Transcript
HIZLI VİRAL TANI TESTLERİ Prof. Dr. Neziha YILMAZ Bozok Üniversitesi Tıp Fakültesi Klinik Mikrobiyoloji ABD EKMUD-2015 Klinik Tanı Genel Belirti ve Bulgular grip benzeri belirtiler deri döküntüler Patognomonik Bulgular kızamık Koplik lekeleri Epidemiyolojik Özellikler yaş mevsimsel özellik coğrafi dağılım toplumdaki insidans, vb Viral enfeksiyonların özgül laboratuvar tanısı gerekli!!!!! Klinik tanının doğrulanması Teratojen virusler Ensefalitlerin /Atipik semptomlu hastalıkların ayırıcı tanısı Hastalığın tedavisi ve izlenmesi HSV,HIV,HBV,CMV Kan dönörlerinin taranması HBV,HIV,HCV, vs Epidemilerin erken saptanması Influenza, HAV, Variola,vs Laboratuvar Tanı Yöntemleri Direkt tanı yöntemleri İndirekt tanı yöntemleri Direkt Tanı Yöntemleri Işık Mikroskopi histoloji sitoloji Elektron Mikroskopi Virusun üretilmesi Antijenlerin gösterilmesi immunofluoresan/peroksidaz ELISA/EIA Lateks Ag Nukleik asitlerin tayini Molekuler testler İndirekt Tanı Yöntemleri Konakta virüse özgül antikorların araştırılması IgM IgG IgA IgG avidite serum, BOS, vb MİKROSKOPİ Sitoloji: Virus grubu! Tzanck smear HSV - VZV Elektron Mikroskobisi 50-60,000 büyütme Ağır metal tuzları ile negatif boyama Spesifik antisera ile işlem(iem) Örnekte en az 10 6 virüs partikülü olmalı Dışkı Rotavirus, Adenovirus Norwalk like viruses Astrovirus, Calicivirus Vezikül sıvısı HSV, VZV Deri kazıntısı papillomavirus, orf molluscum contagiosum Human Rotavirus Paramyxovirus (Parainfluenza) Elektronmikrografi Adenovirus Rotavirus courtesy of Linda Stannard, University of Cape Town, S.A. Elektron Mikroskobisi Yöntemi Direkt görüntü Virus karakterizasyonu Hızlı Ayrdedici Kontaminasyon riski az Pahalı Duyarlılık 106part./ml Çok sayıda örnek incelemeye uygun değil Araştırma lab. İmmün Elektron Mikroskobisi Immun Elektron Mikroskopi IEM varyantları Klasik Immun elektron mikroskopi (IEM) Örnek spesifik anti-sera ile muamele edilir Solid faz immun elektron mikroskopi (SPIEM) matriks spesifik anti-sera ile kaplanır duyarlılık ve özgüllük EM ye göre daha fazla Virüs Kültürü referans yöntem tanıda altın standart özgüllük yüksek (%100) duyarlılık düşük (%50-70) Virüsler zorunlu hücre içi organizma Canlı sistemler gerekli sitopatojenik etki (CPE) hemadsorpsiyon immunofluoresan Koryo allantoik membranda vezikül hemagglutinasyon hastalık yada ölüm Viral patogenez/ilaç ve aşı çalışmaları Embryonated Hen s Egg Bazı virusler için primer izolasyon ortamı Ag üretimi (serolojik) /Aşı hazırlanması Hücre kültürü embriyonik/karsinoma dokuları Cell Culture Bottles / Tubes Virüs identifikasyonu üretilen virus tanımlanır DFA /IFA/EIA fluorokrom ile konjuge monoklonal /poliklonal Ab Nötralizasyon tipe / gruba özgül antiserum Enterovirusler Moleküler testler Spesifik primer/ prob Cytopathic Effect (1) Cytopathic effect of enterovirus 71 and HSV in cell culture: note the ballooning of cells. (Virology Laboratory, Yale-New Haven Hospital, Linda Stannard, University of Cape Town) Cytopathic Effect (2) Syncytium formation in cell culture caused by RSV (top), and measles virus (bottom). (courtesy of Linda Stannard, University of Cape Town, S.A.) Adenovirus CPE Haemadsorption Syncytial formation caused by mumps virus and haemadsorption of erythrocytes onto the surface of the cell sheet. (courtesy of Linda Stannard, University of Cape Town, S.A.) Hücre Kültürü Avantajları nispeten duyarlı ve özgül birçok farklı virüs tespit edebilir ileri karakterizasyona imkan sağlar serotipleme, genotipleme, antiviral duyarlılık 4 hafta!!! Çok geç Hücre Kültürünün Dezavantajları Duyarlılık düşük ve örneğe bağlı canlı ortamlar gerektirir Bakteriyel