w wyniku fluorescencji. Wydajność kwantowa przejścia promienistego zaleŜy od kilku procesów: o szybkości ffluor – przejścia promienistego S1
S0 o konwersji wewnętrznej (internal conversion – ic) S1
S0 o przejścia interkombinacyjnego (intersystem crossing – isc) S1
T1 stała kinematyczna dla obu powyŜszych procesów równa jest ficisc Wydajność kwantowa fluorescencji (Qfluor) wynosi: Q fluor = f fluor f fluor + f icisc . Czas Ŝycia (τ) stanu wzbudzonego moŜna określić przez: τ= 1 . f fluor + f icisc Wygaszanie fluorescencji W przypadku zderzeń atomów fotouczulacza z inną cząsteczką, zwaną wygaszaczem, naleŜy dodatkowo uwzględnić we wzorze na wydajność kwantową stałą szybkości gaszenia (fq) oraz stęŜenie wygaszacza (q). Wzór na kwantową wydajność fluorescencji przyjmie wówczas następującą postać: Q fluor = f fluor f fluor + f icisc + f q q 16 . Proces gaszenia fluorescencji prowadzi do zmniejszenia wydajności kwantowej a jednocześnie skraca czas Ŝycia cząsteczki w stanie wzbudzonym. W obecności wygaszacza wzór na czas Ŝycia wyraŜa się przez: τ= f fluor 1 . + f icisc + f q q Gaszenie fluorescencji moŜe wynikać z dwóch procesów: o zderzeń cząsteczki fotouczulacza z cząstkami wygaszaczy (tzw. dynamiczne gaszenie) o gaszenia statycznego wynikającego z zachodzących reakcji pomiędzy fotouczulaczem i cząsteczkami wygaszacza prowadzących do utworzenia róŜnych kompleksów [5,13,16,17] Zjawisko wygaszania często występuje w roztworach w wyniku działania rozpuszczalnika na fluoryzującą cząsteczką. 2.5.3. Przejścia bezpromieniste Bezpromieniste przejścia pomiędzy wzbudzonym a podstawowym stanem singletowym powodują zamianę pochłoniętej energii na ciepło. Proces ten jest nieistotny zarówno dla PDD jak i PDT. Cząsteczka fototuczulacza moŜe równieŜ tracić swoją energię wskutek konwersji wewnętrznej wynikającej ze zderzeń z innym cząstkami. Działanie na cząsteczki promieniowaniem elektromagnetycznym z zakresu podczerwieni moŜe wpływać na ich ruch rotacyjny. Rys. 2. 4. Przykłady zmian rotacji cząsteczek. Natomiast bezpromieniste przejścia ze wzbudzonego stanu singletowego do wzbudzonego stanu tripletowego (T1) o niŜszej energii, mają istotne znaczenie dla terapii fotodynamicznej. Czas Ŝycia wzbudzonego stanu tripletowego jest znacznie dłuŜszy aniŜeli czas Ŝycia stanu singletowego i jest rzędu 10-6 s. Przejściom tym 17 towarzyszy zmiana spinu elektronów. Kolejnym etapem transferu energii moŜe być fosforescencja, lub istotniejszy dla PDT przekaz energii do sąsiadujących w pobliŜu cząsteczek. Energia ze stanu tripletowego jest przekazywana innym cząsteczkom co z kolei prowadzi do uszkodzenia otoczenia na skutek róŜnych procesów fizykochemicznych opisanych w dalszej części [10]. 2.5.4. Fosforescencja Fosforescencję schematycznie moŜna przedstawić za pomocą poniŜszego równania: isc S0 + hν → S1 → T1 → S 0 + hν PHOS . Rys. 2. 5. Przekaz energii – fosforescencja. Rys. 2. 6. Bezpromieniste przejście pomiędzy stanami singletowymi i trypletowymi (po lewej). Przesunięcie widma fosforescencji w kierunku większych długości fali względem absorpcji i fluorescencji (niŜsze energie). Cząsteczka przebywa w stanie trypletowym dłuŜej niŜ we wzbudzonym stanie singletowym – łatwiej traci energię przechodząc bezpromieniście do stanu podstawowego na skutek zderzeń z innymi molekułami. Przejścia o róŜnej multipletowości (interkombinacyjne) czyli T1
S0 są formalnie zabronione, dlatego są mniej prawdopodobne, czyli charakteryzują się małą wydajnością kwantową (prawdopodobieństwem 18 zajścia tego procesu). Prawdopodobieństwo jest nieco wyŜsze, gdy róŜnice energetyczne pomiędzy tymi stanami są niewielkie lub gdy stany nakładają się. Proces ten znany jest jako fosforescencja – jest to jeden z rodzajów luminescencji. Obsadzenie poziomu tripletowego bezpośrednio ze stanu podstawowego jest bardzo trudne, więc cząsteczka najczęściej zostaje wzbudzona do pierwszego stanu singletowego S1 i z niego przechodzi do stanu tripletowego. Z tego faktu wynika przesunięcie widma fosforescencji w kierunku fal dłuŜszych względem widma absorpcji i widma fluorescencji tej samej cząsteczki. Ze względu na małą wydajność kwantową, widma fosforescencji są trudne do rejestracji i nie wykorzystuje się ich do diagnostyki fotodynamicznej [4,9,13,17]. 2.5.5. Wysokoreaktywne związki tlenowe W terapii fotodynamicznej najwaŜniejszy jest przekaz energii ze wzbudzonych stanów singletowych do stanu tripletowego. Fosforescencja w tym wypadku odgrywa marginalne znaczenie. Przejście interkombinacyjne, czyli przejście pomiędzy stanem singletowym (S1) a stanem tripletowym (T1), moŜe prowadzić do transferu energii z fotouczulacza do znajdujących się w otoczeniu cząstek. W zaleŜności od ich typu mówimy o I lub II typie fotoreakcji, prowadzących do utworzenia wysokoreaktywnych związków tlenowych. Rys. 2. 7. Schemat reakcji odpowiedzialnych za procesy cytotoksyczne – I oraz II typ fotoreakcji. 19 O typie reakcji decyduje głównie środowisko fotouczulacza, oraz stęŜenie tlenu. Istotne jest równieŜ stęŜenie fotosensybilizatora. Utlenianie tkanek biologicznych wynika głównie z procesów związanych z tlenem molekularnym i jest najistotniejsze w procesie PDT. Według badań, obszary, w których natlenienie jest mniejsze niŜ 50% źle odpowiadają na PDT. Fotoreakcja II typu występuje przy duŜym stęŜeniu tlenu, ale moŜe mu towarzyszyć w mniejszym stopniu fotoreakcja typu I. Ten z kolei przewaŜa w momencie, gdy tlenu brakuje, dlatego często podczas terapii fotodynamicznej stosuje się krótki czas naświetlania i powtarza się go co kilkanaście godzin. Cząsteczki tlenu w tym okresie zostaną uzupełnione. Po wymianie energii fotouczulacza z sąsiedztwem, powraca on do swego stanu początkowego, czyli jest względnie reaktywny. Proces ten jednak nie zachodzi w sposób idealny. Działanie światła przyczynia się do fotodegradacji fotouczulacza (photobleaching) [4,9,18]. II typ fotoreakcji W środowisku utlenionym cząsteczki fotouczulacza, znajdujące się w stanie tripletowym, najczęściej przekazują energię do sąsiadujących cząsteczek tlenu. Stanem podstawowym tlenu jest stan tripletowy, więc transfer energii nie jest zabroniony a multipletowość jest zachowana [15]. Proces oksydacji komórek związany jest głównie z niskimi, metastabilnymi wzbudzonymi stanami singletowymi. Molekuła tlenu w takim stanie charakteryzuje się długim czasem Ŝycia, co wpływa na tendencję do reagowania z innymi cząstkami i utleniania tkanek biologicznych. Tlen cząsteczkowy posiada nisko leŜące singletowe stany wzbudzone. Przejście ze stanu podstawowego do stanu wzbudzonego wymaga jedynie 22,5 kcal/mol (λ=1274 nm – bliska podczerwień). Ze względu na małą energię potrzebną do wzbudzenia, reakcja ta w środowisku bogatym w tlen jest uprzywilejowana. W terapii fotodynamicznej największy wpływ niszczący (cytotoksyczny) na komórki ma tlen we wzbudzonym stanie singletowym 1O2. Wydajność cytotoksyczna fotoreakcji I typu jest ściśle powiązana ze stęŜeniem tlenu w obszarze naświetlanym. 20 Rys. 2. 8. Schemat procesów zachodzących w II typie fotoreakcji. Cząsteczka fotouczulacza (FS – fotosensybilizator) pochłania kwant energii ( hν ) i przechodzi do stanu wzbudzonego ( 3 FS * ). hν + 1FS → 3 FS * W I typie fotoreakcji energia zostaje przekazana do tlenu singletowego, 3 FS * + 3O2 → 1FS + 1O2 który oddziałuje z substratem organicznym (SUB) i powoduje przejście fotouczulacza do formy podstawowej. O2 + SUB → FS (0) 1 Wzbudzony tlen singletowy jest formą bardzo reaktywną. Jego obecność prowadzi do mechanizmów utleniających, co z kolei prowadzi do obumierania komórek. Cząsteczki fotouczulacza, które przekazały w ten sposób energię, przechodzą do stanu podstawowego, mogą ponownie pochłaniać energię i przekazywać ją dalej wg. wyŜej opisanego schematu. Oprócz tlenu singletowego (znajdującego się w podstawowym stanie tripletowym), w obrębie środowiska fotosensybilizatora mogą znajdować się inne cząsteczki, dla których stanem podstawowym jest równieŜ stan tripletowy. Do najczęściej występujących związków występujących w podstawowym stanie tripletowym (poza O2) moŜna zaliczyć tlenek azotu oraz witaminę A [4,9]. I typ fotoreakcji Mechanizm ten ma miejsce, gdy środowisko fotouczulacza jest ubogie w tlen lub gdy jego stęŜenie gwałtownie spadło w wyniku fotoreakcji II typu. W reakcji następuje transfer elektronu lub wodoru z fotosensybilizatora do elementów tkanki. 21 Powstają rodniki nadtlenkowe ( O2• oraz HO2• ), przyczyniające się do mechanizmów oksydacyjnych biomolekuł, a w następstwie ich obumarcie. Rys. 2. 9. Schemat procesów zachodzących w I typie fotoreakcji. Cząsteczka fotouczulacza (FS – fotosensybilizator) pochłania kwant energii ( hν ) i przechodzi do stanu wzbudzonego ( 3 FS * ), co prowadzi do kolejnych procesów. hν + 1FS → 3 FS * Wymiana elektronu z substratem ( czyli tkanką, oznaczoną jako SUB) produkuje utleniony substrat. 3 FS * + SUB → FS − + SUB + Zredukowana o elektron molekuła fotouczulacza (FS-) reaguje z tlenem powodując powstanie anionu nadtlenkowego O2-. Ten z kolei moŜe wytworzyć rodniki hydroksylowe (OH*). FS − + O2 → FS + O2− Barwnik znajdujący się w stanie zbudzonym moŜe równieŜ reagować z rodnikami nadtlenowymi O2*, generując aniony nadtlenkowe, a z nich z kolei moŜe powstać rodnik hydroksylowy. 3 FS + + O2* → FS + + O2− W procesie fotoreakcji I typu zostaje zniszczony substrat organiczny w wyniku fotoutleniania. Proces fotoreakcji II typu ma jednakŜe większe znaczenie dla terapii fotodynamicznej i planuje się ją tak, by obszar naświetlany był dobrze zaopatrzony w tlen co daje lepsze efekty leczenia [4,6,9,18]. 22 Tlen singletowy Tlen singletowy, czyli bez niesparowanych elektronów, nie jest formą podstawową, a wzbudzoną. Tlen singletowy jest bardzo reaktywny i silnie reaguje z otoczeniem. Forma singletowa oznaczana jest jako 1O2 , O :: O lub O = O . Natomiast tripletowa przedstawiana jako 3O2 , • O • •O • lub • O − O • , gdzie kropka oznacza elektron, kreska - dwa elektrony tworzące wiązanie. Opisanie własności tlenu molekularnego wymaga zastosowania teorii kwantowej. Konfiguracja tlenu atomowego to: OY (1s )89 (2s )89 (2 p x )8 (2 p y )8 (2 pz )89 , z czego wynika następujące obsadzenie orbitali tlenu w stanie podstawowym: O2Y (1σ g ) 2 (1σ u ) 2 (2σ g ) 2 (2σ u ) 2 (3σ g )2 (1π u ) 4 (1π g )2 . Właściwości tlenu wynikają z obsadzenia sześciu elektronów na orbitalach π . Konfiguracja elektronowa stanu o najniŜszej energii to: O2Y * (π x )89 (π y )89(π *x )8 (π *y )8 . Stan ten określany jest jako 3 Σ g G . Zgodnie z regułą Hunda, niesparowane elektrony występują na dwóch antywiąŜących orbitalach i odpowiadają za właściwości paramagnetyczne. Degeneracja orbitali, jednakowe spiny oraz liczby kwantowe elektronów, powodują, Ŝe zgodnie z zasadą Pauliego muszą one zajmować osobne orbitale. Po oddziaływaniu wzbudzonego fotouczulacza z O2, spin jednego elektronu ulega odwróceniu, jednocześnie zmienia się jego liczba spinowa, co prowadzi do generacji pary elektronowej na jednym orbitalu. Energia, która zostaje zaabsorbowana powoduje destabilizację tlenu 1O2. Tlen singletowy 1O2 występuje jako spolaryzowany dwubiegunowy jon. Krótki czas Ŝycia tlenu singletowego, powoduje, Ŝe uszkodzenia w procesie utleniania z 1O2 występują jedynie w obszarze o grubości błony komórkowej ok. 0,02 µm. MoŜna przyjąć, Ŝe jest to jedynie obszar, w którym znajduje się cząsteczka fotosensybilizatora. 23 Rys. 2. 10. Schemat obsadzeń elektronów w stanie podstawowym (1) oraz wzbudzonym (2 i 3). W stanie podstawowym dwa sparowane elektrony znajdują się na π g a w stanie wzbudzonym oznaczane przez 1 ∆ g . Tlen ( 1 ∆ +g ) charakteryzuje się niŜszą energią. Do wzbudzenia tlenu do tego stanu wymagana jest niewielka energia wynosząca 22,5 kcal/mol (0,98 eV). Stan o większej energii to 1 Σ +g . W tym stanie występują dwa sparowane elektrony na dwóch róŜnych orbitalach π g . Energia potrzebna do tego wzbudzenia wynosi 37,5 kcal/mol (1,63 eV). Stan o wyŜszej energii ( 1 Σ +g ) szybko przechodzi do stanu 1 ∆ +g [9,13,15-17]. Wydajność kwantowa tlenu singletowego Wydajność kwantowa singletowego tlenu (Q∆) jest waŜną własnością kaŜdego fotouczulacza stosowanego w PDT. Wielkość ta zaleŜy od liczby molekuł 1 O2 wytwarzanych przez kaŜdy foton zaabsorbowany przez cząstkę fotouczulacza [13,15]. Q∆ = Qisc f isc S ∆ , gdzie: o Qisc – wydajność kwantowa procesu przejścia interkombinacyjnego o fisc – frakcja „uwięzionych” przez tlen singletowy stanów tripletowych o S∆ – prawdopodobieństwo transferu energii z tripletowego stanu tlenu molekularnego Wszystkie pomiary Q∆ mówią o jakości fotoreakcji II typu [13,15]. 24 3. Fotouczulacze W diagnostyce i terapii fotodynamicznej najistotniejszą rolę odgrywają fotouczulacze aktywowane światłem o charakterystycznej długości fali. Pozwalają na rozpoznawanie i niszczenie zmian nowotworowych, czy innych obszarów chorobowych. 3.1. Porfiryny i ich pochodne Fotouczulacze uŜywane w diagnostyce i terapii fotodynamicznej to najczęściej porfiryny, chloryny i bakteriochloryny oraz ich pochodne. Związki te cechują się płaskimi cząstkami aromatycznymi i szkieletową budową, opartą na czterech symetrycznie ułoŜonych pierścieniach pirolowych, połączonych naprzemiennie pojedynczymi i podwójnymi wiązaniami pomiędzy atomami węgla [1,4,9,19]. Rys. 3. 1. Chemiczne struktury (od lewej): porfiryny, chloryny, bakteriochloryny [9] Posiadają odpowiednio 22, 20 i 18 elektronów π, odpowiadających za sprzęŜanie pierścieni aromatycznych. Coraz szersze są badania nad wykorzystaniem ftalocyjaniny i teksapiryny. W teksapirynie występują trzy pierścienie pirolowe, natomiast pierścienie pirolowe we ftalocyjaninie są połączone mostkami azotowymi. 3.2. Porfiryny Nazwa porfiryn pochodzi z greki: „ π o ρϕνρ oσ ”, co oznacza szkarłatne, purpurowe. Charakteryzują się unikatowymi właściwościami optycznymi – są silnie 25 zabarwione – absorbują promieniowanie EM z zakresu widzialnego. Są waŜnym elementem organizmów Ŝywych [1,3,19]. Rys. 3. 2. Trójwymiarowy schemat porfiryny. Cząsteczki porfiryn są płaskie, a ich budowa opiera się na pierścieniach atomowych zawierających cztery atomu azotu (N). Porfiryny są makrocyklicznymi związkami, które zawierają jedynie wiązanie o hybrydyzacji sp2. Mogą tworzyć kompleksy z jonami metali, umiejscowionymi w środku struktury cząsteczki. Jony metali przejmują od atomów azotu pirolu pary elektronów [3,19]. W organizmie pirol powstaje z dwóch cząsteczek kwasu δ-aminolewulinowego (patrz. rozdz. 3.1.4.). Rys. 3. 3. Porfiryna: (od lewej) uproszczony wzór Fishera, asymetryczny typ III oraz struktura chemiczna pirolu – elementarnej części związków z grupy porfirynoidów [19]. Wszystkie porfiryny zbudowane są z układu zwanego porfiną, która nie występuje w przyrodzie w stanie wolnym, z róŜnymi podstawnikami bocznymi. Wszystkie istotne w biologii porfiryny mają asymetrycznie rozmieszczone podstawniki boczne typu III. Takie porfiryny nazywa się protoporfirynami IX [19]. 3.2.1. Porfiryny występujące w przyrodzie Porfiryny występują w organizmach Ŝywych, moŜna je równieŜ otrzymywać sztucznie. Porfiryny mają zdolność do kompleksowego wiązania metali, co warunkuje ich charakterystyczne właściwości [1]. Znalazło to odniesienie w nazewnictwie i z tego 26 powodu mówi się o nich jako metaloporfirynach [20]. Do najpopularniejszych substancji wykazujących szkieletową budowę porfiryn moŜna zaliczyć witaminę B12, chlorofil, urynoporfiryny, koproporfiryny i hem [3,19]. Rys. 3. 4. Wzory strukturalne: uroporfiryny III, koproporfiryny III oraz hemu (protoprfiryny III) [wg. 3]. Przyłączenie Ŝelaza lub magnezu warunkuje przekształcenie porfiryny odpowiednio do hemu lub chloryny do chlorofilu [19]. Bakteriochlorofil posiada w swej strukturze posiada równieŜ magnez. W cząsteczce witaminy B12 występuje jon kobaltu [1,20]. Chlorofil, który występuje we wszystkich roślinach zielonych zawiera w swej strukturze jon magnezu. Jego obecność pozwala na absorpcję promieniowania elektromagnetycznego z zakresu widzialnego a za razem reakcję fotosyntezy. Pochłonięcie fotonów jest ściśle powiązane z obecnością w podwójnych wiązaniach elektronów π [3]. Obecny rozwój technologiczny pozwala równieŜ na sztuczne otrzymywanie tych związków. 3.2.2. Porfiryny otrzymywane syntetycznie Porfiryny moŜna równieŜ syntetyzować w laboratoriach, uzyskując ich coraz to lepsze właściwości optymalne do PDT i PDD. Substancje takie najczęściej nie występują naturalnie w przyrodzie. Obecnie otrzymuje się wiele ich odmian opierając się na pochodnych najprostszych porfiryn [3]. W zaleŜności od rodzaju syntezy podstawniki boczne mogą być jednakowe lub róŜne. Podstawowy szkielet porfiryn syntetyzuje się w kilku etapach w reakcjach pomiędzy aldehydami, pirolami lub analogicznymi prekursorami w środowisku kwasowym i pod wpływem procesów oksydacji. Pierwszą zsyntetyzowaną porfiryną 27 była tetrafenyloporfiryna (TPP). Otrzymał ją w 1936 roku przez Rothmund. Od tamtego czasu otrzymuje się coraz to nowsze i o lepsze substancje fotoczułe. HpD Praktycznie wszystkie fotouczulacze stosowane do tej pory bazują na budowie porfiryn, chlorin, bakteriochloryn i ftalocyjanin. Pierwszym klinicznie zastosowanym fotouczulaczem w terapii fotodynamicznej była pochodna hematoporfiryny (HpD) opisana przez zespół Lipson’a w 1961 roku. WciąŜ stosuje się rozpuszczaną w wodzie pochodną hematoporfiryny (HpD). Jej oczyszczona forma została skomercjalizowana i sprzedawana jest pod nazwą „Photofrin II®” [3]. Badania nad właściwościami HpD określiły cechy, które idealny fotouczulacz powinien spełniać. Udowodniono, Ŝe większa masa odpowiada za lepszą lokalizację w komórkach nowotworowych, ale jednocześnie wiąŜe się to ze spadkiem wydajności kwantowej tlenu singletowego [8,21]. Photofrin II® Photofrin II® – fotouczulacz wytwarzany przez firmę QLT jako pierwszy [9,8] uzyskał atest FDA i jest szeroko stosowany na świecie w terapii jak i diagnostyce fotodynamicznej na świecie. Photofrin II® jest pochodną HpD Skutecznie stosuje się go przy wielu typach nowotworów, jednakŜe nie przy wszystkich z takim samym efektem. Charakteryzuje się długofalowym pasmem absorpcji przy czerwonym świetle o długości fali λmax ~ 630 nm. Stosowane promieniowanie w tym obszarze pozwala na fotouczulenie do głębokości ok. 5 mm. Ogranicza to zastosowanie tylko do leczenia nowotworów osadzonych blisko powierzchni. Liczne badania przeprowadzane na tym związku wykazały, Ŝe nie wywołuje on zmian mutagennych i nie jest toksyczny. MoŜna go stosować wielokrotnie, gdyŜ nie ulega odporności wielolekowej. Optymalne warunki do leczenia następują po 48 godzinach – wtedy następuje największa kumulacja w nowotworze. Photofrin II® pozostaje w skórze pacjenta przez 4 do 8 tygodni, co powoduje jego nadwraŜliwość na światło w tym okresie [4,17,22]. 28 Rys. 3. 5. Wzór strukturalny Photofrin II® [wg. 8]. 3.2.3. Kwas aminolewulinowy 5-ALA Kwas aminolewulinowy (oznaczany jako ALA, lub 5-ALA) ma szczególne znaczenie w syntezie porfiryn. Jego właściwości do endogennej syntezy protoporfiryny wykorzystano na początku lat 90-tych [23]. Jest prekursorem w powstawaniu hemu – występującego u wszystkich ssaków. Podanie kwasu delta aminolewulinowego prowadzi do selektywnej akumulacji protoporfiryny IX (Pp IX). Jest ona równieŜ niezbędna w procesie powstawania hemu. Schemat przedstawiono na rys. 3.6. Kwas ALA powoduje nadmierne powstawanie Pp IX. Fakt ten jest wykorzystywany w diagnostyce i terapii fotodynamicznej. Właściwości fotouczulające ALA wykorzystywane są równieŜ w walce z chwastami i owadami. Zasada działania we wszystkich tych przykładach jest analogiczna – powstające porfiryny są czułe na światło. Naświetlanie odpowiednim światłem, dopasowanym do pasm absorpcji, pozwala na detekcję (przy uŜyciu niebieskiego światła) lub niszczenie obszarów o zwiększonym stęŜeniu Pp IX (czerwony obszar widma) (rys.3.7.) [21,24,25]. Rys. 3. 6. Schemat przedstawiający proces powstawania hemu. Po lewej widoczna jest cząsteczka ALA. Podanie kwasu aminolewulinowego powoduje akumulacje Pp IX, co prowadzi do nadwraŜliwości na światło [wg. 25]. 29 Komórki nowotworowe zachowują się nieco odmiennie aniŜeli zdrowe. Charakteryzują się inną aktywności enzymów związanych z syntezą Pp IX i hemu. W komórkach nowotworowych obniŜona jest aktywność ferrochelatazy. Związane jest to z większą kumulacją ALA i powstawaniem większej ilości Pp IX [25]. Zastosowanie ALA w onkologii jest dość duŜe – poświadcza to fakt, iŜ dostępny jest gotowy lek oparty na tym kwasie – „Levulan®” [26]. Jest to naturalnie występujący kwas w organizmie, przez co nie powoduje dodatkowych szkód. Diagnostyka fotodynamiczna, która jest stosowana z wykorzystaniem ALA jest powszechna w neurochirurgii czy urologii. Chirurgiczne usuwanie obszarów przy białym świetle często prowadzi do usunięcia jedynie wyraźnie widocznego ogniska nowotworu, gdzie występują miejsca martwicze. Zastosowanie światła niebieskiego pozwala na uwidocznienie obszarów, gdzie pozornie nie występuje nowotwór. Usunięcie takich miejsc pozwala na zatrzymanie rozwoju nowotworu i pozwala na uniknięcie nawrotów choroby. Kwas aminolewulinowy idealnie nadaje się do takich celów, aczkolwiek charakteryzuje się szybkim wybielaniem fluorescencji [25,26]. Ten niepoŜądany efekt moŜna zniwelować poprzez stosowanie zamiennie światła niebieskiego (oznaczenie zmian) oraz światła białego pozbawionego niebieskiej części widma (usunięcie zmian). Wybielanie fluorescencji i jej wpływ na fototerapię jednakŜe nie jest w pełni zrozumiany [26]. Przydatne okazuje się równieŜ filtrowanie obserwowanej fluorescencji. „Wycina” się obszar światła, którym wzbudzana jest protoporfiryna IX a obserwuje się jedynie obszar świecący w innych długościach fali [25]. Zastosowanie fotouczulacza pozwala na obserwacje jam ciała, w których występują problemy z diagnozowaniem nowotworów. Fototerapia z wykorzystaniem ALA znajduje zastosowanie w walce z nowotworami płuc, mózgu, Ŝołądka i pęcherza moczowego [23]. 3.3. Pasma absorpcyjne porfiryn Porfiryny, chloryny oraz bakteriochloryny mają odpowiednio 22, 20 i 18 elektronów π, odpowiadających za sprzęŜanie pierścieni aromatycznych. ZłoŜony układ wiązań sprzęŜonych powoduje, Ŝe związki te dobrze absorbują światło z zakresu widzialnego. 30 Związki z grupy porfirynoidów cechują się dwoma silnymi pasmami absorpcji: o pasmem Soreta o pasmem Q 3.3.1. Pasmo Soreta Wszystkie związki z grupy porfiryn, niezaleŜnie od posiadanych podstawników bocznych wykazują silną absorpcję w obszarze ~ 390 – 425 nm, zwanym pasmem Soreta [20,25]. Obszar ten jest uŜywany jedynie dla celów diagnostycznych (PDD), co wynika z charakteru tego światła. Promieniowanie o długości fali λ ~ 400 nm bardzo słabo penetruje tkanki. Czasami zakres UV-Vis stosuje się do leczenia płaskich zmian w śluzówce. Rys. 3. 7. Schemat przedstawiający widmo absorpcyjne Protoporfiryny IX [wg. 25]. Większość roztworów porfiryn i ich pochodnych po naświetleniu światłem nadfioletowym wykazują fluorescencje, o zwiększonej względem oświetlanej długości fali (przesunięcie Stokesa). Wyświecają w czerwonym obszarze światła widzialnego. Silna fluorescencja pojawia się nawet w przypadku śladowych ilości tych cząsteczek. Zjawisko to wykorzystuje się np. w wykrywaniu porfirii – obserwuje się świecenie uroporfiryn i koproporfiryn – metabolitantów pośrednich syntezy hemu [3,9,19,20,25]. 3.3.2. Pasmo Q W terapii fotodynamicznej wykorzystuje się obszar wykazujący głębsze wnikanie w tkanki. Jest to obszar λ 600 – 800 nm, zwany pasmem Q. Pasma 31 absorpcyjne barwników stosowanych w PDT rozszczepione są na 3 – 4 składowe, słabiej absorbujące niŜ pasmo Soreta. Najsilniejsze pasmo absorpcji dla porfiryn przypada na λ ~ 630 nm, chloryn λ ~ 650 nm a bakteriochloryny λ ~ 710 nm. Pochodne porfiryny znajdują zastosowanie w PDT, gdyŜ cechują się maksimum absorpcji w obszarze światła o barwie czerwonej, są cząsteczkami występującymi w przyrodzie. Niektóre są produkowane w organizmie człowieka. Wszystkie są małotoksyczne dla ludzi. Posiadają duŜą wydajność kwantową produkcji tlenu singletowego (Q∆) [3,9,19-21,25]. 3.4. Cechy fotouczulaczy Wczesne badania nad HpD doprowadziły do ogólnych wniosków dotyczących właściwości fotouczulaczy i wytycznych, do których naleŜy się stosować podczas ich produkcji. Obecnie znanych i stosowanych jest wiele substancji fotouczulających. Zanim zostaną dopuszczone do uŜytku, muszą spełniać warunki, które są sprawdzane w testach klinicznych: o selektywność kumulacji w tkankach chorych o aktywność od 70 do 150 godzin po podaniu pacjentowi o stosunkowo szybka usuwalność z organizmu (po ok. 150 godzinach) o absorpcja w obszarze widma EM dobrze penetrującym tkanki (kilka – kilkanaście mm), a jednocześnie nienakładającym się na pasma absorpcji naturalnie występujących w organizmie barwników czułych na światło (tj. hemoglobina, melanina czy nawet woda) o duŜa wydajność kwantowa produkcji tlenu singletowego – głównego czynnika cytotoksycznego o brak toksyczności dla organizmu pacjenta Spełnienie wszystkich powyŜszych warunków jest niezwykle trudne. Związane jest to z róŜną budową patologicznych tkanek i róŜnym ich oddziaływaniu z cząstkami fotosensybilizatora. Najczęściej prowadzone badania, związane z fotouczulaczami, wykonuje się przy uŜyciu mikroskopii fluorescencyjnej. 32 Analizuje się jednoskładnikowe, luminescencyjne fotouczulacze. Okazuje się, Ŝe cząsteczki fotouczulacza są przyłączane do jąder komórkowych, mitochondriów, lizosomów oraz membran plazmatycznych w komórkach nowotworowych, co daje moŜliwości stosowania w onkologii [3,4,7-9,10,21]. 3.5. Zastosowanie Wykazano, Ŝe terapia fotodynamiczna niszczy komórki rakowe, co wynika z selektywnej kumulacji stosowanego fotouczulacza. Podczas takiej terapii powstają równieŜ liczne skrzepy w naczyniach krwionośnych, co powoduje odcięcie dopływu tlenu i substancji odŜywczych do komórek nowotworowych [9]. Zastosowanie światłowodów i przyrządów endoskopowych pozwala na rozszerzenie PDT i PDD do badania i leczenia jam ciała. Obecnie występują coraz bardziej wyspecjalizowane i specjalnie przystosowane do tych celów sondy medyczne. Pozwalają na wykorzystanie fotosensybilizatorów przykładowo w: urologii, proktologii, czy teŜ otolaryngologii [27]. fotouczulacze Prekursory Egzogenne Tab. 1. Najczęściej stosowane fotouczulacze oraz zastosowanie (n= nowotwór) [5,8]. Fotouczulacz Główny składnik Photofrin® HpD Zastosowanie o n. płuc o n. pęcherza o n. przełyku Visudyne® BPDMA o zmiany naczyniowe Foscan® m-THPC o n. jamy ustnej Levulan® 5-ALA Metvix® m-ALA o zmiany skórne o n. pęcherza o choroba Bowena 3.5.1. Dawki W zaleŜności od obszarów leczonych i charakteru fotouczulacza wybiera się odpowiedni sposób podawania. Dostarcza się go w formie pastylek, maści czy 33 roztworów dostarczanych doŜylnie, czy śródtkankowo. NajwaŜniejsze w całym procesie jest dobranie stęŜenia barwnika oraz odczekania pewnej ilości czasu, aby nastąpiła jego selektywna kumulacja [8,9]. W zaleŜności od rodzaju fotouczulacza czas akumulacji w tkance wynosi od 30 min (BPD-MA) do 96 godzin (m-THPC) [4]. Przykładowo Photofrin II® podaje się w dawce 2 mg/kg ciała pacjenta, podczas gdy inny barwnik (meta-tetrahydroksyfenylochloryna „Foscan®”) wymaga duŜo mniejszego stęŜenia (0,1mg/kg) by uzyskać identyczny efekt terapeutyczny. Jak juŜ wcześniej wspomniano, penetracja ciała wynika z podawanych energii (długości fali). Teksapiryna lutetu („Lutex®”) stosowana do leczenia czerniaków, wykazuje największa absorpcję na długości fali λ ~ 730 nm co pozwala na wnikanie głębiej w tkanki [28]. W leczeniu onkologicznym podawane są duŜe dawki, małe w stanach zapalnych. Skuteczność działania zaleŜy od wydajności kwantowej tlenu. Do niszczenia tkanek wykorzystuje się światło o mocy 100 – 150 J/cm2 przy 100 – 200 mW/cm2 i duŜym stęŜeniu fotouczulacza. Stany zapalne leczy się oświetlając 10 J/cm2 przy 40 mW/cm2 i małym stęŜeniu fotouczulacza. Kwas aminolewulinowy (ALA) podaje się zazwyczaj na dwa sposoby: 60mg/kg doustnie lub 30mg/kg doŜylnie. Od czasu podania fotosensybilizatora do momentu badania/leczenia zazwyczaj oczekuje się mniej niŜ 6 godzin. Leczenie glejaków przy podaniu tego fotouczulacza i częstego naświetlania pozwala na usunięcie zmian nowotworowych do 1,4 cm w głąb tkanki [23,25]. Rys. 3. 8. Etapy terapii fotodynamicznej [5]. 34 3.5.2. Efekty uboczne i przeciwwskazania Po podaniu substancji fotouczulającej skóra jest nadwraŜliwa na światło. Pacjent po PDD czy PDT przez pewien okres czasu musi unikać nadmiernego kontaktu z promieniowaniem słonecznym. Przykładowo dla Photofrin II® ochrona skóry i oczu musi trwać od 4 do 8 tygodni, pulytin, czyli etiopuryna cyny – 7 dni. Efekty uboczne poza oczywistym fotouczuleniem są nieznaczne [25]. Przyjmowanie Photofrin II® powoduje podobne, rzadko występujące dolegliwości, jak i w przypadku stosowania jakiegokolwiek środka farmakologicznego np. bóle głowy czy nudności [29-31]. 3.5.3. Efektywność PDT i PDD Diagnostyka fotodynamiczna nie niszczy zmian nowotworowych, ale pozwala na lepsze odnalezienie ognisk jak i mikrorozsiewów nie widocznych gołym okiem [23,25]. Metoda ta pozwala na usunięcie obszarów chorych i zminimalizowanie nawrotów, dzięki usunięciu obszarów, w którym proces nowotworowy dopiero się rozwija. Metoda ta niejednokrotnie potrafi być czulsza aniŜeli inne metody badania duŜych powierzchni i wykrywa nawet wczesne zmiany patologiczne [23,32]. Co więcej pozwala na weryfikację – czy obszary wyglądające podejrzanie „na oko” faktycznie zawierają tkankę nowotworową [23]. Po PDD moŜna kierować na dalsze etapy leczenia. Tab. 2. Efekty PDT [3,4,9] pierwotne (komórkowe) o uszkodzenie błon komórkowych wtórne (naczyniowe) o zakrzepica naczyń w obszarach nowotworowych o uwolnienie enzymów o zwęŜenie naczyń tętniczek lizosomalnych o uszkodzenia lizosomalne zdrowych tkanek o uszkodzenie organelli o obrzęk tkanek komórkowych o uszkodzenia mitochondrialne o liza wewnątrzkomórkowa 35 Terapia fotodynamiczna przynosi zadawalające efekty w wielu dziedzinach. Najczęściej pozwala na wydłuŜenie Ŝycia pacjenta. Stosuje się ją równieŜ w cięŜkich do wyleczenia przypadkach jako środek uśmierzający ból (niszczenie obszarów chorych, bez całkowitej moŜliwości usunięcia tkanek zmienionych chorobowo). Najczęściej podawane w literaturze dane mówią o dwukrotnym przedłuŜonym czasie Ŝycia pacjentów [23,25]. MoŜliwe jest równieŜ całkowite wyleczenie, ale co waŜniejsze leczenie powierzchownych zmian w jamach ciała nie wymaga zabiegów na otwartym ciele pacjenta, co pozwala na uniknięcie komplikacji z tym procesem związanych [23]. W tabeli.2. podano najwaŜniejsze procesy PDT odpowiedzialne za niszczenie tkanek nowotworowych. 