kontaminasyon riski maliyet etkin değil/pahalı Zaman alıcı zahmetli, Ayırıcı tanı Tiplendirme Klinik önemi olan tüm etkenler izole edilemeyebilir Çok geç sonuçlanır 4hf bulabilir HIZLI / MODİFİYE HÜCRE KÜLTÜRLER Hücre kültürleri Hızlı hücre kültürleri CMV 48 saat Miks Hücre Kültürü Miks hücreli Shell vial kültürlerle daha fazla virus gösterilebilir R-Mix TM : mink lung + A549 RSV, parainfluenza 1-3, influenza, adenoviruses R-Mix Too: MDCK + A549 Above plus metapneumovirus E-Mix: BGMK + A549 Recent R-Mix Too vs Rhesus Monkey Kidney at PHL-Toronto 257 örnek alınmış; 194 positive İnkubasyon R-Mix shell vials 1,2 ve 5gün Tüp kültürleri 10 gün Pozitiflik oranı R-Mix ile %67.5 ; tube kültürleri %45.9 Poziflik oluşma süresi R-Mix tüplerde 1.gunde %73.3 %2 2..gun de %95.52 %25 7.günde % Günde %36 Hızlı Virus Identifikasyon ve kantitasyon yöntemleri Viral infektiviteyi ölçen testleri viral plaque assay, TCID 50 İmmunofluorescence foci assay Viral nukleik asit ve proteinlerin gösteren qpcr, immunoblotting, immunoprecipitation, hemagglutinasyon assay ELISA Viral partikül sayımına dayanan viral flow sitometry transmission electron microscopy Table 1. limitations of the present methods for virus identification and quantification. Technique viral plaque assay TCID 50, LD 50, EID 50 immunofluorescenc e foci assays Detection Principle infectivity assay infectivity assay infectivity assay Reproducibili ty Time Labour Cost poor days high inexpensive poor days high inexpensive poor days high expensive qpcr viral nucleic acid excellent hours moderate expensive immunoblotting viral protein good days moderate inexpensive immunoprecipitatio n viral protein good days moderate inexpensive ELISA viral protein good hours moderate inexpensive hemagglutination assay viral flow cytometry transmission electron microscopy viral protein good hours moderate inexpensive viral particle excellent hours high expensive viral particle excellent weeks high expensive Viral Antijenlerin Saptanması Hızlı Canlı virusa gerek yok İmmünfloresan boyama (FAT) EIA Lateks agl. Viral Antijenlerin Saptanması RSV Influenza Parainfluenza Adenovirus HSV Varicella-zoster CMV Rotavirus HBV Viral Antijenlerin Saptanması Nazofaringeal aspirat Dışkı Deri Kan RSV Influenza A and B Parainfluenza Adenovirus Rotaviruses Adenoviruses HSV VZV CMV (pp65 antijenemi testi) Viral Antijenlerin Saptanması İmmünfloresan boyama Viral Antijenlerin SAptanması FATFAT Viral Antijenlerin Saptanması CMV antijenemi testi; Periferik kan lökositleri CMV pp65 antijeni 3-4 saat Ciddi lökopenide yetersiz kalır! pp65 antijenemi testi Viral Antijenlerin Saptanması FAT RSV Influenza A HSV 1-2 Duyarlılık Özgüllük PPD NPD FAT Shellvial-IP Kon.kültür Chan EL et al. Clin Diagn Lab Immunol 2001;8: 1188 nazal yıkama örneği sitospin preparatı FAT x Hızlı hücre kült. % Virus Duyarlılık Özgüllük PPD NPD ADV Infl.A Infl.B PI.1,2, RSV Toplam Rochol C, et al. Pediatrics 2004;113:e51-e56 FAT yönteminde Örnek kalitesi çok önemli Örnekte yeteri kadar hücre olmalı yalancı negatif sonuç Deneyimli personel gerekli Çok sayıda örneğin incelenmesi zor Viral Antijenlerin Saptanması EIA Viral Antijenlerin Saptanması EIA Çok çeşitli örnek çalışılır Fazla sayıda örnek çalışılır Otomasyon Viral Antijenlerin Saptanması Membran EIA Viral Antijenlerin Saptanması Lateks aglütinasyon ELISAs/EIAs solid faz (microplate) Ab ile kaplı Antijen solid fazdaki Ab ye bağlanır İkincil enzimle-konjuge Ab eklenir Substrate ilavesiyle oluşan renk spektrofotometrik olarak ölçülür sekonder ab işaretlideğilse işaretli 3. ab kullanılabilir Sonuç çoğunlukla kalitatif bazen kantitatif