3.6. Krew Krew jest to złoŜony układ róŜnych komórek. Obiega cały ustrój organizmu docierając do wszystkich narządów ciała, równieŜ miejsc chorych (jeśli występują). Takie oddziaływanie moŜe mieć wpływ na jej zmianę w budowie czy właściwościach. Krew nie jest fotouczulaczem, ale niektóre jej składniki są barwnikami i cechują się silnymi pasmami absorpcyjnymi. Pierwsze z badań nad fotouczulaczami opierały się właśnie na jej podstawowym składniku (hem – występujący w erytrocytach). 3.6.1. Budowa Krew to wysoko wyspecjalizowana tkanka łączna, obiegająca cały organizm. Występuje w stanie płynnym i u dorosłego człowieka zajmuje 5 – 5,5 l. 55 – 60 % objętości stanowi płynne osocze o Ŝółtawym zabarwieniu (wynikający z obecności bilirubiny – powstałej z rozpadu hemu), resztę stanowią elementy morfotyczne: o czerwone krwinki (erytrocyty) o białe krwinki (leukocyty) o płytki krwi (trombocyty) [33] 36 Czerwone krwinki (RBC – red blood cells) dostarczają tlen do komórek i odprowadzają dwutlenek węgla. Erytrocyty dzięki obecności hemu są silnie zabarwione na czerwono, są pozbawione jądra, i mają charakterystyczny dwuwklęsły kształt. Erytrocyty Ŝyją do 120 dni, po czym są zastępowane nowo powstałymi krwinkami. Białe krwinki odpowiedzialne są za system immunologiczny organizmu. Natomiast trombocyty, będące fragmentami komórek odgrywają waŜną rolę w procesach krzepnięcia krwi. WaŜnym elementem są zestawy antygenów występujących na powierzchni krwi. Odpowiedzialne są one za odpowiedz układu odpornościowego. Najczęściej się mówi o nich jako o grupach krwi. Najistotniejsze dla medycyny są grupy: o AB 0 o Rh - antygeny C, c, D, E, e o Kell - antygen K [33] Rys. 3. 9. Zdjęcie czerwonych krwinek krwi wykonanych na AFM, po prawej widoczna wizualizacja 3D [34]. 3.6.2. Znaczenie i funkcja krwi Krew krąŜy po całym organizmie, dociera do wszystkich elementów ciała, pełniąc następujące funkcje: o wymiana gazów – dostarcza tlen, odprowadza dwutlenek węgla o dostarczanie substancji odŜywczych, witamin o transport hormonów 37 o przenoszenie substancji zbędnych lub szkodliwych do narządów wydalniczych o regulacja temperatury ciała o wyrównanie ciśnienia o warunkowanie stałego pH w organizmie o spełnianie funkcji immunologicznych 3.6.3. Hemoglobina Niektóre funkcjonalnie aktywne białka mają budowę opartą o porfiryny z kompleksowym wiązaniem z metalem [1]. Tak jest w przypadku niezbędnej do Ŝycia hemoglobiny znajdującej się w erytrocytach. Jest to białko nie będące enzymem. Przenosi tlen, nie katalizując Ŝadnej reakcji chemicznej. Pomimo tego faktu, zbudowana jest podobnie jak enzymy. Jest to tzw. „honorowy enzym” [13]. Rys. 3. 10. Schemat przedstawiający transport tlenu przez erytrocyty. Hemoglobina jest tetramerem złoŜonym z podjednostek α i β. KaŜda podjednostka zawiera hem, będący grupą aktywną. Atom Ŝelaza Fe (II) znajdujący się w hematoporfirynie wiąŜe w sposób odwracalny tlen bez zmiany wartościowości. Cztery podjednostki hemu są ułoŜone symetrycznie tworząc sferyczną cząstkę o niewielkich wymiarach. Budowa taka pozwala na gęste „upakowanie” hemoglobiny w erytrocytach. StęŜenie hemoglobiny w czerwonych krwinkach wynosi około 30% i pozwala na wychwycenie wystarczającej ilości tlenu dla potrzeb tkanek. 38 Hematoporfiryna śelazoprotoporfiryna inaczej określana jako hematoporfiryna czy krócej hem, to podstawowy budulec wszystkich hemoprotein w obrębie organizmu (hemoglobina, mioglobina, cytochromy, katalaza, peroksydaza). Budowa białka jest podobna, róŜnice występują w obrębie łańcucha polipeptydowego lub wartościowości jonu Ŝelaza. Hem jest to niebiałkowa część hemoglobiny zawierająca w swym centrum Ŝelazo [1]. Podstawową strukturą jest szkielet porfirynowy, utworzony z czterech pierścieni pirolowych. Ustawienia podstawników bocznych mogą być róŜne, ale tylko jeden z izomerów jest określany jako Protoporfiryna IX – obecna w Ŝywych organizmach. Funkcje biologiczne hemu wiąŜą się ściśle z obecnością Ŝelaza [3]. śelazo Fe2+ występuje w hemoglobinie (Hb), oksyhemoglobinie (HbO2), mioglobinie i oksymioglobinie. Jon Ŝelazowy Fe3+ moŜna spotkać w methemoglobinie, katalazie i peroksydazie. śelazo zmieniające swą wartościowość pomiędzy Fe2+ a Fe3+ występuje w cytochromach, co się wiąŜe z funkcją tego białka [1,19]. Hem jest związany z wieloma procesami komórkowymi takimi jak transport tlenu (hemoglobina), procesy oddechowe (oksydazy cytochromowe), homeostazę naczyniową, detoksyzację (cytochrom P450) i śmierć komórkową (cytochrom c). 3.6.4. Absorpcja i fluorescencja krwi Procesy absorpcyjne odgrywają istotną rolę w fotomedycynie. Najbardziej absorbujące molekuły w tkankach ssaków to oksy- oraz deoksy hemoglobina, melanina, mioglobina oraz woda. Na rys. 3.11. przedstawiono widmo absorpcyjne dla tych cząstek. W obrębie długości fali od 600 nm do 1000 nm widoczny jest wyraźny spadek absorpcji – jest to tzw. „okno terapeutyczne”. Wnikanie w głąb tkanki w tym obszarze jest duŜe [5]. 39 Rys. 3. 11. Absorbenty w tkankach biologicznych z zaznaczonym „oknem terapeutycznym” [wg. 35]. Prawie wszystkie wyŜej wymienione tkanki biologiczne wykazują fluorescencję, jeśli wzbudzi się je odpowiednim światłem dopasowanym do pasma absorpcyjnego, zazwyczaj z zakresu UV czy teŜ z zakresu światła widzialnego. Fluorescencja jest obserwowana w aminokwasach: fenyloalaninie, tyrozynie, tryptofanie, proteinach: kolagenie oraz elastynie, witaminach: B2 i B6 a takŜe porfirynach: hematoporfirynach (HpD) i protoporfirynach IX [5]. Rys. 3. 12. Widmo absorbcji i flurescencji PPIX [wg. 5]. Hematoporfiryna (HpD) ma maksimum absorpcji na długości 405 nm, a najintensywniejszy pik emisyjny obserwuje się na długości 610 nm [5]. NajwaŜniejszą porfiryną występującą u ssaków jest hem. Wszystkie porfiryny, których budowa jest oparta na kształcie cząsteczki hemu, cechują się maksimum absorpcyjnym 40 przy 400 nm i silną fluorescencją w okolicach 635 nm, zaleŜną od otoczenia cząsteczki i pH środowiska. Hem stanowi elementarną część hemoglobiny – charakteryzującą się fluorescencją. Białko to, będące barwnikiem zawierającym Ŝelazo w swej strukturze obecne jest we krwi. Cechuje się wysoką absorpcją w zakresie światła widzialnego. Jest to najsilniej absorbująca tkanka u człowieka, aczkolwiek jej stęŜenie jest róŜne w obrębie ciała i w niektórych rejonach jest bardzo małe [5,36]. Wiązanie tlenu przez hemoglobinę wiąŜe się ze zmianami strukturalnymi i kształtem cząsteczki, a jednocześnie wpływa na róŜnice w pasmach absorpcyjnych oksyhemoglobiny (HbO2) i deoksyhemoglobiny (Hb) [36]. Te róŜnice mogą być wykorzystywane przy badaniu nasycenia tlenem. Oksyhemoglobina wykazuje największą absorpcję przy 414 nm i słabszą przy 542 i 577 nm. W deoksyhemglobinie pasmo absorpcyjne jest przesunięte o około 30 nm i wynosi 433 nm oraz słabsze na 556 nm. Nie występuje drugi słaby pik jak w oksyhemoglobinie, natomiast pojawia się inny na długości 760 nm [5,36]. Rys. 3. 13. Widmo absorpcyjne oksy- i deoksy- hemoglobiny [wg. 37]. Zmianom nowotworowym często towarzyszą zmiany natury hematologicznej. Często występuje niedobór jednego lub kilku elementów morfotycznych krwi [38]. Okazuje się, iŜ szybki proces namnaŜania komórek nowotworowych wpływa na zmniejszenie się ilości tlenu w obszarach patologicznych a zarazem powstania środowiska kwasowego wskutek wytwarzania kwasu mlekowego. Komórki krwi obiegają cały ustrój organizmu, więc mają styczność z wszystkimi obszarami ciała, zarówno zdrowymi jak i chorymi. Aktualnie prowadzone badania 41 wskazują, iŜ moŜliwe jest badanie zmian nowotworowych na podstawie fluorescencji krwi pełnej jak i odpowiednio spreparowanej [32]. Często stosuje się preparatykę polegającą na maskowaniu jonów Ŝelaza z hemu poprzez działanie odpowiednimi substancjami (np. EDTA, aceton) [35,39]. Badania fluorescencji prowadzi się oświetlając próbki długościami fali z zakresu pasma Soreta, najczęściej są to długości 376 nm, 400, 405 nm , 417 nm, 457 nm [32,39,40]. Niektóre pomiary sugerują podobieństwo fluorescencji krwi z farmakologicznym środkiem Photofrin II® [32]. W niektórych pracach zwrócono uwagę na moŜliwość wpływu światła wzbudzającego na uwalnianie z erytrocytów PPIX, która (protoporfiryna IX) posiada najsilniejsze pasmo absorpcyjne w okolicach 405 nm [41]. 42 4. Źródła światła Właściwości lecznicze światła są znane od wieków. Początkowe metody fotomedycyny związane były wyłącznie ze światłem słonecznym, które w duŜym przybliŜeniu moŜna traktować jako ciało idealnie czarne. Wprowadzenie technik laserowych, światłowodów i generalnie sztucznie otrzymywanego światła pozwoliło na rozwój PDT i PDD. Lasery bardzo szybko znalazły zastosowanie w medycynie [6,7,26]. Rozpowszechnione szeroko są równieŜ lampy z filtrami wydzielającymi odpowiedni obszar spektralny [23,26]. 4.1. Znaczenie światła W terapii i diagnostyce fotodynamicznej stosuje się sztucznie wytworzone światło. Do oświetlania duŜych powierzchni stosuje się zazwyczaj niekoherentne źródła jak np. lampy z filtrami. W innych przypadkach wykorzystuje się światło spójne np. laserowe, które przy zastosowaniu światłowodu moŜna wprowadzić do jam ciała [4,26]. Celem niniejszej pracy jest zwrócenie uwagi na nieco mniej popularny rodzaj oświetlacza – diody LED. Są one łatwiej dostępne, producenci oferują szeroką gamę długości fali. Posiadają one quasi monochromatyczne widmo (ok. 25 nm, nawet 5-10 nm [26]), które moŜna wykorzystać w PDD czy PDT [10]. Światło, które uzyskuje się z diod LED niestety jest silnie rozbieŜne, co praktycznie uniemoŜliwia pracę z zastosowaniem światłowodów do leczenia wewnątrz jam ciała. Efekty, jakie uzyskuje się przy PDT i PDD ściśle zaleŜą od długości fali, która róŜnie penetruje tkankę (rys. 4.1.). Transmisja w UV wynosi ok. 2 mm, natomiast w obszarze bliskiej podczerwieni wzrasta do kilkunastu milimetrów [4,9]. Pomimo tak płytkiej penetracji terapia czy diagnostyka fotodynamiczna w niektórych wypadkach wydaje się być najkorzystniejsza dla pacjenta. Odsłonięte obszary nie stwarzają problemu, a inne moŜna oświetlić poprzez dostarczenie światła przez jamy ciała, czy nawet do wnętrza tkanki światłowodami w igle iniekcyjnej. Stosowanie światła z zakresu UV w szczególności poniŜej 390 nm nie jest zalecane ze względu na jego mutagenne właściwości [5]. 43 Kolejnym waŜnym problemem jest jednorodność podawanego światła. Tkanki naleŜy naświetlać równomiernie, aby uzyskany efekt był taki sam w całym leczonym obszarze. Rys. 4. 1. Głębokość penetracji tkanki w zaleŜności od długości fali λ. [wg. 4] (po lewej) oraz transmisja światła przez skórę, dla róŜnych długości fal. [wg. 42] (po prawej). Rys. 4. 2. Oddziaływanie światła z tkanką [wg. 4-6]. 4.2. LED – diody elektroluminescencyjne Diody elektroluminescencyjne (LED – eng. light-emitting diode) mogą być z łatwością wykorzystane w PDT jak i PDD (wykonanie takich diod nie jest skomplikowane, co przekłada się na ich stosunkowo niską cenę). Ponadto bardzo łatwo moŜne je obsługiwać co dodaje im jeszcze większego znaczenia. KaŜdy LED zbudowany jest z półprzewodnika, a od jego składu zaleŜy długość emitowanej fali. 44 4.2.1. Półprzewodniki Rozwiązując równanie Schrödingera z potencjałem periodycznym moŜna wytłumaczyć strukturę pasmową półprzewodników. W rozwiązaniu otrzymuje się funkcje Blocha. Rozwiązanie to prowadzi do takiej zaleŜności energii od wektora falowego, Ŝe moŜna wyróŜnić poziomy energetyczne w strukturze całego kryształu. Są to pasmo podstawowe (walencyjne), na którym znajdują się elektrony walencyjne pierwiastków budujących półprzewodnik. Następnie moŜna wyróŜnić pasmo zabronione – nie mogą w nim się znajdować elektrony, oraz pasmo przewodzenia w którym elektrony występują jako swobodne nośniki ładunku. 4.2.2. Złącze pn W przypadku złączenia dwóch półprzewodników róŜnego typu powstaje złącze pn. W takim złączu poziomy Fermiego wyrównują się, gdy na dane warstwy nie działa Ŝadne napięcie zewnętrzne. Przejście nośników prądu odbywa się na róŜnych poziomach energetycznych – wzdłuŜ linii poziomych. W przypadku róŜnych koncentracji elektronów, po obu stronach złącza na tym samym poziomie, popłynie prąd dyfuzyjny proporcjonalny do tej róŜnicy koncentracji. Po utworzeniu złącza z warstw P i N w pierwszej chwili następuje przepływ nadmiaru elektronów ze strefy N do P oraz nadmiaru dziur ze strefy P do N. Istnieją dwa sposoby polaryzacji złącza pn: w kierunku przewodzenia oraz w kierunku zaporowym. W pierwszym przypadku do półprzewodnika typu n podłącza się napięcie ujemne a do typu p napięcie dodatnie. Powoduje to zwęŜenie się bariery zaporowej co prowadzi do wzrostu prądu dyfuzyjnego, natomiast prąd unoszenia nośników mniejszościowych pozostanie bez zmian. Polaryzację w kierunku zaporowym uzyskuje się poprzez przyłoŜenie napięcia w odwrotny sposób do opisanego powyŜej. W takim przypadku warstwa zaporowa zostaje poszerzona i prąd dyfuzyjny nie płynie, natomiast prąd unoszenia jest znikomy [7,10]. 45 4.2.3. Charakterystyka Znając właściwości polaryzacyjne złącza pn, moŜna omówić budowę diod LED. Głównym jej elementem jest złącze pn wykonane z półprzewodnika spolaryzowane w kierunku przewodzenia. W wyniku rekombinacji elektronu z dziurą następuje emisja kwantu światła. Dobór odpowiednich materiałów półprzewodnika pozwala na uzyskiwanie róŜnych długości fali w praktycznie całym zakresie widma oraz zakresie podczerwieni. Rys. 4. 3. Zdjęcie diody – wyraźnie widoczny obszar aktywny LED. Wydajność diod elektroluminescencyjnych zwykle jest bardzo dobra i często jest zbliŜona do 100%. Nie wszystkie fotony wydostają się jednak na zewnątrz struktury półprzewodnika, dlatego mówimy o wydajności zewnętrznej, która wynika z konstrukcji LED. Straty wynikają z reabsorpcji (z której wynika powstanie nowej pary elektron – dziura) i odbicia na granicy ośrodków powietrze i półprzewodnik. Rys. 4. 4. Od lewej: budowa LED ze zminimalizowaną reabsorpcją; obudowa diody – minimalizacja strat wskutek odbicia Fresnela i całkowitego wewnętrzego odbicia [wg. 10]. Specjalna konstrukcja diody pozwala na zmniejszenie tych strat. Zmniejszając drogę fotonów minimalizuje się reabsorpcję. Dokonuje się tego poprzez zmniejszenie warstwy p, a z faktu, iŜ ruchliwość dziur jest mniejsza aniŜeli elektronów, generacja par elektron – dziura ma miejsce w obszarze typu p. Wiadomo, Ŝe tzw. straty fresnelowskie związane ze złym dopasowaniem współczynników załamania róŜnych materiałów 46 diody są duŜe. Spadek wydajności związany z odbiciem rozwiązany jest przez wykorzystanie dodatkowej warstwy plastyku w postaci kapsułki. Wprowadzony dodatkowy współczynnik załamania jest zbliŜony do współczynnika przewodników. Efekt związany z całkowitym wewnętrznym odbiciem jest korygowany poprzez kształt kopuły. Większość wyemitowanego światła pada pod kątem mniejszym niŜ kąt całkowitego wewnętrznego odbicia [7,10]. 4.2.4. Właściwości Diody LED są dobrym i przede wszystkim łatwo dostępnym źródłem promieniowania quasi monochromatycznego. Mają szerokie zastosowanie w wielu urządzeniach. Obecne moŜliwości pozwalają na tworzenie diod o wielu barwach, nawet i światła białego. Są małe, łatwe w uŜyciu, wytrzymałe na zmiany temperatury i czynniki zewnętrzne. Nie pochłaniają duŜej ilości prądu. Moce, które moŜna z nich uzyskać nie są być moŜe największe, aczkolwiek moŜna to kompensować poprzez zastosowanie ich większej liczby. Masowa produkcja LED wpływa na ich atrakcyjną cenę. Wadą jest niekoherencja ich światła, ale w PDT czy PDD nie odgrywa to znaczącej roli, tak długo jak nie wymagane jest stosowanie światłowodów. Prace nad nowymi materiałami do tworzenia diod pozwalają na uzyskanie coraz lepszej koherencji [7,10,26]. Rys. 4. 5. Schematyczne oznaczenie diody LED (po lewej) oraz zaleŜność mocy diody w funkcji prądu [wg. 10]. NajwaŜniejsze właściwości: o długi czas odpowiedzi o qasi monochromatyczność (~30 nm) o liniowa zaleŜność mocy od prądu o moŜliwość produkcji LED o róŜnych długościach fali (zakres widzialny + IR) 47 o atrakcyjna cena o brak spójności o łatwe w obsłudze o nie wymagają „duŜego” zasilania o odporne na zniszczenia o długi czas pracy o potrafią pracować przez wiele lat bez strat na jakości światła [7,10,26] 4.3. Diody laserowe Dioda laserowa w swej budowie przypomina heterozłączową diodę elektroluminescencyjną [10]. RóŜnica pomiędzy nimi wynika ze sposobu powstawania światła na złączu pn. LED wykorzystuje emisję spontaniczną, natomiast w dioda laserowych fotony powstają w skutek emisji wymuszonej. MoŜliwość wykorzystania takich diod jest nieco większa w PDT i PDD, aniŜeli LED. Światło, które emitują moŜna wprowadzić do światłowodu, a dzięki temu, Ŝe cechują się zazwyczaj większą mocą moŜna je wykorzystywać przy badaniu słabej fluorescencji. Wadą jest mniejszy zakres dostępnych długości fali niŜ dla LEDów. 4.3.1. Charakterystyka Inwersję obsadzeń w diodach laserowych uzyskuje się poprzez duŜą koncentrację elektronów i dziur w obszarze aktywnym. Takie rozwiązanie techniczne otrzymuje się poprzez zastosowanie półprzewodnika zdegenerowanego, w którym domieszkowanie jest bardzo wysokie. Przy zastosowaniu duŜego prądu występuje nadmiar nośników większościowych w obszarze aktywnym – występuje inwersja obsadzeń, czyli moŜliwość akcji laserowej. Praca diody laserowej jest ściśle związana z przyłoŜonym prądem: o małe prądy – mała inwersja obsadzeń – szerokopasmowa emisja spontaniczna o prąd graniczny – inwersja obsadzeń większa, dominuje emisja wymuszona o duŜe prądy – właściwa praca lasera – generacja światła o szerokości linii nie większej niŜ 3 - 5 nm 48 Rys. 4. 6. Dioda krawędziowa [wg. 10]. Dioda laserowa w swej budowie przypomina diodę krawędziową (o podwójnej strukturze heterozłączowej). Wnęka rezonansowa uzyskana jest z wypolerowanych końców diody, działających jak zwierciadła. Dzięki całkowitemu wewnętrznemu odbiciu w warstwie aktywnej uzyskuje się akcję laserową. Wiązka wyjściowa nie jest dobrze skolimowana (80 x 150) lecz jest to lepsza kolimacja aniŜeli w przypadku diody elektroluminescencyjnej [7,10,26]. 4.5. Porównanie LED z diodami laserowymi Znaczącą cechą diod elektroluminescencyjnych (LED) jest przede wszystkim cena, która jest niŜsza o około 10 - 100 razy aniŜeli diody laserowej (czasami jeszcze niŜsza w zaleŜności od długości fali). Kolejną waŜną cechą jest fakt, iŜ LEDy moŜna zakupić z praktycznie dowolną długością fali, w przeciwieństwie do diod laserowych. Są małe, nie niszczą się łatwo, są teŜ wytrzymałe na zmiany temperatury, wilgotność etc. Charakteryzuje je teŜ łatwa moŜliwość wymiany i budowania układu jak i zasilania. Oczywiście moce w przypadku diod laserowych mogą być wyŜsze choć to nie jest regułą. LEDy nie posiadają tak dobrej monochromatyczności jak diody laserowe – aczkolwiek dobre LEDy mają szerokość spektralną ok. 20 – 30 nm co w większości przypadków jest zadowalające. LEDy nie mają „dobrej” wiązki jeŜeli potrzebna jest kolimacja czy zastosowanie koherencja) [6,7,10,26,43]. 49 światłowodów (zła Tab. 3. Zestawienie cech diod elektroluminescencyjnych i laserowych. LED dioda laserowa o duŜy zakres długości fali o 10-cio krotnie droŜsze (lub więcej) o tanie o mały wybór długości fali o wytrzymałość na warunki zewnętrzne o moŜliwość wykorzystania o łatwość instalacji i zasilania (baterie) o moce rzędu 10 -150 mW [26] o czasami większa moc o słaba monochromatyczność (10-30 nm) o lepsza koherencja i światłowodów [26] monochromatyczność o zła koherencja o większa moc o moŜliwość budowania układów (tanich) o wymaga bardziej złoŜonych układów o szeroka wiązka odpowiednia do o większy pobór mocy naświetlania duŜych obszarów 4.6. Diody elektroluminescencyjne 405 nm Najsilniejsze pasma absorpcyjne większości fotouczulaczy, o budowie opartej na budowie hemu, występują w okolicach 400 nm, czyli w obszarze pasma Soreta. Pochodne hematorfiryny, czy PPIX, posiadają najsilniejsze pasmo na długości 405 nm. Do badań nad fluorescencją najlepiej nadaje się ten zakres światła, pomimo, Ŝe penetruje tkanki na bardzo niewielkie głębokości, ale luminescencja po wzbudzeniu tym światłem jest najsilniejsza. Do PDD moŜna wykorzystać diody elektroluminescencyjne. Pomiary wykonano przy uŜyciu diody LED model RLU405-9-30 firmy Roithner. Jest to dioda emitująca światło z zakresu ultrafioletu. Jej obszar aktywny oparty jest na GaN [43]. PoniŜej przedstawiono charakterystykę tej diody. Wszystkie pomiary wykonywano przy zasilaniu 30 mA i 4 V. 4.6.1. Widmo diody Przy uŜyciu spektrometru zbudowanego z przestrajalnej siatki dyfrakcyjnej MONOCHROMATOR DK480 1/2m firmy Spectral Products oraz kamery CCD - 50 SPECTRA VIDEO CAMERA zmierzono widmo diody LED. Następnie dopasowano funkcję Gaussa do otrzymanego widma. 6000 5000 Model: Gauss NatęŜenie [j.u.] Chi^2/DoF = 19796.51457 R^2 = 0.98228 4000 y0 = xc = w= A= 1200.61 ± 3.21 403.43 ± 0.02 11.09 ± 0.04 51815 ± 174 3000 2000 1000 360 380 400 420 440 Długość fali λ [nm] Rys. 4. 7. Widmo diody LED405 nm wraz z dopasowaniem funkcji Gaussa. Parametry dopasowania funkcji Gaussa: y = y0 + A w π /2 −2 ( x − xc )2 e w2 y0 = 1200,61 ± 3,21 xc = 403,43 ± 0,02 w= 11,09 ± 0,04 A= 51815 ± 174 Z dopasowania funkcji Gaussa widać, iŜ maksimum mocy nie przypada na długość 405 nm a 403 nm (parametr „xc”). Natomiast szerokość połówkowa wynosi ok. 11 nm (parametr „w”). Taka szerokość połówkowa widma diody LED jest idealna do badań biologicznych, poniewaŜ substancje fotoczułe mają stosunkowo szerokie pasma absorpcyjne, które mogą się zmieniać w zaleŜności od warunków zewnętrznych. 51 4.6.2. Moc diody W następnym kroku zmierzono moc diody. Wykorzystano do tego celu miernik mocy firmy FIELDMASTER * COHERENT model FM. Zmierzono moc pojedynczej diody (wg. danych producenta ~9 – 12 mW) zgodnie ze schematem przedstawionym na rys. 4.8. w odległościach od 9 mm do 50 mm. Rys. 4. 8. Sposób pomiaru mocy diody LED, h – odpowiada odległości pomiędzy miernikiem a diodą elektroluminescencyjną. 300 250 -2 y = a*x Moc [µW] 200 Chi^2/DoF = 202.56987 R^2 = 0.97356 a= 150 23755 ± 651 100 50 0 0 10 20 30 40 50 PołoŜenie [mm] Rys. 4. 9. Spadek mocy przypadający na powierzchnię 1 mm2 wraz z odległością dla pojedynczej diody oraz dopasowanie funkcji y=ax-2. Wyniki przedstawiono na rys. 4.9. Pokazują one, iŜ moc diody w dobrym przybliŜeniu zmienia się jak funkcja 1/x2, gdzie x oznacza odległość. Takie zachowanie pozwala przybliŜać diodę elektroluminescencyjną do punktowego źródła światła, które charakteryzuje się właśnie taką zaleŜnością. Dodatkowo, pomiar ten pozwala na wyznaczenie dawki mocy stosowanej podczas pomiarów. 52 4.6.3. Jednorodność natęŜenia W celu zmierzenia jednorodności natęŜenia światła z diody elektroluminescencyjnej wykonano serię zdjęć światła padającego na matówkę przy róŜnych odległościach. Ideę pomiaru przedstawiono schematycznie na rys. 4.11. PrzyłoŜenie miarki do matówki pozwoliło na przeliczenie wartości pikseli na rzeczywiste wymiary obrazów. Wszystkie analizowane zdjęcia wykonano aparatem fotograficznym HP Photosmart 320. Zdjęcia, które otrzymano wymagały obróbki w innych programach. Aby przedstawić rozkład natęŜenia w jednym kierunku wiązki np. poziomym, naleŜało uśrednić w pionie wartości pikseli a następnie moŜliwe było przedstawienie wyników w postaci wykresów. Przeliczenia te moŜliwe są jedynie dla obrazów przedstawianych w skali szarości. Do obróbki wykorzystano program ImageJ, który pozwala na scałkowanie obszaru, oraz Origin 7,5 umoŜliwiającego przedstawianie i kalibracje obrazów. Rys. 4. 10. Zdjęcie światła pochącego od diody LED padającego na matówkę wykonane aparatem fotograficznym HP Photosmart 320. Rys. 4. 11. Schemat przedstawiający pomiary jednorodności padającego światła, odległość pomiędzy matówką a aparatem fotograficznym (HP Photosmart 320) b = 14 cm. 53 Tab. 4. Wykresy natęŜenia światła padającego na matówkę; odległość a= 0 cm. Odległość pomiędzy źródłem światła a matówką wynosiła: a= 0 cm. Dioda była przytknięta do matówki. NatęŜenie [j.u.] 70 60 Model: Gauss 50 Chi^2/DoF = 6.1816 R^2 = 0.98159 40 y0 = xc = w= A= 30 5.92061 ± 0.0828 46.88621 ± 0.0332 16.51401 ± 0.07482 1160.08577 ± 5.43432 20 10 0 0 20 40 60 80 100 PołoŜenie [mm] NatęŜenie – wykres po scałkowaniu obszaru NatęŜenie – wykres trójwymiarowy. zdjęcia w kierunku wertykalnym. Zdjęcie obrazu matówki wraz z wymiarami NatęŜenie - kontury o takich samych obszaru. poziomach jasności Parametry dopasowania funkcji Gaussa do wykresów natęŜenia dla a=0 cm. y = y0 + A w π /2 −2 ( x − xc )2 e w2 y0 = 5,92 ± 0,08 xc = 46,89 ± 0,03 w= 16,5 ± 0,1 A= 1160 ± 5 54 Tab. 5. Wykresy natęŜenia światła padającego na matówkę; odległość a= 1 cm. Odległość pomiędzy matówką a źródłem światła (diodą LED) wynosiła a=1 cm. 90 80 Model: Gauss NatęŜenie [j.u.] 70 Chi^2/DoF = 5.06364 R^2 = 0.99105 60 50 y0 = xc = w= A= 40 5.75677 ± 0.07656 47.24536 ± 0.02396 17.37039 ± 0.05456 1569.49841 ± 5.15375 30 20 10 0 0 20 40 60 80 100 PołoŜenie [mm] NatęŜenie – wykres po scałkowaniu obszaru NatęŜenie – wykres trójwymiarowy. zdjęcia w kierunku wertykalnym. Zdjęcie obrazu matówki wraz z wymiarami NatęŜenie - kontury o takich samych obszaru. poziomach jasności Parametry dopasowania funkcji Gaussa do wykresów natęŜenia dla a=1 cm. y = y0 + A w π /2 −2 ( x − xc )2 e w2 y0 = 5,76 ± 0,08 xc = 47,25 ± 0,02 w= 17,37 ± 0,05 A= 1569 ± 5 55 Tab. 6. Wykresy natęŜenia światła padającego na matówkę; odległość a= 2,5 cm. Odległość pomiędzy matówką a źródłem światła (diodą LED) wynosiła a=2,5 cm. 100 Model: Gauss NatęŜenie [j.u.] 80 Chi^2/DoF = 3.21068 R^2 = 0.9958 60 y0 = xc = w= A= 40 2.71044 ± 0.06134 48.9845 ± 0.01655 17.61008 ± 0.0378 1846.88117 ± 4.15764 20 0 0 20 40 60 80 100 PołoŜenie [mm] NatęŜenie – wykres po scałkowaniu obszaru NatęŜenie – wykres trójwymiarowy. zdjęcia w kierunku wertykalnym. Zdjęcie obrazu matówki wraz z wymiarami NatęŜenie - kontury o takich samych obszaru. poziomach jasności Parametry dopasowania funkcji Gaussa do wykresów natęŜenia dla a=2,5 cm. y = y0 + A w π /2 −2 ( x − xc )2 e w2 y0 = 2,71 ± 0,06 xc = 48,98 ± 0,02 w= 17,61 ± 0,04 A= 1846 ± 4 56 Tab. 7. Wykresy natęŜenia światła padającego na matówkę; odległość a= 5 cm. Odległość pomiędzy matówką a źródłem światła (diodą LED) wynosiła a=5 cm. 100 Model: Gauss Chi^2/DoF = 2.40605 R^2 = 0.99793 NatęŜenie [j.u.] 80 y0 = xc = w= A= 60 2.02626 ± 0.05904 43.90682 ± 0.01334 21.30204 ± 0.03217 2639.35082 ± 4.40062 40 20 0 0 20 40 60 80 100 PołoŜenie [mm] NatęŜenie – wykres po scałkowaniu obszaru NatęŜenie – wykres trójwymiarowy. zdjęcia w kierunku wertykalnym. Zdjęcie obrazu matówki wraz z wymiarami NatęŜenie - kontury o takich samych obszaru. poziomach jasności Parametry dopasowania funkcji Gaussa do wykresów natęŜenia dla a=5 cm. y = y0 + A w π /2 −2 ( x − xc )2 e w2 y0 = 2,03 ± 0,06 xc = 43,91 ± 0,01 w= 21,30 ± 0,03 A= 2639 ± 4 57 Tab. 8. Wykresy natęŜenia światła padającego na matówkę; odległość a=7,5 cm. Odległość pomiędzy matówką a źródłem światła (diodą LED) wynosiła a=7,5 cm. 120 Model: Gauss 100 Chi^2/DoF = 2.02395 R^2 = 0.99857 NatęŜenie [j.u.] 80 y0 = xc = w= A= 60 1.26506 ± 0.06228 46.41871 ± 0.01233 25.17662 ± 0.0322 3364.51529 ± 5.04719 40 20 0 0 20 40 60 80 100 PołoŜenie [mm] NatęŜenie – wykres po scałkowaniu obszaru NatęŜenie – wykres trójwymiarowy. zdjęcia w kierunku wertykalnym. Zdjęcie obrazu matówki wraz z wymiarami NatęŜenie - kontury o takich samych obszaru. poziomach jasności Parametry dopasowania funkcji Gaussa do wykresów natęŜenia dla a=7,5 cm. y = y0 + A w π /2 −2 ( x − xc )2 e w2 y0 = 1,27 ± 0,06 xc = 46,42 ± 0,01 w= 25,18 ± 0,03 A= 3364 ± 5 58 W tabelach powyŜej przedstawiono wykresy natęŜenia. Przedstawiono równieŜ dopasowanie funkcji Gaussa. Analizując parametry dopasowania moŜna zauwaŜyć zmianę szerokości połówkowej wraz z odległością pomiędzy źródłem światła a matówką. ZaleŜność tę przedstawiono na poniŜszym wykresie. Szerokość połówkowa w [mm] 26 24 22 20 18 16 -1 0 1 2 3 4 5 6 7 8 PołoŜenie [cm] Rys. 4. 12. Wykres zaleŜności szerokości połówkowej od odległości matówka – źródło światła. Niejednorodności widoczne na wykresach zamieszczonych w tab. 4. oraz 5. nie przenoszą się na większe odległości. Natomiast szerokości połówkowe zwiększają się wraz z oddalaniem od źródła, a całość profilu natęŜenia staje się bardziej jednorodna – co jest widoczne na wykresach trójwymiarowych. NatęŜenie, które obserwowano nie zaleŜy od kształtu obszaru aktywnego diody LED. 4.7. Urologia – PDD Przedstawiona i scharakteryzowana w poprzednim rozdziale dioda elektroluminescencyjna o długości fali ~ 405 nm idealnie nadaje się do diagnostyki fotodynamicznej. Zastosowanie układu wielu takich diod dałoby moŜliwość wytworzenia źródła światła równie silnego jak lamp z filtrem. Dobra monochromatyczność, którą cechują się opisywane diody dałaby lepszy efekt diagnostyczny niŜ stosowane lampy. Wąskie pasmo absorpcyjne substancji fotoczułych pochłaniałoby praktycznie całe światło pochodzące z diod. Nie występowałaby potrzeba odfiltrowywania widma z obszaru nie wpływającego na fluorescencję. Co więcej 59 wąskie widmo otrzymywane z diod lepiej nadaje się do diagnostyki, bowiem fluorescencja obszarów z fotouczulaczem zaleŜy tylko od ilości energii dopasowanej do pasma absorpcyjnego, kaŜda inna długość fali nie daje efektu luminescencji więc jest zwyczajnie tracona lub wywołuje niepoŜądane skutki uboczne – np. nagrzewanie tkanki. Pozwala to równieŜ na dostarczanie mniejszej dawki energii przy jednoczesnym otrzymaniu takiego samego efektu diagnostycznego. PoniŜej przedstawiono zdjęcia z zabiegu elektrokoagulacji, podczas którego stosowano kwas 5-ALA do fotouczulenia obszarów zmienionych nowotworowo w celu łatwiejszej ich lokalizacji. Kwas aminolewulinowy fotouczula po okresie 1 godziny, natomiast pozostaje aktywny w organizmie przez około 8 godzin. Grupie Prof. Dr Hab. Zygmunta Dobrowolskiego (Katedra Urologii CM UJ), zajmującej się PDD z wykorzystaniem 5-ALA, zaproponowano wymianę stosowanej lampy (STORZ D-Light) z filtrem na układ diod LED. Rys. 4. 