ELISAs/EIAs Yeni EIAs de solid faz mikroboncuk yüzey temas alanı artar reaksiyon süresi 30dk ya iner Sensitivitesi yüksek *piko-nanomolar (10-12 to 10-9 mol/litre) viral antijeni tesbit eder Nükleik Asit Tayini Moleküler testler Polimeraz zincir reaksiyonu Klasik PCR Real-time PCR Hibridizasyon Nükleik Asit Tayini Klasik PCR PCR (2) Herbir PCR siklusunda amplikon(kopya) sayısı iki katına çıkar 20 siklustan sonra oluşan amplikon sayısı 1milyonu bulur PCR reaksiyonun özgüllük ve duyarlılığı primerlere bağlıdır. Nükleik Asit Deteksiyonu PCR genomu fazla uzun olmayan viruslerin tanısında nukleik asit temelli testler(pcr) idealdir PCR Konvansiyonel PCR ürün agaroz jelde tesbit edilir Real-time PCR- ürünler problar veya çift zincirli DNA ya bağlanan boya/ flouresan ile tesbit edilir Microarrays çip veya boncuk bazlı Nükleik Asit Tayini Real-time PCR Plato fazı Geçiş fazı Sinyal Logaritmik faz Eşik çizgisi Baz çizgisi Döngü sayısı Real-time PCR Nükleik Asit Tayini Amplifikasyonla ilişkili floresan sinyallerinin alınması için gereken siklus sayısı (Ct değeri), başlangıçtaki hedef nükleik asit miktarıyla ters orantılı Nükleik Asit Tayini Real-time PCR ürün saptama SYBR green I Fluorescense resonance energy transfer (FRET) Hibridizasyon probları Taq-man probları Molecular beacons SYBR green FRET Taq-man probları Molecular Beacons PCR-temelli olmayan Nukleik Asit Amplifikasyon Sistemleri Strand Displacement Amplification-SDA Ligase Chain Reaction-LCR Nucleic Acid Sequence-Based Amplification -NASBA Hybridization Based Assays Quantitative NATs Transcription-Mediated Amplification -TMA Molecular Beacons 1-DNA ekstraks. Tam kan Hybrid capture CMV DNA testi 4- Konjugat 2-Hedef DNA nın CMV RNA probu ile hibridizasyon 3-DNA: RNA hybridlerinin antikorla tutulması by antibody 5.Kemilüm. saptama ADV, 37 konjonktival sürüntü örneği % Test Duyarlılık Özgüllük PPD NPD H.kült FAT PCR FAT (-) diğer testler Percivalle E, et al. J Clin Virol 2003;28: 132 KHT alıcısı ADV, 5000 örnek perif. kan lökositleri Real-time PCR dışkı idrar boğaz sürüntüsü Periferik kan löokositlerinde PCR (+) İnvaziv ADV inf. göstergesi Lion T, et al. Blood 2003;102: Virolojide Moleküler Testler Etkenin tanımlanması Etkenin özelliklerinin belirlenmesi -tip/subtip, direnc, virulans Tedaviye yanıt /prognozun değerlendirilmesi -Viral yük saptanması Epidemiyolojik özellikler -filogenik analizler Moleküler testler: Avantajları Hızlı Duyarlılık yüksek latent viruslar için kantitatif testler Pek çok patojen için uygulanabiliyor Tedavi monitörizasyonu Seçilen yönteme göre kontaminasyon riski çok az MagnaPure+LightCycler Moleküler testler: Dezavantajları Çoğu standardize değil internal ve eksternal kalite kontrol uygulamaları Lab.lar arası sonuç karşılaştırması zor tanı karmaşası PCR temelli olanlarda IC kullanılmalı Rutin sonuç verirken dikkat! Pahalı Seçilen yönteme göre kontaminasyon riski fazla in house PCR Comparison between PCR and other nucleic acid Amplification Techniques Method Target Amplification Signal Amplification Thermocycling Sensitivity Commercial Examples PCR Exponential No Yes High Roche Amplicor LCR No Exponential Yes High Abbot LCX NASBA Exponential No No High Organon Teknika TMA Exponential No No High Genprobe Qß-Replicase No Exponential No High None Branched DNA No Linear No Medium Chiron Quantiplex Real time PCR ın virolojiye girmesi ile Çeşitli respiratory viruslerin hızlı identifikasyonu mümkün olmuştur Metapneumovirus Multiple coronaviruses: SARS, 229E, NL63, OC43, HKU1 Human bocavirus Polyomaviruses KI, WU Multiplex PCR Multiplex PCR ile çok sayıda virus aynı reaksiyonda araştırılabilir