13. Zdjęcia z zabiegu usunięcia nowotworu z pęcherza moczowego przeprowadzanego w Klinice Urologii Szpitala Uniwersyteckiego w Krakowie. Nowotwór o średnicy ok. 2 cm. Po prawej obszar diagnozowany PDD po podaniu ALA, po lewej widoczny jest sposób usuwania obszarów nowotworowych w świetle białym (endoskopowa elektrokoagulacja). 4.8. Diody LED 740 nm Bakteriochloryny i ich pochodne są moŜliwymi do zastosowań w PDT fotouczulaczami [8]. Grupa badawcza Prof. Dr Hab. GraŜyny Stochel (Zespół Chemii Koordynacyjnej i Bionieorganicznej) przy Uniwersytecie Jagiellońskim zajmuje się badaniem i charakteryzowaniem ich właściwości, jak równieŜ modyfikowaniem by wykazywały jeszcze lepsze właściwości do zastosowań w PDT. Do pomiarów niezbędne jest zastosowanie źródeł światła dopasowanych do pasm absorpcyjnych. 60 Zaproponowano, jako oświetlacz, matrycę diod LED. Są one idealnym źródłem do terapii fotodynamicznej. Bakteriochloryny, nad którymi prowadzono badania wykazywały maksimum absorpcyjne na długości fali λmax ~ 740 nm. Aby uzyskać najlepszy efekt i móc interpretować wyniki naleŜy dobrze scharakteryzować źródło światła: długość fali, szerokość połówkową, sposób rozchodzenia się światła a takŜe jego jednorodność podczas oświetlania. Bakteriochloryny, na których prowadzone są badania, umieszczane są w specjalnych kuwetach pozwalających na oświetlanie jednocześnie 96 próbek (rys. 4.14.). Kuweta ta pozwala na umieszczenie po 12 próbek w 8 rzędach. KaŜdy obszar z pojedynczą próbką zajmuje 37,18 mm2. Rys. 4. 14. Schemat kuwety stosowanej do badań nad bakteriochlorynami. Do pomiarów wykorzystano diody ELD-740-524 firmy Roithner. Na stronie producenta dostępna jest ogólna charakterystyka diod [43]. Są one małe (9 x 5,3 x 6 mm) i lekkie (0,33 g), nie wymagają duŜego zasilania, cechują się mocą 10 mW [wg. 43] i małym kątem rozchodzenia się wiązki (200). Właściwości te pozwalają na zbudowanie matrycy diod idealnie oświetlających ww. kuwetę. Przeprowadzono analizy spektralne, natęŜenia i mocy diod. W niniejszej pracy nie przedstawiono szczegółowych analiz. Z badań wynika, Ŝe światło pochodzące z diod LED nadaje się do badań na obiektach, które muszą być względnie jednorodnie oświetlane mocami ok. 10 mW. Do badań nad bakteriochlorynami przy uŜyciu diod zaproponowano układ, w którym moŜna by było umieścić tyle samo diod co komórek kuwety (na rys.4.15. widoczny jest prototyp z czterema diodami). Rys. 4. 15. Schemat układu do naświetlania kuwety oraz zdjęcie prototypu. 61 5. Aparatura i pomiar fluorescencji krwi Głównym celem prowadzonych badań było wykonanie urządzenia do pomiaru fluorescencji krwi, opanowania metodyki i optymalizacji warunków pomiarowych. Badania te nie były skierowane na rejestrowanie widm róŜnych rodzajów próbek, tylko na dobranie dogodnych warunków i znalezienie najlepszych rozwiązań technicznych dotyczących samego procesu pomiarowego. Być moŜe rozwinięcie tej metody pozwoli na wyznaczenie szerszych i bardziej ogólnych wniosków dotyczących procesów zachodzących przy wzbudzaniu krwi i dzięki temu na badanie zmian patologicznych we krwi wzbudzanej światłem z diod, a analizowane widma fluorescencji wyznaczą łatwą i dogodną metodę diagnostyczną. 5.1. Widmo hemoglobiny – spektrometr SM520-USB Pomiar słabej fluorescencji krwi po oświetleniu diodą LED o charakterystycznej długości 405 nm wymaga skonstruowania odpowiednio czułej aparatury pomiarowej. Zastosowanie spektrometrów o niskiej czułości powoduje, Ŝe widma są nieczytelne a stosunek sygnału do szumu jest bardzo mały. PoniŜej przedstawiono schemat układu, z którym mierzono fluorescencję hemoglobiny. Zastosowano spektrometr firmy Spectral Products SM520-USB. Urządzenie to pozwoliło na zarejestrowanie widma jedynie w przypadku przedstawionym na schemacie – światło z diody musiało przechodzić przez kuwetę. Interpretacja tak zmierzonej fluorescencji jest niezmiernie trudna, wiąŜe się bowiem z procesem absorpcji i rozpraszania światła, w wyniku czego kształt widma fluorescencji moŜe być znacznie zniekształcony przez te procesy. 62 Rys. 5. 1. Zdjęcie kuwety z krwią po oświetleniu światłem z diody LED 405 nm – widoczna jest czerwona fluorescencja. Rys. 5. 2. Schemat pomiaru widm transmisji hemoglobiny przy wykorzystaniu spektrometru SM520 USB. 24000 22000 NatęŜenie [j.u.] 20000 18000 16000 14000 12000 10000 8000 6000 Widmo hemoglobiny 0 500 1000 1500 2000 Długość fali [px] Rys. 5. 3. Widmo transmisji hemoglobiny zmierzone na spektrometrze firmy Spektral Products – model SM520 USB. Przedstawione powyŜej widmo nie zostało wykalibrowane ze względu na zbyt niską spektralną czułość spektrometru. W związku z trudnościami w interpretacji i moŜliwości otrzymania niewiarygodnego widma nie korzystano z tego spektrometru. W celu dokładnego mierzenia fluorescencji powinno się moŜliwie eliminować procesy reabsorpcji dlatego teŜ zbudowano w tym celu inny układ pomiarowy. 63 5.2. Aparatura pomiarowa Najbardziej czasochłonnym zajęciem, podczas pracy badawczej, było zbudowanie układu wystarczająco czułego, aby był w stanie rejestrować słabe widma fluorescencji. W celu zmierzenia fluorescencji zbudowano układ pomiarowy zgodny ze schematem przedstawionym na rysunku 5.4. Fluorescencja, po oświetleniu kuwety zawierającej krew, diodą LED∗ dostrojoną do pasma absorpcyjnego krwi, jest bardzo słaba i wymaga silnego skupiania oraz dokładnego doprowadzenia do spektrometru. W tym celu wykorzystano układ soczewek o duŜej średnicy i krótkich ogniskowych, co pozwoliło na zebranie duŜej liczby fotonów (rys. 5.4.). Rys. 5. 4. Schemat układu pomiarowego oraz kalibracyjnego. Zaznaczono obrotowe lusterko wykorzystywane przy kalibracji lampą ZnHgCd oraz lampą wolframową jak i do skupiania światła z oświetlanej diodą kuwety. UŜyty w tym układzie spektrometr jest to zaadoptowany monochromator SP-2 firmy Carl Zeiss zmodyfikowany do funkcji jakie pełni spektrometr. ZaleŜało nam na rejestracji szerokiego zakresu widma. W tym celu w oryginalnym monochromatorze wykonano dwie modyfikacje. Pierwsza polegała na usunięciu szczeliny wyjściowej, ∗ RLU405-9-30 firmy Roithner zasilanie: 30 mA i 4 V 64 a następnie odtworzeniu obrazu na kamerze CCD przy uŜyciu soczewki achromatycznej. Brak szczeliny wyjściowej powoduje, Ŝe obraz wydostający się na zewnątrz obejmuje szeroki zakres widma, a nie – jak w przypadku samego monochromatora – wąskiego wybranego przedziału długości fal. Drugą modyfikacją było wprowadzenie do monochromatora pryzmatu. Dzięki temu nie są widoczne piki z wyŜszych rzędów dyfrakcji (tzw. duchy), które mogłyby zniekształcać widmo, w przypadku stosowania siatki dyfrakcyjnej. Zastosowano pryzmat kwarcowy – pozwalający (dzięki małej dyspersji w zakresie VIS) na rejestrację szerszego zakresu niŜ pryzmat szklany. Rys. 5. 5. Zdjęcie przedstawiające monochromator SP-2 firmy Carl Zeiss. W układ pomiarowy wbudowano obrotowe lusterko tak, aby moŜliwe było wykorzystanie róŜnych lamp w celu kalibracji układu, zachowując takie same drogi optyczne. Rys. 5. 6. Zdjęcie układu pomiarowego wykonanego zgodnie z opisanym schematem. 65 5.2.1. Kamera CCD Światło wychodzące ze spektrometru było odwzorowywane za pomocą soczewki achromatycznej na kamerze CCD – SPECTRA VIDEO CAMERA. Matryce CCD (ang. charge coupled devices) są obecnie najczęściej stosowanym układem do rejestracji obrazów. Zbudowane są z duŜej liczby półprzewodnikowych elementów fotoczułych oraz elementów bramkujących elektrony wytworzone pod wpływem padających fotonów. Całość jest sterowana elektronicznie i przesyłana do innego urządzenia – najczęściej komputera [10,44]. Rys. 5. 7. Program PixelView obsługujący kamerę CCD oraz wykres natęŜenia (po prawej). Kamera CCD, którą wykorzystywano w czasie pomiarów sterowana jest programem PixelView, dostarczonym przez firmę Spectra Video wraz z kamerą, który pozwala na rejestrację obrazów jak i dobór czasu ekspozycji zdjęć. 5.2.2. Dane otrzymywane ze spektrometru Z programu PixelView otrzymuje się dane w postaci obrazów w formacie „.tif”. Są to obiekty o wymiarach 1024 na 1024 pikseli wynikające z rozmiarów matrycy kamery CCD. Program co prawda pozwala na przedstawianie widm w postaci wykresów, ale nie pozwala na ich eksport. Otrzymane pliki w formacie *.tif wymagają obróbki w programach obliczających natęŜenie scałkowane w pionie względem całości (1024 px) lub w określonym obszarze. Na taką analizę pozwala przykładowo program ImageJ na licencji GNU (General Public License). Tak opracowane obiekty moŜna zapisać jako pliki tekstowe zawierające w dwóch kolumnach informacje o połoŜeniu 66 w pikselach oraz scałkowanym natęŜeniu w kierunku wertykalnym. Tif’y uzyskane z oświetlenia kamery CCD posiadają zbyteczną informację o wymiarach. W celu usunięcia zbędnych informacji z plików TIF najlepiej przekonwertować je do plików o rozszerzeniu BMP, które w swej strukturze nie posiadają tzw. „tagów", przenoszących dodatkową informację o pliku. Istnieje wiele darmowych oprogramowań dających moŜliwość zamiany pomiędzy wcześniej wspomnianym formatami na wielu plikach jednocześnie. Sama zamiana nie jest czasochłonna. Rys. 5. 8. Fluorescencja krwi – obraz z kamery CCD. Otrzymane bitmapy moŜna przekształcić na widmo. Uzyskane pliki jednocześnie nie są powiązane w Ŝaden sposób z długością fali. Długość fali związana z kierunkiem horyzontalnym obrazów jest wyraŜana w wartościach pikseli [px] i wymaga kalibracji aby mogła być wraŜana w nm. Pliki graficzne prezentujące przestrzenne rozkłady światła wychodzącego ze spektrometru, wnoszą informację o natęŜeniu światła docierającego do kamery o odpowiedniej długości fali za pomocą odcieni szarości. Oświetlenie, kaŜdego piksela jest zapisywana jako wartość z zakresu 0 – 255. NatęŜenia prezentowane w dalszej części posiadają większe wartości, co wynika z całkowania obszaru w kierunku Y. 5.3. Kalibracja układu pomiarowego Obrazy otrzymywane na kamerze CCD wymagają dwóch kalibracji: o kalibracji długości fali o kalibracji natęŜenia 67 PoniŜej przedstawiono schemat wykonania kalibracji (rys. 5.9.). WaŜnym etapem jest odjęcie „prądu ciemnego” czyli szumu, który powstaje na kamerze CCD i jest zaleŜny od temperatury, w której pracuje kamera. Nie uwzględnienie tego efektu zniekształca kształt otrzymywanych widm. Wszystkie kalibracje wykonano po scałkowaniu w pionie zdjęć z kamery CCD, tak by istniała moŜliwość prezentowania wyników w postaci wykresów. Kalibracje wykonano przy zastosowaniu układu pomiarowego przedstawionego na rys. 5.4. W celu kalibracji długości fali uŜyto lampę ZnHgCd, natomiast do kalibracji natęŜenia widm, czyli czułości kamery w funkcji długości fali zastosowano lampę z wstęgą wolframową. Rys. 5. 9. Schemat przedstawiający etapy kalibracji widma fluorescencji. 5.3.1. Kalibracja I – długości fali Prezentowanie wyników w postaci wykresów wymaga posiadania wiedzy na temat obszaru obejmowanego przez kamerę CCD. Do tej kalibracji uŜyto lampy ZnHgCd o znanych charakterystycznych liniach emisyjnych. Zarejestrowano widmo tej lampy a następnie scałkowano wartości kolumny otrzymane ze zdjęcia i wyrysowano je dla poszczególnych kolumn. Na koniec naleŜało dopasować do otrzymanych pików odpowiadające im długości fal [45]. Dopasowane do odpowiednich pików długości fali przedstawiono na rys. 5.11. a dane zestawiono w tab.9. 68 Rys. 5. 10. Obraz widma lampy ZnHgCd rejestrowany przez kamerę CCD. N atęŜenie [j.u.] 691 16000 644 14000 5000 708 734 NatęŜenie [j.u.] 12000 82 0 10000 546 50 100 150 200 250 300 350 D ługość fali [n m ] 8000 508 6000 579 4000 577 481 636 2000 0 0 200 400 600 800 1000 1200 Długość fali [px] Rys. 5. 11. Wykres przedstawiający charakterystyczne linie dla lampy ZnHgCd mierzone przez kamerę CCD. W ramce przedstawiono obszar niŜszych długości fali ze słabo widocznymi liniami. Tab. 9. Punkty dopasowane do charakterystycznych linii lampy ZnHgCd. PołoŜenie na Długość Pierwiastek kamerze CCD [px] fali [nm] 983 481,053 Zn 836 508,5822 Cd 680 546,075 Hg 573 577,21 Zn 564 579,067 Hg 408 636,234 Zn 388 643,847 Cd 287 690,752 Hg 252 708,19 Hg 205 734,567 Cd 74 820,0309 Cd 69 Po przypisaniu odpowiednich linii charakterystycznych lampy do punktów pomiarowych dopasowano funkcję będącą rozwinięciem szeregu Taylora funkcji 1/x, będącą charakterystyczną cechą dla spektrometrów wyposaŜonych w pryzmat. Na rysunku 5.12. przedstawiono parametry dopasowania funkcji. Taka kalibracja daje moŜliwość przedstawiania wykresów zaleŜności od długości fali wyraŜonej w nanometrach. Parametry dopasowania wielmianu: 2 3 4 5 Y = A + B1*X + B2*X + B3*X + B4*X + B5*X 850 Punkty kalibracyjne Dopasowanie wielomianu 800 -----------------------------------------------------------A= 878,33167 ± 1,78007 B1 = -0,84401 ± 0,0318 B2 = 7,95087E-4 ± 1,77412E-4 B3 = -5,27452E-7 ± 4,16522E-7 B4 = 2,04843E-10 ± 4,32712E-10 B5 = -2,85181E-14 ± 1,64048E-13 ------------------------------------------------------------ Długość fali [nm] 750 700 650 600 R-Square(COD) SD N P -----------------------------------------------------------0,99999 0,44166 11 <0.0001 ------------------------------------------------------------ 550 500 450 0 200 400 600 800 1000 Długość fali [px] Rys. 5. 12. Wykres zaleŜności połoŜenia linii z lampy ZnHgCd mierzonych przez kamere wraz z dopasowaniem funkcji do odpowiadających im długościom fali. Do punktów podanych w tabeli 9. dopasowano wielomian: Y = A + B1*X + B2 *X 2 + B3 *X 3 + B4 *X 4 + B5 *X 5 Parametry dopasowania: A = 878,09734 ± 6,11828 B1 = -0,83916 ± 0,10928 B2 = 7,66675*10-4 ± 6,09781*10-4 B3 = -4,60461*10-7 ± 1,43163*10-6 B4 = 1,36705*10-10 ± 1,48727*10-9 B5 = -3,55331*10-15 ± 5,63847*10-13 70 5.3.2. Kalibracja czułości kamery CCD Kolejnym krokiem w procesie kalibracji jest znalezienie czułości kamery CCD. W tym celu najlepiej uŜyć lampy z włóknem wolframowym o ciągłym i dobrze scharakteryzowanym widmie. Idea kalibracji polega na zarejestrowaniu obrazu przez lampę CCD oraz odpowiednim przyrównaniu do jej właściwego kształtu czułości zaleŜnej od długości fali. Rys. 5. 13. Zdjęcie z kamery CCD obrazu lampy z włóknem wolframowym. Czułość kamery jest to charakterystyczna cecha kamer CCD, zaleŜy ona od długości fali. Zazwyczaj kamery są w stanie rejestrować widmo z zakresu ~300 – 1100 nm, jednakŜe nie rejestrują świtała o kaŜdej długości fali w takim samym stopniu. Maksimum czułości przewaŜnie przypada dla 650 nm. Czułość kamery moŜna wyznaczyć za pomocą wzorów a następnie numerycznie przekształcać otrzymane obrazy ze znormalizowanym natęŜeniem: I wolf ( λ ) = Wwolf ( λ ) * CCCD ( λ )
CCCD ( λ ) = I fluor ( λ ) = W fluor ( λ ) * CCCD ( λ )