Çeşitli virusler aynı klinik sendroma neden olabilir -Respiratory infections 18 respiratory virusu bir testte gösterebilen ticari yöntemler geliştirilmiştir Seeplex RV/PB18 ASE Detection Multiplex PCR Sistemi 13 Respiratory Viruses Influenza A/B virus, RSV A/B, Rhinovirus, Coronavirus OC43/HKU1, coronavirus 229E/NL63, adenovirus, parainfluenza virus 1-3 bocavirus, enterovirus 5 Pneumonia causing bacteria (Mycoplasma pneumoniae, Haemophilus influenzae, Streptococcus pneumoniae, Chlamydophila pneumoniae, Legionella pneumophila). Multipleks PCR ve Sıvı mikrobead Tabanlı yöntem kullanılarak 20 İnsan Solunum VirüsününTespiti için Solunum Virüs Paneli Testi Geliştirilmesi Reverse transcriptase PCR Hedefe spesifik primer extensiyonu(tspe) Virusa spesifik oligonukleotid 21 spektrofluorometrik olarak işaretli mikrokürelere bağlı komplementar anti-tag oligonukleotid TSPE tag oligonukleotid antitag ile hibridize olur J. Mahony, et al. Development of a Respiratory Virus Panel Test for Detection of Twenty Human Respiratory Viruses by Use of Multiplex PCR and a Fluid Microbead-Based Assay JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY, Sept. 2007, p Vol. 45, No. 9 Development of a Respiratory Virus Panel Test for Detection of Twenty Human Respiratory Viruses by Use of Multiplex PCR and a Fluid Microbead-Based Assay TSPE: Target specific primer extension J. Mahony, et al. J Clin Micro; Sept. 2007, p Vol. 45, No. 9 Development of a Respiratory Virus Panel Test for Detection of Twenty Human Respiratory Viruses by Use of Multiplex PCR and a Fluid Microbead-Based Assay Biotinle işaretli TSPE ürünü streptavadin/phycoerythrin ile reaksiyona girer Flow cell with 2 lasers Red laser : spesifik boncuğu (1 per test target) green laser: virus varlığında oluşan TSPE ile ilişkili phycoerythrini gösterir ve positive sinyal verir DNA çip teknolojisi çok sayıda virüs patojen potansiyeli ilaç duyarlığı aynı zamanda tespit edebilir. Seroloji Klasik Teknikler Kompleman Fiksasyon testi(cft) Hemaglütinasyon inhibisyan testi (HAI) Nötralizasyon testi(nt) Counter immun elektroforez(cie) İmmunofloresan teknikleri(if) Yeni Teknikler Radioimmunoassay (RIA) Enzim linked İmmunoassay (ELISA) Western Blot (WB) RIBA, LIA Partikül agglütinasyon Serolojik tanının yararı virüs tipine bağlıdır Serolojik sonucun yararı her virüs için farklıdır Örneğin, kızamıkçık ve hepatit A gibi virüsler antikor gelişimi klinik semptomlarla birliktedir. Serumda spesifik IgM /yükselen IgG titreleri aktif hastalık göstergesidir Klinik hastalığın genellikle antikor yanıtından önce başladığı solunum ve ishal virüs enfeksiyonlarında serolojik tanı retrospektif olacağından yararlı değildir Serokonversiyondan aylar/yıllar sonra klinik belirtili hastalık oluşturan HIV ve kuduz virüsleriyle enfeksiyonda sadece antikor varlığı kesin tanı için yeterlidir. Serolojik tanıda dezavantaj Serokonversiyon için gereken süre uzun Humoral immun yanıt oluşmayabilir HSV genitalis gibi birçok lokal enfeksiyonda İmmunokompromise hastalarda Yalancı pozitiflikler görülebilir antijenik benzerlikler HSV ve VZV, Japanese B encephalitis ve Dengue virusleri non spesifik reaksiyonlar EMN ve SLE Ab transferi Kan ve kan ürünü alanlarda BOS Antikorları Başlıca HSV ve VZV ensefalit tanısı için kullanılır Normalde BOS ta Ab yok veya çok azdır Ab pozitif- menenjit veya meningoensefalit BOS Ab titre _1_ olması menenjit!!!!! Serum Ab titre 100 Tanı kan beyin bariyerinin sağlam olmasına dayanır Seroloji: BOS da antikor tayini: Herpesviruslar Respiratuvar viruslar İntratekal antikor sentezi olduğu gösterilmeli BOS:serum spesifik Ab BOS:serum IgG 1.5