W fluor ( λ ) =  I fluor ( λ )  *W λ W fluor ( λ ) =   I ( λ )  wolf ( )  wolf  71 I wolf ( λ ) Wwolf ( λ ) I fluor ( λ ) CCCD ( λ ) Gdzie: I odpowiada natęŜeniu zaleŜnemu od długości fali rejestrowanemu przez kamerę CCD; W odpowiada właściwemu kształtowi natęŜenia od długości fali; C jest zaleŜnością czułości kamery CCD w funkcji długości fali. Na rysunku poniŜej przedstawiono kształt widma otrzymanego z lampy z włóknem wolframowym na kamerze CCD. 180000 160000 NatęŜenie Iwolf(λ) [j.u.] 140000 120000 100000 80000 60000 40000 20000 0 -20000 400 500 600 700 800 900 Długość fali [nm] Rys. 5. 14. Wykres natęŜenia otrzymany na kamerze CCD z lampy wolframowej firmy OSRAM (po odjęciu prądu ciemnego). W celu wyznaczenia kalibracji niezbędna jest informacja o rzeczywistym kształcie widma lampy niezaleŜnym od czułości kamery. W tym celu wykorzystano wcześniejszą kalibrację lampy [dr Krzysztof DzierŜęga informacje prywatne]. Warunki pracy lampy podczas naszych badań były takie same jak podczas tej kalibracji. W tab. 10. przedstawiono jej parametry. Tab. 10. Parametry kalibracji lampy z wstęgą wolframową firmy OSRAM [dr Krzysztof DzierŜęga informacje prywatne]. Długość fali [nm] NatęŜenie [j.u.] 450 46,965 500 89,726 550 135,485 600 180,285 650 221,052 700 255,6 750 285 800 298,32 900 313,09 72 350 Wwolf(λ) Widmo lampy ze wstęgą wolframową firmy OSRAM 300 Punkty znane z kalibracji Dopasownanie wielomianu NatęŜenie [j.u.] 250 Parametry dopasowania wielomianu: 2 3 4 Y = A + B1*X + B2*X + B3*X + B4*X 200 -----------------------------------------------------------A= 1401,26461 ± 131,52612 B1 = -10,19755 ± 0,90431 B2 = 0,02536 ± 0,00226 B3 = -2,461E-5 ± 2,43803E-6 B4 = 8,36698E-9 ± 9,59582E-10 ------------------------------------------------------------ 150 100 50 R-Square(COD) SD N P -----------------------------------------------------------0,99991 1,43578 11 <0.0001 ------------------------------------------------------------ 0 300 400 500 600 700 800 900 Długość falin [nm] Rys. 5. 15. Charakterystyka lampy wolframowej firmy OSRAM zastosowanej do kalibracji układu oraz dopasowanie funkcji. Na podstawie danych z 1990 roku [Tab.10]. Do punktów podanych w tabeli 10. dopasowano wielomian postaci: Y = A + B1*X + B2 *X 2 + B3 *X 3 + B4 *X 4 A= 1401,26461 ± 131,52612 B1 = -10,19755 ± 0,90431 B2 = 0,02536 ± 0,00226 B3 = -2,461*10-5 ± 2,43803*10-6 B4 = 8,36698*10-9 ± 9,59582*10-10 Ostatnim etapem tej kalibracji jest wyznaczenie czułości kamery CCD z zaleŜności: CCCD ( λ ) = I wolf ( λ ) Wwolf ( λ ) PowyŜej przedstawiono wszystkie etapy analizy prowadzące do wyznaczenia czułości. PoniŜej przedstawiono wykres zaleŜności czułości omawianej kamery CCD od długości fali. Długość fali nie została przekalibrowania do nanometrów. Taki proces pozwala na 73 wprowadzenie wartości krzywej czułości do napisanego programu unikając niepotrzebnych informacji, które mogłyby (numerycznie) wprowadzać błędy. 800 700 Czułość C(λ) [j.u.] 600 500 400 300 200 100 0 -100 0 200 400 600 800 1000 1200 Długość fali [px] Rys. 5. 16. Czułość kamery CCD w zaleŜności od długości fali. Kalibracja wymaga równieŜ odjęcia od rejestrowanych obrazów fluorescencji sygnałów szumu. W tym celu dopasowano funkcję analityczną do widma szumu. Wielomian, który otrzymano pozwala na szybką i poprawną analizę wyników. Podobnie jak i w funkcji dopasowania czułości widmo analizowano w zaleŜności od połoŜenia wyraŜonego w pikselach. 123000 Parametry dopasowania wielomianu: 2 3 4 5 Y = A + B1*X + B2*X + B3*X + B4*X + B5*X Dane pomiarowe Dopasowanie wilomianu 122000 -----------------------------------------------------------A= 121843,86152 ± 54,63307 B1 = -45,15607 ± 1,06194 B2 = 0,14295 ± 0,00635 B3 = -2,49903E-4 ± 1,56262E-5 B4 = 2,29865E-7 ± 1,67509E-8 B5 = -8,22153E-11 ± 6,49196E-12 ------------------------------------------------------------ 121000 NatęŜenie [j.u.] 120000 119000 118000 117000 R-Square(COD) SD N P -----------------------------------------------------------0,95695 273,88514 1020 <0.0001 ------------------------------------------------------------ 116000 115000 114000 0 200 400 600 800 1000 Dlugość fali [px] Rys. 5. 17. Dopasowanie kształtu do prądu ciemnego. Wyraźnie widoczne jest, iŜ amplituda prądu ciemnego jest zaleŜna od długości fali. Centralna część analizowanego obszaru wykazuje niŜsze natęŜenie o ok. 10% aniŜeli skrajne długości fali. MoŜe to wynikać z warunków otoczenia, w którym prowadzono 74 badania, pomimo wyciemnienia aparatury (praca monitora, zasilaczy, które równieŜ emitowały światło). Parametry dopasowania wielomianu postaci: Y = A + B1*X + B2 *X 2 + B3 *X 3 + B4 *X 4 + B5 *X 5 A= 121843,86152 ± 54,63307 B1 = -45,15607 ± 1,06194 B2 = 0,14295 ± 0,00635 B3 = -2,49903*10-4 ± 1,56262*10-5 B4 = 2,29865*10-7 ± 1,67509*10-8 B5 = -8,22153*10-11 ± 6,49196*10-12 5.3.3. MONOSpectrometr - program do analizy danych Widma otrzymywane z programu PixelView z zastosowaniem układu pomiarowego przedstawionego na rys. 5.4. nie dają w łatwy sposób wyników, które moŜna przedstawić za pomocą wykresów. Wymagane jest całkowanie obszaru obrazów z kamery w kierunku pionowym, a takŜe dwuetapowa kalibracja omówiona wcześniej. Kalibracja czułości oraz konieczność odejmowania szumu od sygnałów fluorescencji powoduje, Ŝe wyznaczanie danych jest czasochłonne. W celu przyspieszenia procesu obróbki danych napisano program „MONOSpectrometr”, opierający się o dane otrzymane z kalibracji (przedstawione w poprzednich częściach rozdziału). Na rys. 5.18. przedstawiono interface programu MONOSpectrometr wykorzystywanego do analizy danych. Program ten daje moŜliwość: o kalibracji długości fali o normalizacji natęŜenia uwzględniającego czułość kamery 75 Rys. 5. 18. Interface programu MONOSpectrometr. Program dający moŜliwość wyboru obszaru całkowania w kierunku pionowym, kalibracji długości fali oraz natęŜenia (uwzględnienie czułości kamery). 5.4. Fluorescencja krwi NajwaŜniejszym elementem pracy badawczej było zbudowanie układu pomiarowego w celu rejestracji widma fluorescencji krwi oraz obserwacji zmian kształtów widma przy róŜnych warunkach pomiarowych. Kalibracje lampami wykonano przed rozpoczęciem pomiarów zgodnie z opisem z rozdziału 5.2. W poniŜszej części układ pomiarowy był zredukowany do postaci przedstawionej na rys. 5.19, a wyniki przedstawione są juŜ po kalibracji zarówno długości fali jak i czułości kamery CCD. Przedstawione widma powstały w wyniku całkowania obszaru zdjęcia z kamery CCD wzdłuŜ kolumn. ZauwaŜono, Ŝe dobór wielkości „okna” całkowania wpływa na kształt widm (rys.5.18. czerwone linie poziome). W celu przedstawienia fluorescencji całkowano wszystkie zdjęcia w tym samym obszarze (250 px), aby wyniki mogły być wzajemnie porównywane. 76 Rys. 5. 19. Schemat układu pomiarowego fluorescencji krwi, F1,2,3 – oznacza soczewki, F4 to soczewka achromatyczna. Zmierzono fluorescencję dwóch rodzajów krwi otrzymanych z Uniwersyteckiego Szpitala Dziecięcego w Krakowie: ° koncentrat krwinek czerwonych grupa 0 Rh(–) napromienioną dawką 25 Gy1 ° koncentrat krwinek czerwonych grupa 0 Rh(+) napromienioną dawką 25 Gy2 Koncentrat krwinek czerwonych, na którym prowadzono badania to krew pełna po usunięciu większości osocza. Zawiera krwinki czerwone oraz krwinki płytkowe i leukocyty [38]. Przechowywano je w preparacie antykrzepliwym (CPD wraz z Adsol). Substancje te pozwalają na przechowywanie krwinek do 42 dni od daty pobrania [46]. Koncentrat krwinek został napromieniowany promieniowaniem jonizującym o dawce 25 Gy. Procedura taka zapobiega potransfuzyjnym odrzutom [38]. Napromieniowany koncentrat krwinek moŜna stosować u wszystkich osób, a napromieniowanie nie uszkadza znacząco erytrocytów [38]. Wykresy poniŜej przedstawiają widma fluorescencyjne dla opisanych powyŜej próbek bez zastosowania rozcieńczalnika. Widma te nie róŜnią się znacząco od siebie. Ich maksima występują na tych samych długościach fali. Nieznaczne zmiany amplitudy mogą wynikać z róŜnicy warunków zewnętrznych najprawdopodobniej z róŜnego poziomu tła od światła rozproszonego na 405 nm. 1 2 Fluorescencję mierzono 61 dni po pobraniu krwi Fluorescencję mierzono 56 dni po pobraniu krwi 77 10 10 Krew grupy 0 Rh- Krew grupy 0 Rh+ 8 NatęŜenie [j.u.] NatęŜenie [j.u.] 8 6 4 6 4 2 2 0 450 500 550 600 650 700 750 800 850 0 450 900 Długość fali [nm] 500 550 600 650 700 750 800 850 900 Długość fali [nm] Rys. 5. 20. Widmo fluorescencji krwi grupy 0 Rh(-). Rys. 5. 21. Widmo fluorescencji krwi grupy 0 Rh(+). 5.4.1. Wpływ rozcieńczalnika na widmo fluorescencji Podczas budowy układu pomiarowego i optymalizacji parametrów aparatury zauwaŜono, Ŝe rozcieńczanie wodą destylowaną silnie wpływa na widma fluorescencji krwi. Proces ten wydał się bardzo interesujący i w tym kierunku poprowadzono badania. Zmierzono wpływ rozcieńczalnika na widmo fluorescencji krwi. UŜyto w tym celu wody destylowanej oraz soli fizjologicznej (firmy BAXTER TERPOL∗). Fluorescencja krwi ma widoczne silne dwa maksima zarówno dla krwi grupy 0 Rh(-) jak i 0 Rh(+). W kolejnych częściach rozdziału zwrócono uwagę na ich połoŜenia jak i amplitudy. Woda destylowana Zmierzono wpływ wody destylowanej na widmo fluorescencji krwi. Zmierzono obie wcześniej wspomniane grupy krwi. Przedstawiono wyniki w sposób zbiorczy, aby moŜna było od razu zauwaŜyć duŜe róŜnice w kształcie i natęŜeniu. Krew grupy 0 Rh(-): ∗ Sól fizjologiczna firmy BAXTER TERPOL Sp. z o.o. Wytwórca: Polfa-Lublin s.a. Natrium Chloratum 0,9% inj., 9 mg/ml, roztw. do wlewu doŜylnego 500 ml Skład: Chlorek sodu 9,0 g, Osmolarność płynu wynosi 308 mosmol/l, Woda do wstrzykiwań do 1000,0 ml, 1000 ml roztworu zawiera 154 mmol (154 mEq) Na+ i 154 mmol (154 mEq) Cl 78 Stosunek objętościowy: KREW:H2O 1:0 2:1 3:1 4:1 5:1 NatęŜenie [j.u.] 8 6 Stosunek objętościowy: KREW:H2O 4,5 100% 67% 75% 80% 83% 4 2 4,0 1:1 1:2 1:3 1:4 1:5 1:10 1:20 3,5 3,0 NatęŜenie [j.u.] 10 2,5 2,0 50% 33% 25% 20% 17% 9% 5% 1,5 1,0 0,5 0 0,0 -2 450 500 550 600 650 700 750 800 850 900 450 500 550 600 650 Długość fali [nm] Rys. 5. 22. Widmo fluorescencji krwi grupy 0 Rh(–) z H2O przy róŜnych stęŜeniach. 800 850 900 100% 83% 80% 75% 67% 50% 1:2 1:3 1:4 1:5 1:10 1:20 1:1 10 NatęŜenie [j.u.] 3:1 20 Stosunek objętościowy: KREW:H2O 15 1:0 5:1 4:1 3:1 2:1 1:1 1:1 2:1 NatęŜenie [j.u.] 750 Rys. 5. 23. Widmo fluorescencji krwi grupy 0 Rh(–) z H2O przy róŜnych stęŜeniach. Stosunek objętościowy: KREW:H2O 30 700 Długość fali [nm] 4:1 10 33% 25% 20% 17% 9% 5% 50% 5 5:1 0 1:0 0 450 500 550 600 650 700 750 800 850 450 900 500 550 600 650 700 750 800 850 900 Długość fali [nm] Długość fali [nm] Rys. 5. 24. Wykres przedstawiający kształ widma fluorescencji krwigrupy 0 Rh(-) dla róŜnych stosunków objętościowych krew: H2O. Rys. 5. 25. Wykres przedstawiający kształ widma fluorescencji krwigrupy 0 Rh(-) dla róŜnych stosunków objętościowych krew: H2O. Krew grupy 0 Rh(+): Stosunek objętościowy: KREW:H2O 1:0 2:1 3:1 4:1 5:1 NatęŜenie [j.u.] 8 6 Stosunek objętościowy: KREW:H2O 4,5 4,0 100% 67% 75% 80% 83% 4 2 1:1 1:2 1:3 1:4 1:5 1:10 3,5 3,0 NatęŜenie [j.u.] 10 2,5 2,0 50% 33% 25% 20% 17% 9% 1,5 1,0 0,5 0 0,0 -2 450 500 550 600 650 700 750 800 850 900 450 500 Długość fali [nm] 550 600 650 700 750 800 850 900 Długość fali [nm] Rys. 5. 26. Widmo fluorescencji krwi grupy 0 Rh(+) z H2O przy róŜnych stęŜeniach. Rys. 5. 27. Widmo fluorescencji krwi grupy 0 Rh(+) z H2O przy róŜnych stęŜeniach. Kształt powyŜej przedstawionych widm z wodą destylowaną jako rozcieńczalnikiem jest do siebie bardzo zbliŜony dla obu grup krwi. Widoczna jest 79 natomiast zmiana kształtu i natęŜenia dla fluorescencji przy zmianie stęŜenia z wodą. Woda prawdopodobnie jest wygaszaczem co wpływa na amplitudę i kształt widma. Szczególnie widoczne jest to w przypadku rozcieńczenia 1:1 gdzie fluorescencja praktycznie zanika. Woda destylowana ma równieŜ duŜy wpływ na hemolizę, czyli przechodzenie hemoglobiny do osocza krwi, wywołane zniszczeniem błony komórkowej erytrocytów [47,48]. MoŜliwe, iŜ ten fakt wpływa na kształt widm fluorescencji. Sól fizjologiczna PoniŜsze wykresy przedstawiają zestawienie wielu widm fluorescencji krwi grupy 0 Rh(-) dla róŜnych stęŜeń rozcieńczalnika będącego solą fizjologiczną. Amplitudy pików nieznacznie się między sobą róŜnią, a ich kształt się zmienia. Krew grupy 0 Rh(-): Stosunek objętościowy: KREW:Sól fizjologiczna 14 12 8 6 4 8 4 2 0 0 500 550 600 650 700 750 800 850 -2 450 900 500 Długość fali [nm] Rys. 5. 28. Widmo fluorescencji krwi grupy 0 Rh(–) z rozcieńczalnikiem przy róŜnych stęŜeniach. 50% 33% 25% 20% 17% 9% 6 2 -2 450 1:1 1:2 1:3 1:4 1:5 1:10 10 NatęŜenie [j.u.] NatęŜenie [j.u.] 12 1:0 2:1 3:1 4:1 5:1 10 Stosunek objętościowy: KREW:Sól fizjologiczna 14 550 600 650 700 750 800 850 900 Długość fali [nm] Rys. 5. 29. Widmo fluorescencji krwi grupy 0 Rh(–) z rozcieńczalnikiem przy róŜnych stęŜeniach. Na kolejnych rysunkach przedstawiono indywidualne kształty wybranych widm fluorescencji krwi dla róŜnych stęŜeń rozcieńczalnika. 80 Stosunek objętościowy: KREW:Sól fizjologiczna NatęŜenie [j.u.] 1:0 5:1 4:1 3:1 2:1 1:1 1:1 50 2:1 40 3:1 30 20 4:1 10 5:1 100% 83% 80% 75% 67% 50% 1:0 0 450 500 550 600 650 700 750 800 850 Stosunek objętościowy: KREW:Sól fizjologiczna 60 NatęŜenie [j.u.] 60 50 1:1 40 1:10 30 1:5 20 1:4 10 1:3 0 1:2 450 900 500 1:2 1:3 1:4 1:5 1:10 1:1 550 600 650 700 750 800 850 33% 25% 20% 17% 9% 50% 900 Długość fali [nm] Długość fali [nm] Rys. 5. 30. Wykres przedstawiający kształt widma fluorescencji krwi grupy 0 Rh(-) dla róŜnych stosunków objętościowych krew : sól fizjologiczna. Rys. 5. 31. Wykres przedstawiający kształt widma fluorescencji krwi grupy 0 Rh(-) dla róŜnych stosunków objętościowych krew : sól fizjologiczna. Krew grupy 0 Rh(+): Analogicznie przedstawiono wyniki dla krwi grupy 0 Rh(+). 8 100% 67% 80% 83% 50% 1:2 1:3 1:4 1:5 1:10 10 6 4 2 8 33% 25% 20% 17% 9% 6 4 2 0 0 -2 -2 450 Stosunek objętościowy: KREW:Sól fizjologiczna 12 NatęŜenie [j.u.] 1:0 2:1 4:1 5:1 1:1 10 NatęŜenie [j.u.] 14 Stosunek objętościowy: KREW:Sól fizjologiczna 12 500 550 600 650 700 750 800 850 450 900 Rys. 5. 32. Widmo fluorescencji krwi grupy 0 Rh(+) z rozcieńczalnikiem przy róŜnych stęŜeniach. 500 550 600 650 700 750 800 850 900 Długość fali [nm] Długość fali [nm] Rys. 5. 33. Widmo fluorescencji krwi grupy 0 Rh(+) z rozcieńczalnikiem przy róŜnych stęŜeniach. PołoŜenie pików Analizując widma przedstawione w poprzedniej części moŜna zauwaŜyć, iŜ moŜna w nich wyróŜnić dwa charakterystyczne maksima, które znajdują się na podobnych długościach fali. PoniŜej przedstawiono połoŜenia tych pików otrzymane poprzez dopasowanie dwóch funkcji Gaussa do otrzymanych widm. 81 14 Dopasowanie podwójnej funkcji Gaussa y=y0 + (A/(w*sqrt(PI/2)))*exp(-2*((x-xc)/w)^2) 12 Chi^2/DoF = 0.37783 R^2 = 0.97749 NatęŜenie [j.u.] 10 y0 xc1 w1 A1 xc2 w2 A2 8 6 1.49327 633.74159 41.18366 334.61165 693.88435 96.03162 1209.05011 ±0.14103 ±0.40865 ±1.67017 ±34.96638 ±1.83558 ±3.74253 ±68.22137 4 2 0 Krew grupy 0 Rh(-) StęŜenie 50% z solą fizjologiczną (1:1) -2 450 500 550 600 650 700 750 800 850 900 Długość fali [nm] Rys. 5. 34. Widmo fluorescencji krwi grupy 0 Rh(-) wraz z dopasowaniem dwóch funkcji Gaussa. Krew grupy 0 Rh(+) Krew grupy 0 Rh(-) Tab. 11. PołoŜenia pików z dopasowania dwóch funkcji Gaussa – stęŜenia krwi z wodą destylowaną – zestawienie dla obu grup krwi. StęŜenie z rozcieńczalnikiem PołoŜenie pierwszego piku PołoŜenie drugiego piku Krew:woda [%] 1:20 1:10 1:5 1:4 1:3 1:2 1:1 2:1 3:1 4:1 5:1 1:0 1:10 1:5 1:4 1:3 1:2 1:1 2:1 3:1 4:1 5:1 1:0 5% 9% 17% 20% 25% 33% 50% 67% 75% 80% 83% 100% 9% 17% 20% 25% 33% 50% 67% 75% 80% 83% 100% 624,9 630,8 633,8 632,3 633,7 627,9 622,9 634,3 635,9 635,2 635,3 631,5 629,9 628,7 627,0 628,6 622,7 600,4 608,0 620,1 630,8 635,8 633,8 82 695,2 699,7 717,7 706,9 730,7 701,1 714,9 693,2 695,5 697,4 691,1 693,9 700,7 693,4 711,1 717,7 731,9 722,1 707,8 701,4 700,5 699,4 695,2 740 Rozcieńczalnik : H2O 0 Rh(-) 0 Rh(-) 0 Rh(+) 0 Rh(+) 720 Długość fali [nm] 700 680 PołoŜenie drugiego piku 660 PołoŜenie pierwszego piku 640 620 600 0 20 40 60 80 100 StęŜenie [%] Rys. 5. 35. Wykres zaleŜności połoŜenia pików od stęŜenia krwi z wodą – zestawienie dla obu grup krwi. W kolejnym kroku uśredniono wartości połoŜeń maksimów: ° Pierwszy pik: 628,0 ± 8,8 nm ° Drugi pik: 705,2 ± 12,1 nm Krew grupy 0 Rh(+) Krew grupy 0 Rh(-) Tab. 12. PołoŜenia pików z dopasowania dwóch funkcji Gaussa – stęŜenia krwi z solą fizjologiczną – zestawienie dla obu grup krwi. StęŜenie z rozcieńczalnikiem PołoŜenie pierwszego piku PołoŜenie drugiego piku Krew:sól fizjologiczna [%] 1:10 1:5 1:4 1:3 1:2 1:1 2:1 3:1 4:1 5:1 1:0 1:10 1:5 1:4 1:3 1:2 1:1 2:1 4:1 5:1 1:0 9% 17% 20% 25% 33% 50% 67% 75% 80% 83% 100% 9% 17% 20% 25% 33% 50% 67% 80% 83% 100% 634,1 635,6 635,1 635,4 637,9 636,4 634,6 643,8 636,4 635,8 634,7 630,3 634,7 642,7 634,7 638,0 632,9 632,5 635,8 638,8 633,3 83 683,8 687,3 686,9 685,5 693,1 693,6 687,1 702,5 691,1 690,0 693,6 687,7 693,4 695,9 696,5 698,4 691,8 692,9 698,7 692,7 695,8 Rozcieńczalnik : sól fizjologiczna 0 Rh(-) 0 Rh(-) 0 Rh(+) 0 Rh(+) 700 690 Długość fali [nm] 680 PołoŜenie drugiego piku 670 660 650 PołoŜenie pierwszego piku 640 630 0 20 40 60 80 100 StęŜenie [%] Rys. 5. 36. Wykres zaleŜności połoŜenia pików od stęŜenia krwi z solą fizjologiczną – zestawienie dla obu grup krwi. W kolejnym kroku uśredniono wartości połoŜeń maksimów: ° Pierwszy pik: 635,9 ± 3,1 nm ° Drugi pik: 692,3 ± 4,7 nm Widmo stęŜenia 3:1 z solą fizjologiczną dla krwi grupy 0 Rh(+) wykluczono z analiz, gdyŜ wynik był zaburzony przez błąd systematyczny. Prawdopodobnie kuweta była nierównomiernie ustawiona, lub na ściance pojawiły się jakieś zabrudzenia, które mogły zwiększyć poziom tła od linii wzbudzenia (tzw. „ogon” od źródła światła 405 nm) i mocno zniekształciły kształt widma. Widoczne jest, Ŝe połoŜenia pików w przypadku rozcieńczania w soli fizjologicznej pokrywają się w granicy błędu. Występują nieznaczne odchylenia. Natomiast przy zastosowanie jako rozcieńczalnika wody destylowanej, powoduje większy rozrzut w połoŜeniach pików. Widać, iŜ połoŜenia dwóch omawianych pików są do siebie zbliŜone we wszystkich analizowanych widmach. Na niewielkie rozbieŜności moŜe wpływać dopasowanie dwóch funkcji Gaussa (w programie Origin 7,5), które w przypadku bardzo słabych widm (jak stęŜenie 1:1 z wodą) mogą nie być dokładne. Widma otrzymane po rozcieńczeniu z wodą wykazywały mniejsze natęŜenie i były zniekształcane przez szum. Mogło to równieŜ wpłynąć na niedokładne dopasowania dwóch funkcji Gaussa. 84 PoniŜej przedstawiono w sposób zbiorczy połoŜenia obu pików dla wszystkich omawianych widm: 740 PołoŜenie drugiego piku pierwszy pik (0 Rh(-) -> woda) drugi pik (0 Rh(-) -> woda) pierwszy pik (0 Rh(+) -> woda) drugi pik (0 Rh(+) -> woda) pierwszy pik (0 Rh(-) -> sól fizj.) drugi pik (0 Rh(-) -> sól fizj.) pierwszy pik (0 Rh(+) -> sól fizj.) drugi pik (0 Rh(+) -> sól fizj.) 720 Długość fali [nm] 700 680 660 640 620 600 PołoŜenie pierwszego piku 0 20 40 60 80 100 StęŜenie [%] Rys. 5. 37. Wykres zaleŜności połoŜenia pików od stęŜenia krwi z rozcieńczalnikami dla obu grup krwi. Widać, iŜ połoŜenia pików dla obu rozcieńczalników pokrywają się (po uwzględnieniu odchylenia standardowego) z wyjątkiem drugiego piku z H2O. Dopasowanie dwóch funkcji Gaussa dobrze przewiduje zachowanie się widma w przypadku gdy widmo składa się z dwóch nachodzących na siebie pików. Jest to przybliŜenie, które pozwala przybliŜać zachowanie się układu. Widmo fluorescencji krwi moŜe posiadać większą liczbę nakładających się wzajemnie pików, gdyŜ po wzbudzeniu moŜe następować sekwencja przejść elektronowo – oscylacyjnych, generujących dodatkowe składowe widma. Struktura moŜe wynikać z poziomów oscylacyjnych czy teŜ ich populacji. PrzybliŜenie, które zastosowano pozwala na uproszczenia i dalsze ilościowe analizy widm. Z powyŜszych analiz wynika, iŜ widma posiadają charakterystyczne dwa piki. Pierwsze maksimum przypada na długość ~635 nm dla wszystkich badanych próbek. Badany koncentrat krwinek czerwonych, zawiera erytrocyty. MoŜliwe jest, iŜ widmo, które jest obserwowane powstaje w wyniku uzyskiwania silnie fotoczułej substancji endogennej protoporfiryny IX [41], będącej podstawą budowy hemu a za razem hemoglobiny (obecnej w erytrocytach). PPIX ma najsilniejszy pik fluorescencji właśnie w okolicach 635 nm a maksimum absorpcji przypada na długość 405 nm – czyli 85 dokładnie tam, gdzie naszą krew wzbudzaliśmy, stąd przypuszczenie, które musi być potwierdzone szeregiem szczegółowych badań. MoŜliwe równieŜ, Ŝe inny składnik, np. stosowany do utrwalania krwi (jak CPD czy Adsol) wpływa np. na maskowanie jonów Ŝelaza i wpływa znacząco na kształt i połoŜenie maksimów fluorescencji. Amplitudy pików Zmiany kształtu widm fluorescencji dla krwi moŜna najlepiej zauwaŜyć poprzez zestawienie amplitud na charakterystycznych długościach fali. Z dopasowań dwóch funkcji Gaussa do widm fluorescencji otrzymano połoŜenia dwóch maksimów. Uśredniono wartości połoŜeń pików i na wyznaczonych długościach fali analizowano amplitudy. PoniŜej przedstawiono widmo krwi, na którym naniesiono punkty, w których mierzono amplitudy. Oprócz wcześniej wspomnianych połoŜeń dwóch maksimów, zmierzono równieŜ amplitudy na „zboczach” pasma fluorescencji krwi jak i częściach centralnych widm. Najbardziej interesujące są jednakŜe długości fali (B) 635,9 oraz (C) 692,3 nm. Otrzymano je z dopasowań dwóch funkcji Gaussa dla pomiarów fluorescencji krwi w zaleŜności od stęŜenia w soli fizjologicznej. Próby analizy amplitud widm na innych długościach fali nie dały bardziej regularnych zaleŜności, więc nie przedstawione ich w niniejszej pracy. T 10 C T = 575 nm E = 605 nm A = 628 nm B = 636 nm F = 665 nm C = 692 nm D = 706 nm G = 740 nm 740 nm 665 nm G 605 nm 6 Krew grupy 0 Rh(-) StęŜenie : 100% D E 8 NatęŜenie [j.u.] A B F 4 450 500 550 600 700 706 nm 636 nm 650 692 nm 0 628 nm 575 nm 2 750 800 850 900 Długość fali [nm] Rys. 5. 38. Widmo fluorescencji krwi grupy 0 Rh(-) z zaznaczonymi punktami, w których analizowano amplitudy. 86 Tab. 13. PołoŜenia długości fali, dla których analizowano amplitudy widm. Oznaczenie: Długość fali T 575 nm wartość przyjęta za stały poziom tła E 605 nm krótkofalowe zbocze pasma fluorescencji A 628 nm B 636 nm F 665 nm C 692 nm D 706 nm G 740 nm I PIK średnia dla rozcieńczania z wodą destylowaną średnia dla rozcieńczania z solą fizjologiczną centralna część widma II PIK średnia dla rozcieńczania z solą fizjologiczną średnia dla rozcieńczania z wodą destylowaną długofalowe zbocze pasma fluorescencji Amplitudy pików dla obu grup krwi oraz róŜnych rozcieńczalników przedstawiono w tab. 14 – 17. Zestawiono w nich równieŜ róŜne stosunki amplitud. Skupiono uwagę na amplitudy na długościach fali (B) 635,9 oraz (C) 692,3 nm. PoniŜej (rys. 5.39. i 5.40.) przedstawiono stosunki amplitud na wcześniej wspomnianych długościach fal po odjęciu amplitudy pochodzącej od tła (T) 575 nm zgodnie z wzorem 40 35 30 25 20 15 10 5 0 -5 -10 -15 -20 -25 -30 -35 -40 -45 -50 0 Rh(-) rozcieńczalnik: woda 0 Rh(+) rozcieńczalnik: woda 0 20 40 60 80 Stosunek amplitud pików (B-C)/(B-T) [%] Stosunek amplitud pików (B-C)/(B-T) [%] (B-C)/(B-T). 0 Rh(-) rozcieńczalnik: sól fizjologiczna 0 Rh(+) rozcieńczalnik: sól fizjologiczna 30 20 10 0 -10 0 100 20 40 60 80 100 StęŜenie [%] StęŜenie [%] Rys. 5. 39. Stosunki amplitud (B-C)/(B-T) w zaleŜności od stęŜenia z wodą – zestawienie dla dwóch grup krwi. 40 Rys. 5. 40. Stosunki amplitud (B-C)/(B-T) w zaleŜności od stęŜenia z solą fizjologiczną – zestawienie dla dwóch grup krwi. W kolejnej części przedstawiono stosunki amplitud (B-T)/(C-T) badanych widm. Zestawiając z powyŜej przedstawionym sposobem analizy, wydaję się lepszym zastosowaniem przedstawianie stosunków (B-T)/(C-T), czyli amplitud I do II piku po odjęciu od nich tła. Wykazują one mniejszy rozrzut, przez co wyraźniej widoczne są zaleŜności między badanymi próbkami. 87 160 Krew grupy 0 Rh(-) rozcieńczalnik : woda Krew grupy 0 Rh(+) rozcieńczalnik : woda 140 Stosunek amplitud pików (B-T)/(C-T) [%] Stosunek amplitud pików (B-T)/(C-T) [%] 150 130 120 110 100 90 80 70 Krew grupy 0 Rh(-) rozcieńczalnik : sól fizjologiczna Krew grupy 0 Rh(+) rozcieńczalnik : sól fizjologiczna 150 140 130 120 110 100 90 60 0 20 40 60 80 100 0 20 40 Rys. 5. 41. Stosunki amplitud (B-T)/(C-T) w zaleŜności od stęŜenia z wodą – zestawienie dla dwóch grup krwi. 80 100 Rys. 5. 42. Stosunki amplitud (B-T)/(C-T) w zaleŜności od stęŜenia z solą fizjologiczną – zestawienie dla dwóch grup krwi. 2 3 Y =191,6315-4,10322 X+0,06312 X -3,17097E-4 X 2 3 Y =177,91728-4,26285 X+0,06953 X -3,56062E-4 X 160 Stosunek amplitud pików (B-T)/(C-T) [%] 60 StęŜenie [%] StęŜenie [%] 150 140 130 0 Rh(-) 120 110 0 Rh(+) 100 90 Rozcieńczalnik : Sól fizjologiczna 0 20 40 60 80 100 StęŜenie [%] Rys. 5. 43. Stosunki amplitud (B-T)/(C-T) w zaleŜności od stęŜenia z solą fizjologiczną – zestawienie dla dwóch grup krwi wraz z krzywymi aproksymującymi dane. Punkty odpowiednich stosunków amplitud w przypadku rozcieńczania z solą fizjologiczną wykazują pewną róŜnicę względem siebie w zaleŜności od czynnika Rh. Statystycznie, gdyby wszystkie punkty były wymieszane (wykazywały większy rozrzut) nie moŜna by było mówić o jakimkolwiek związku (jak w przypadku rozcieńczania z wodą destylowaną). JednakŜe, w przypadku tak małej ilości próbek nie moŜna określić błędu pomiarowego, co nie pozwala na jednoznaczną odpowiedź dotyczącą korelacji z czynnikiem Rh. PoniŜej (rys. 5.44.) przedstawiono wykres zaleŜności pomiędzy stęŜeniem a stosunkiem amplitud (C-T)/(B-T) wraz 88 z aproksymowanymi wielomianami przybliŜającymi tą zaleŜność. Widać charakterystyczną zbieŜność do punktów odpowiadającym maksymalne i minimalne stęŜenie krwi. 2 Stosunek amplitud pików (B-T)/(C-T) [%] 3 Y =185,13328-4,22345 X+0,06745 X -3,44241E-4 X 2 3 Y =166,90774-3,75301 X+0,04735 X -1,71454E-4 X 160 150 140 130 120 110 sól fizjologiczna 100 90 80 70 woda destylowana 60 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 StęŜenie [%] Rys. 5. 44. Stosunki amplitud (B-T)/(C-T) w zaleŜności od stęŜenia z wodą destylowaną oraz solą fizjologiczną – zestawienie dla dwóch grup krwi wraz z krzywymi aproksymującymi dane. Na wykresach widoczne jest, iŜ wraz ze wzrostem stęŜenia (krwi w rozcieńczalniku), stosunki amplitud zbiegają się do punktu odpowiadającemu nie rozcieńczonej krwi (100%). Podobnie jest w przypadku zwiększania ilości rozcieńczalnika, im mniejsze stęŜenie krwi, tym bardziej stosunki amplitud zbiegają się do jednego punku odpowiadającemu widmu samego rozcieńczalnika (który nie wykazuje fluorescencji). Wyraźnie widoczne jest, iŜ woda destylowana inaczej oddziałuje z krwią aniŜeli sól fizjologiczna. Wyraźna róŜnica pomiędzy widmami od tych rozcieńczalników jest bardzo interesująca i wymaga dalszych badań, które określą jakie procesy są za nie odpowiedzialne. Widma fluorescencji krwi, które przedstawiono w poprzednich częściach są trudne do interpretacji, dlatego zaproponowano analizę amplitud na pewnych charakterystycznych długościach fali. SłuŜyło to poprawieniu „kontrastu” w wynikach i jak moŜna zauwaŜyć z przedstawionych wykresów, wykazują większą regularność i są mniej podatne na szumy widoczne na samych widmach. Przedstawione powyŜej analizy wydają się być poprawne, ale brak odniesień w literaturze, powoduje, iŜ wiąŜą się z tym wielkie trudności. Nie ma „standardów”, które pozwoliłyby na jednoznaczny sposób analiz. Brakuje równieŜ odniesień do 89 porównania samego kształtu widm. Literatura związana z fluorescencją krwi jest bardzo uboga, a co się z tym wiąŜe, sposób pomiaru i przedstawiania wyników (np. badanie połoŜeń pików, czy amplitud) nie jest ściśle określony. Dopiero rozszerzone pomiary widm fluorescencji uwzględniające szereg kombinacji róŜnorodnych próbek jak i rozcieńczalników być moŜe pozwoli wyznaczyć najłatwiejszą i najbardziej dogodną metodę analiz. Niniejsza praca przedstawia jedna z wielu moŜliwości reprezentacji pomiaru widm fluorescencji, aczkolwiek najwaŜniejszym elementem niniejszej pracy było znalezienie sposobu rejestracji widm. 5.4.2. Wzbudzenie laserem o długości fali 415 nm Oksyhemoglobina, która występuje we krwi wykazuje największą absorpcję przy 414 nm [37], jednakŜe pomimo zastosowania światła laserowego o długości 415 nm nie obserwowano fluorescencji. Pasmo absorpcyjne oksyhemoglobiny na 414 nm nie jest bardzo wąskie, więc przy wzbudzaniu 415 nm proces absorpcji mógł zajść. Doświadczenie pokazuje, Ŝe dana próbka nie fluoryzuje. MoŜliwe, jednak, Ŝe badana próbka nie posiadała oksyhemoglobiny albo jej stęŜenie było zbyt niskie, aby obserwować jakiekolwiek efekty. MoŜliwe jest równieŜ, iŜ aparatura pomiarowa nie była wystarczająco czuła. Schemat pomiarowy przedstawiono na rys. 5.45. Rys. 5. 45. Schemat oświetlania krwi za pomocą lasera o długości fali 415 nm. Nie obserwowano fluorescencji. 90 StęŜenie z rozcieńczalnikiem Krew : rozcieńczalnik [%] 1:10 9% 1:5 17% 1:4 20% 1:3 25% 1:2 33% 1:1 50% 2:1 67% 3:1 75% 4:1 80% 5:1 83% 1:0 100% T 575,0 nm 1,2 1,1 0,1 0,3 1,4 1,2 1,1 1,0 0,2 1,2 1,1 E 605,0 nm 2,6 1,9 1,8 1,8 1,9 1,5 1,4 1,5 1,7 1,9 4,1 A 628,0 nm 3,5 2,5 2,4 2,2 2,1 1,7 1,7 2,0 2,6 3,2 7,5 B 635,9 nm 3,7 2,6 2,5 2,3 2,2 1,7 1,8 2,3 3,0 3,6 8,2 F 665,0 nm 3,4 2,6 2,5 2,4 2,6 1,8 1,9 2,4 3,4 4,1 8,6 C 692,3 nm 3,0 2,6 2,5 2,5 2,1 1,9 2,1 2,8 3,8 4,6 8,9 D 705,7 nm 2,8 2,5 2,5 2,5 2,2 2,0 2,1 2,8 3,9 4,7 8,7 G 740,0 nm 2,0 1,0 2,0 2,1 1,9 1,8 1,8 2,2 3,0 3,5 5,9 144% 99% 96% 86% 86% 59% 58% 52% 66% 58% 85% 140% 102% 100% 91% 106% 74% 69% 74% 78% 71% 91% 28,4% 2,0% -0,4% -9,9% 5,3% -36,0% -45,6% -35,4% -28,0% -40,7% -9,9% (B-C)/(B-T) 32,5% 29,1% 23,9% 5,1% 1,5% -11,8% -32,2% -24,4% -18,6% -15,5% -1,6% -3,8% 158% 143% 134% 105% 101% 78% 54% 75% 72% 75% 94% 89% (A-T)/(D-T) (B-C)/(B-T) (A-T)/(D-T) (B-T)/(C-T) T E A B F C D StęŜenie z G 575,0 605,0 628,0 635,9 665,0 692,3 705,7 740,0 (B-T)/(C-T) rozcieńczalnikiem nm nm nm nm nm nm nm nm Krew : rozcieńczalnik [%] 1:20 5% 1,2 2,7 3,3 3,2 2,9 2,6 2,5 1,9 148% 1:10 9% 1,3 2,8 3,7 3,8 3,5 3,1 3,0 2,3 141% 1:5 17% 1,5 2,7 3,5 3,6 3,5 3,1 3,0 2,4 131% 1:4 20% 1,3 2,1 2,6 2,7 2,7 2,6 2,5 2,1 105% 1:3 25% 1,4 2,1 2,6 2,7 2,7 2,7 2,6 2,1 102% 1:2 33% 1,4 2,0 2,3 2,4 2,5 2,5 2,5 2,2 89% 1:1 50% 1,4 1,7 1,9 2,0 2,1 2,2 2,3 2,1 76% 2:1 67% 1,4 2,2 3,2 3,4 3,7 3,9 3,8 2,9 80% 3:1 75% 1,6 2,7 4,4 5,0 5,4 5,6 5,6 4,1 84% 4:1 80% 1,7 3,1 5,1 5,7 6,1 6,3 6,3 4,6 87% 5:1 83% 1,0 3,8 7,8 8,7 9,1 8,8 8,2 5,2 98% 1:0 100% 0,3 4,1 8,2 9,1 9,3 9,4 9,2 6,2 96% Tab. 14. Zestawienie amplitud fluorescencji na róŜnych długościach fali dla krwi grupy 0 Rh(-) dla róŜnych stęŜeń z H2O. Tab. 15. Zestawienie amplitud fluorescencji na róŜnych długościach fali dla krwi grupy 0 Rh(-) dla róŜnych stęŜeń z H2O. Krew grupy 0 Rh(-) Rozcieńczalnik : H2O Krew grupy 0 Rh(+) Rozcieńczalnik : H2O StęŜenie z rozcieńczalnikiem Krew : rozcieńczalnik [%] 1:10 9% 1:5 17% 1:4 20% 1:3 25% 1:2 33% 1:1 50% 2:1 67% 4:1 80% 5:1 83% 1:0 100% T 575,0 nm 1,1 0,9 1,6 0,5 1,1 1,2 1,5 1,2 1,5 1,2 E 605,0 nm 5,7 7,0 6,3 4,5 4,5 5,1 4,9 4,0 5,7 3,9 A 628,0 nm 8,7 11,7 11,0 8,5 8,6 9,6 8,8 7,3 10,4 7,5 92 B 635,9 nm 9,0 12,3 11,6 9,2 9,3 10,4 9,5 8,0 11,8 8,1 F 665,0 nm 8,0 11,7 11,3 9,3 9,6 10,6 9,8 8,5 11,5 8,7 C 692,3 nm 6,6 9,9 10,1 8,8 9,4 10,5 9,8 8,7 11,1 8,8 D 705,7 nm 6,0 8,9 9,5 8,3 9,2 10,0 9,5 8,5 10,6 8,7 G 740,0 nm 6,8 5,5 6,3 5,5 6,1 6,6 6,2 6,7 7,0 5,8 (A-T)/(D-T) 153% 135% 120% 103% 93% 95% 91% 84% 98% 85% (B-T)/(C-T) 145% 127% 117% 105% 99% 99% 97% 90% 107% 91% T StęŜenie z E A B F C D G 575,0 605,0 628,0 635,9 665,0 692,3 705,7 740,0 (B-T)/(C-T) rozcieńczalnikiem (A-T)/(D-T) nm nm nm nm nm nm nm nm Krew : rozcieńczalnik [%] 1:10 9% 1,4 6,4 9,0 9,2 7,9 6,3 5,7 3,5 159% 176% 1:5 17% 1,5 7,3 11,8 12,2 11,1 9,2 8,4 5,2 139% 150% 1:4 20% 1,3 7,2 12,2 12,7 11,9 10,0 9,2 5,6 132% 138% 1:3 25% 1,3 6,3 10,7 11,4 10,7 9,3 8,5 5,0 126% 131% 1:2 33% 1,4 6,3 11,7 12,4 12,2 11,3 10,6 6,8 111% 112% 1:1 50% 1,3 6,3 11,5 12,3 12,4 11,8 11,2 7,3 105% 103% 2:1 67% 1,3 5,6 10,0 10,7 10,7 10,2 9,6 5,9 107% 104% 3:1 75% 1,3 5,5 10,4 11,2 11,6 11,2 10,7 7,3 100% 97% 4:1 80% 1,4 6,4 12,0 12,7 12,8 12,1 11,4 7,3 106% 106% 5:1 83% 1,3 6,6 12,1 13,0 12,9 12,2 11,5 7,2 107% 106% 1:0 100% 0,8 4,1 8,3 9,1 9,3 9,5 9,2 6,2 95% 90% Tab. 17. Zestawienie amplitud fluorescencji na róŜnych długościach fali dla krwi grupy 0 Rh(+) dla róŜnych stęŜeń z solą fizjologiczną. Tab. 16. Zestawienie amplitud fluorescencji na róŜnych długościach fali dla krwi grupy 0 Rh(-) dla róŜnych stęŜeń z solą fizjologiczną. Krew grupy 0 Rh(-) Rozcieńczalnik : sól fizjologiczna Krew grupy 0 Rh(+) Rozcieńczalnik : sól fizjologiczna 30,8% 21,2% 14,7% 5,0% -0,8% -1,1% -3,4% -10,9% 6,7% -10,2% (B-C)/(B-T) 37,3% 27,8% 24,2% 20,8% 10,2% 4,9% 6,2% 0,3% 5,5% 6,9% -5,4% (B-C)/(B-T) 6. Podsumowanie NajwaŜniejszą częścią pracy zawartej w tym opracowaniu było zbudowanie układu pomiarowego, który pozwoliłby na rejestracje widm fluorescencji krwi i znalezieniu odpowiednich parametrów pomiarowych, tak by moŜna było w dalszym etapie prowadzić ilościowe badania w tej niezbyt jeszcze popularnej tematyce. Testem poprawności aparatury było zmierzenie widm fluorescencji krwi przy wykorzystaniu dwóch prostych i łatwo dostępnych rozcieńczalników – wody destylowanej („niszczącej” widma”) oraz soli fizjologicznej (nie wpływającej tak destruktywnie na widma fluorescencji). Trudno sprecyzować, jaki wpływ mają te substancje na zachowanie się molekuł, ale uzyskane wyniki wykazują wyraźne zaleŜności od stosowanych rozcieńczalników. 6.2. Wyniki i wnioski Dzięki zastosowaniu bardziej czułej aparatury udało się zarejestrować słabe widmo fluorescencji krwi. Wiązało się to jednakŜe z dodatkowymi trudnościami – wymagało zarówno kalibracji spektralnej jak i wyznaczenia czułości kamery CCD w zaleŜności od długości fali. Natomiast zastosowanie diod LED do badań wymagało ich wcześniejszego scharakteryzowania, zbadania pasma, w którym emitują światło, a takŜe rozkładu mocy jak i natęŜenia w zaleŜności od odległości. Następnie przeanalizowano dwie grupy krwi 0 Rh(-) oraz 0 Rh(+). Badano wpływ rozcieńczalników (wody destylowanej i soli fizjologicznej) przy róŜnych stęŜeniach na widma fluorescencji. ZauwaŜono ich duŜy wpływ na kształt widm, w których moŜna obserwować dwa charakterystyczne maksima połoŜone w paśmie Q na długościach fali ~635 nm i ~692 nm. Zbadano równieŜ amplitudy na wcześniej wspomnianych długościach fali i zestawiono je dla wszystkich badanych próbek. Przedstawiono analizę, która wydawała się być najlepsza. Brak odniesień w literaturze, powoduje, iŜ badania oraz interpretacje są bardzo trudne, a odpowiedź na pytanie, jakie elementy badanej próbki krwi fluoryzują, jest praktycznie niemoŜliwe. Wymaga to dalszych bardzo szerokich i szczegółowych badań. Analiza, którą przedstawiono, wydaje się być słuszna, aczkolwiek dopiero rozszerzone badania, uwzględniające większą i bardziej róŜnorodną ilość próbek być moŜe pozwoli na precyzyjniejszą analizę, a za razem zaowocuje łatwym w obsłudze narzędziem diagnostycznym. 6.3. Ulepszenie aparatury Najtrudniejszym elementem pracy przedstawionej w pracy było zbudowanie układu pomiarowego. Podczas licznych modyfikacji dobierano coraz to lepsze warunki pracy, w których otrzymywano widma fluorescencji krwi. W trakcie prowadzenia badań zauwaŜono, iŜ w układzie pomiarowym naleŜy wprowadzić kilka ulepszeń, które pozwoliłyby na dokładniejsze prowadzenie pomiarów. W pierwszej kolejności naleŜy bardziej ustabilizować uchwyt utrzymujący kuwetę, w taki sposób, aby nawet w minimalnym stopniu nie zmieniało się jej połoŜenie. WaŜne jest równieŜ jeszcze dokładniejsze wyciemnienie aparatury. Przypuszczalnie nawet najmniejsze zabrudzenia kuwety mogą negatywnie wpływać na kształt widm, na co naleŜy zwrócić szczególną uwagę, a co wiąŜe się z potrzebą przygotowywania próbek w pomieszczeniu (albo jego najbliŜszym sąsiedztwie) w którym wykonywane są pomiary. Wyeliminuje to zabrudzenia, które mogą powstawać podczas przenoszenia kuwet z krwią. 6.4. Dalsze plany Literatura związana z fluorescencją krwi jest bardzo uboga, w związku z tym powstaje wiele moŜliwości jak i nasuwa się wiele pytań dotyczących zjawiska fluorescencji krwi. Badania takie mogą mieć szerokie zastosowanie w PDD. NajwaŜniejszym elementem jest zwiększenie i rozszerzenie badań dotyczących pomiaru fluorescencji krwi. Zwiększenie ilości próbek pozwoli na uzyskanie lepszej statystyki, a wyniki będą bardziej wiarygodne i będzie moŜna wywnioskować o charakterze fluorescencji, a takŜe moŜliwościach zastosowań diagnostycznych. W ciągu najbliŜszych badań naleŜałoby zbadać zmiany fluorescencji krwi w zaleŜności od róŜnych grup krwi, sprawdzić wyniki fluorescencji krwi osób z anemią, 94 z róŜnymi zmianami chorobowymi równieŜ nowotworowymi, które oparte były np. na badaniach histopatologicznych. WaŜnym elementem jest równieŜ wpływ przechowywania krwi, zmian zaleŜnych od temperatury, substancji utrwalających czy antykrzepliwych. Przyjmowanie leków przez osoby od których pobrano krew powinno być uwzględniane podczas badań i naleŜy zwrócić na ten aspekt szczególną uwagę, gdyŜ moŜliwe, iŜ takie substancje silnie wpływają na widma fluorescencji [32]. Następnie moŜna sprawdzić wpływ substancji powodujących niedobór Ŝelaza (czyli przypuszczalnie większą ilość PPIX we krwi) takie jak zatrucia ołowiem. Badania moŜna równieŜ prowadzić przy wzbudzaniu róŜnymi długościami fali z zakresu pasma Soreta, moŜna teŜ oświetlić kuwetę pod róŜnymi kątami a za razem badać procesy reabsorpcji promieniowania. 95 Literatura: [1] Gudowska-Nowak E., Demitologizacja symboli, czyli o wampirach, nanorurkach i tajemnicach porfiryn, Instytut Fizyki UJ, FOTON 93, Lato 2006, str. 22-29 [2] Encyclopedia of Medicine by Robert Scott Dinsmoor http://www.findarticles.com/p/articles/mi_g2601 [3] Kral V., Kralova J., Kaplanek R., Briza T., Martasek P., Quo vadis porphyrin chemistry?, Physiol. Res. 55 (Suppl. 2): S3-S26, 2006 [4] Podbielska H., Sieroń A., Stręk W., Diagnostyka i terapia fotodynamiczna, Wyd. Med. Urban & Partner, Wrocław 2004 [5] Gabrecht T., Clinical Fluorescence Spectroscopy and Imaging for the Detection of Early Carcinoma by Autofluorescence Bronchoscopy and the Study of the Protoporphyrin IX Pharmacokinetics in the Endometrium, Universität Bielefeld, Allemagne et de nationalité allemande, Lausanne, EPFL 2006, chapter 1, p.1-22 [6] Gawlik W., Zastosowanie światła laserowego w diagnostyce i terapii, w „Fizyczne metody diagnostyki medycznej i terapii” p. red. Hrynkiewicza, A.Z. i Rokity, E., PWN, 2000, Warszawa, str. 157-184 [7] Ziętek B., Optoelektronika, Uniwersytet Mikołaja Kopernika.Toruń, Wydaw. UMK, 2004 [8] Allison R. R., Downie G. H., Xin-Hua Hu, Childs JH C., Cuenca R., Sibata C. H., Photodiagnosis and Photodynamic Therapy (2004) Photosensitizers in clinical PDT, Photodiagnosis and PhotodynamicTherapy (2004) p. 27-34 [9] Graczykowa A., Fotodynamiczna metoda rozpoznawania i leczenia nowotworów, w „Biocybernetyka i inŜynieria biomedyczna t. 9 – Fizyka medyczna” p. red. Nałęcza M., red. tomu Pawlicki G., Polska Akademia Nauk., Wa-wa : Akademicka Oficyna Wydawnicza EXIT, 2002. rozdz. 10.4., str. 471-510 [10] Booth K., Hill. S., Optoelektronika, Wa-wa : Wydaw. Komunikacji i Łączności, 2001 [11] Spears R., Serur J., Shropshire D., Paulin S., Fluorescence of Experimental Atheromatous Plaques with Hematoporphyrin Derivative, J. Clin. Invest., 96 The American Society for Clinical Investigation, Inc., Volume 71, February 1983, p. 395-399 [12] Whittaker A. G., Mount A. R., Chemia fizyczna - Krótkie Wykłady, Wa-wa, PWN, 2003, str. 261-267 [13] Jóźwiak Z., Bartosz G., Biofizyka - wybrane zagadnienia wraz z ćwiczeniami, PWN, Wa-wa 2005 [14] Hames B. D., Hooper N. M., Houghton J. D., Biochemia – Krótkie wykłady, Wawa, PWN, 2000, str. 44-51 [15] Grossweiner L. I., Singlet Oxygen: Generation and Properties, Internet Photochemistry & Photobiology http://www.photobiology.com/educational/len2/singox.html [16] Yamaguchi Sh., Sasaki Y., Spectroscopic determination of very low quantum yield of singlet oxygen formation photosensitized by industrial dyes, Journal of Photochemistry and Photobiology A: Chemistry 142 (2001), p. 47-50 [17] Bilski P., Chignell C.F., Optimization of a pulse laser spectrometer for the measurement of the kinetics of singlet oxygen O2(1g) decay in solution, Journal of Biochemical and Biophysical Methods, Volume 33, Number 2, 15 November 1996, p. 73-80(8) [18] Dougherty T. J., Gomer Ch. J., Henderson B. W., Jori G., Kessel D., Korbelik M., Moan J., Peng Q., PhotodynamicTherapy, Journal of the National Cancer Institute, Vol.90, No.12, June17, 1998, p. 889-904 [19] Balcerzyk A., Chemia medyczna, p. red. śak I.; Katowice : Śląska Akademia Medyczna, 2001. rozdz 17. [20] Dargiewicz-Nowicka J., Radzki S., Chemi- i biosensory optyczne wykorzystujące porfiryny, Acta Bio-Optica et Infomatica Medica, Vol. 8, 2002, s. 119-131 [21] Centre for Photobiology and Photodynamic Therapy website at Leeds University, Types of Photosensitisers, http://www.bmb.leeds.ac.uk/pdt/individualPs.htm [22] Kramer-Marek G, Serpa C., Szurk A., Widel M., Sochanik A., Snietura M., Kus P., Nunes R. M. D., Arnaut L. G., Ratuszna A., Spectroscopic properties and photodynamic effects of new lipophilic porphyrin derivatives: Efficacy, localisation and cell death pathways., J. Photochem. and Photobiol. B: Biol. 2006, Vol. 84, p. 1-14. 97 [23] Lipiński M.I., Jeromin L.M., Fotodynamiczna diagnostyka i terapia nowotworów pęcherza moczowego, Klinika Urologii z Pracownią Liotrypsji Uniwersytetu Medycznego w Łodzi str. 131 - 137 [24] Gustafsson U., Palsson S., Svanberg S., Compact fiber-optic fluorosensor using a continuous - wave violet diode laser and an integrated spectrometer, Review of Scientific Instrumenst Vol. 71, No. 8, August 2000, p. 3004-3006 [25] Grieb P., Kwas 5-aminolewulinowy (ALA) i jego zastosowania w neurochirurgii, Neurologia i Neurochirurgia Polska 2004; 38, 3: str. 201-207 [26] Brancaleon L, Moseley H., Laser and non-laser light sources for photodynamic therapy, Lasers Med Sci 2002, p. 173-186 [27] CEZAR - INTERNATIONAL GROUP, Photons Technology Division: informacje o sondach medycznych: www.cezarint.pl/pl/photonic/sondamed.htm [28] Whela H. T., Buchmannla E. V. , Whelan N. T., Turnerla S. G., Cevenini V., Stinson H., Ignatius R., Martin T., Cwiklinski J., MeyerIc G. A., Hodgson B., Gould L., Kanel M., Chen G., Caviness J., Light Emitting Diode Medical Applications From Deep Space to Deep Sea, Space Technology and Applications International Forum 2001, [29] Drug Information Online http://www.drugs.com/cons/photofrin.html [30] Mayo Clinic: http://www.mayoclinic.com/health/drug-information/DR601139 [31] RxList The Internet Drug List http://www.rxlist.com/cgi/generic/photofrin_ad.htm [32] Masilamani V., Al-Zahrani K., Al-Salhi M., Al-Diab A., Al-Ageily M., Cancer diagnosis by autofluorescence of blood components, Journal of Luminescence 109 (2004), p. 143-154 [33] Silva D. P, Blood and blood cells, Universidade Fernando Pessoa: http://www2.ufp.pt/~pedros/qfisio/blood.htm [34] Howland R., Benatar L., STM/AFM Mikroskopy ze skanującą sondą - elementy teorii i praktyki, tłum. M. Woźniak, Warszawa 2002 [35] Boulnois J. L., Photophysical processes in recent medical laser developments: A review, Lasers in Medical Science 1(1), p.47-66 (1986) [36] Eker Ch., Optical characterization of tissue for medical diagnostics, Doctoral Thesis, Department of Physics, Lund Institute of Technology, October 1999, p.28-29 98 [37] Prahl S., Optical Absorption of Hemoglobin, Oregon Medical Laser Center: http://omlc.ogi.edu/spectra/hemoglobin/summary.html [38] Łętowska M., Rosiek A., Komórkowe składniki krwi w onkologii, Onkologia w praktyce klinicznej 2006, tom 2, nr 1, str. 7-10 [39] Karthikeyan K., Masilamani V., Govindasamy S., Spectrofluorimetric Detection of DMBA-Induced Mouse Skin Carcinoma; Pathology Oncology Research; Vol 5, No 1, 1999, p. 46-48 [40] LAN X., Gao Sh., Peng Ch., LIU Y., NI X., Fluorometic Determination of Whole Blood With Various Excitation Wavelenths, Proceedings of SPIE Vol. 5254, p. 336-340 [41] Kaestner L., A.Juzeniene, Moan J., Erythrocytes-the'houseelves'of photodynamictherapy, Photochem.Photobiol.Sci., 2004, 3, p. 981–989 [42] Płachta A., Medyczne zastosowania promieniowania laserowego w niskoenergetycznej terapii laserowej. Instytut Fizyki UJ [43] Informacje o produktach firmy Roithner http://www.roithner-laser.com/ [44] Gawlik W., Spektroskopia optyczna UV/VIS, w: Fizyczne metody w biologii, medycynie i ochronie środowiska, p. red. Hrynkiewicz A.Z., Rokita E., PWN, 1999. str. 188-221 [45] NIST Atomic Spectra Database Lines Data http://physics.nist.gov/cgi-bin/ASD/lines1.pl [46] Hemotransfuzja, autohemotransfuzja i hemodulucja sterowana w zastosowaniu klinicznym, pod redakcja naukową: prof. dr hab. n. med. Zygmunta Antoszewskiego, dr hab. n. med. Janusza Skalskiego i dr n. med. Dariusza Maciejewskiego, Katowice 2000, str. 23-35 [47] Stryer L., Biochemia, PWN, Wa-wa 2003, str. 177 [48] Małyszko J., Zespół niewyrównania i pierwszego uŜycia dializatora, hemoliza, Problemy Lekarskie 2006; 45, 3: 122–123 99