Transcript
I termin 2015 beta wersja.doc (59 KB) Pobierz Enzym restrykcyjny używany na ćwiczeniach: Pfo I – pierwsza litera od nazwy rodzajowej drobnoustroju – Pseudomonas; dwie kolejne od nazwy gatunkowej drobnoustroju – fluorescens; cyfra rzymska oznaczająca, jako który enzym został wyizolowany z danego szczepu – I (pierwszy enzym wyizolowany z P. fluorescens)  Absorbancja a czystość wyizolowanego DNA OD – gęstość optyczna Jeżeli A=1 to:             c=50 μg/ml dsDNA                           c=36 μg/ml ssDNA                           c=40 μg/ml RNA                           c=30 μg/ml oligonukleotydów 260/280 – zanieczyszczenie preparatu białkami (wartość prawidłowa 1,8-2,0) Jeżeli próbka DNA zanieczyszczona jest RNA to wartość A260/A280 jest bliższa 2,0, natomiast, jeżeli próbka zanieczyszczona jest białkami to wartość A260/A280 jest niższa niż 1,8. Absorpcja mierzona przy długości fali 230 odzwierciedla zanieczyszczenia pochodzące od węglowodorów, białek lub fenolu. W przypadku czystych próbek wartość A260/A230 powinna wynosić 2,2. Absorpcja mierzona przy długości fali 325 nm może być wyznacznikiem wytrąceń w roztworze lub zanieczyszczeń samej kuwety  A260/A240 – zanieczyszczenie solami x<1,4 [znalezione na anglojęzycznej stronie]  A260/A230 – zanieczyszczenie zw. organicznymi  A320 – drobiny komórkowe (tło?)  Podział enzymów restrykcyjnych Cztery typy, stosujemy II, IIs i IV  Izoschizomery – enzym x rozpoznaje i tnie sekwencję w tym samym miejscu, co prototyp  Neoschizomery – enzym x rozpoznaje tą samą sekwencję, co prototyp, ale tnie ją w innym miejscu  Prototyp – enzym restrykcyjny o określonych parametrach cięcia wyizolowany jako pierwszy Enzym x pochodzi z innego drobnoustroju niż prototyp  Odpowiedzi z artykułów:  Różnice pomiędzy strategią antysensowną a antygenową
Strategia antygenowa, polegająca na oddziaływaniu ASO z komplementarnym fragmentem dwuniciowej cząsteczki DNA i zahamowaniu powstawania transkryptu mRNA. Strategia antysensowa, zazwyczaj stosowana do zahamowania translacji zsyntetyzowanego już mRNA.  Odpowiedzi z wykładów:  Białka biorące udział w replikacji DNA: Topoizomerazy – powodują relaksację superhelikalnego DNA Gyrazy DNA – wprowadzają ujemne skręty superhelikalne Helikazy – rozplatają podwójną helisę Prymazy – syntetyzują startowy odcinek RNA SSB – stabilizują rejony jednoniciowe Polimerazy DNA – syntetyzują DNA, usuwają błędne nukleotydy Ligazy – łączą końce DNA  Przykłady mutacji dynamicznych i choroby Nie wiem co ona tu chce więc opis + choroby z konkretnymi sekwencjami jakie się powtarzają Mutacje dynamiczne – zwielokrotnienie sekwencji trójnukleotydowych w obrębie genów; często w obrębie sekwencji mikrosatelitarnych; prawdopodobna przyczyna to ślizganie się polimerazy; mutacje w niestabilnych sekwencjach DNA (czyli powtarzających się)         Choroba Huntingtona CAG         Bezład rdzeniowo-móżdżkowy CAG         Dystrofia miotoniczna CTG         Zespół kruchego chromosomu X CGG  Enzymy uczestniczące w naprawie bezpośredniej DNA Ligaza DNA – usuwa pęknięcia jednej nici DNA Alkilotransferaza – usuwa grupy alkilowe Fotoliaza DNA – usuwa dimery cyklobutylowe  Naprawa pęknięć dwuniciwych         HR – rekombinacja homologiczna = naprawa rekombinacyjna – pozwala na naprawę uszkodzeń występujących na obu niciach, niebezpieczna dla genomu bo brak matrycy umożliwiającej odtworzenie zmienionego fragmentu (masło maślane!! )         NHEJ =ŕączenie niehomologicznych końców DNA; (uczestniczy ligaza DNA IV i kompleks białkowy: białko Ku, białko XRCC4, kinaza białkowa DNA-PKCS); ryzyko połączenia niewłaściwych cząst. DNA; kilkunukleotydowa delecja    Jakie znasz metody naprawy DNA
        Rekombinacja homologiczna = naprawa rekombinacyjna         Naprawa typu BER (glikozydaza przecina wiÄ…zanie glikozydowe, usuwa uszkodzonÄ… zasadÄ™ tworzÄ…c miejsce AP, ktĂłre rozpoznaje endonukleaza i przecina wiÄ…z. fosfodiestrowe, polimeraza wypeĹ‚nia lukÄ™ a ligaza Ĺ‚Ä…czy nić odtwarzajÄ…c wiÄ…z. fosfodiestrowe) alkilowe i hydroksylowe modyfikacje zasad         Naprawa typu NER – poprzez wycinanie uszkodzonych nukleotydĂłw (usuwa duĹĽe uszkodzenia; znieksztaĹ‚ca strukturÄ™ helisy) foto-uszkodzenia, addukty DNA, wiÄ…zania sieciujÄ…ce         MMR - naprawa bĹ‚Ä™dnie sparowanych nukleotydĂłw (rozpoznajÄ… je biaĹ‚ka hMLH i hMSH2 u eukariota i Mut-S, Mut-H i Mut-L u prokariota; helikaza, egzonukleaza, polimeraza, ligaza)  Dekatenacja – rozdielenie czÄ…steczek nowo powstaĹ‚ego DNA z udziaĹ‚em topoizomerazy; zachodzi podczas terminacji replikacji snRNA – rola w wycinaniu intronĂłw  wymieĹ„ czynniki transkrypcyjne u prokariota wymienić klasy enzymĂłw transkrypcyjnych eukariota    Prokariota Eukariota Transkrypcja Inicjacja Czynnik sigma – odpowiada za GTF – ogĂłlne czynniki specyficzność wiÄ…zania transkypcyjne: TFII A, B, D, E, F, H STF – specyficzne czynniki transkrypcyjne LXR, SREBP Elongacja  S2 Terminacja Czynnik rho  Translacja inicjacja IF1, IF2, IF3 eIF 1-6       Enzymy transkrypcja  Polimeraza RNA Polimeraza I RNA - rRNA polimeraza II RNA – mRNA, snRNA Polimeraza III RNA – tRNA, rRNA, maĹ‚e jÄ…derkowe RNA           Nić matrycowa, niekodujÄ…ca, nonsensowna DNA mRNA komplementarne do nici matrycowej DNA a identyczne z niciÄ… kodujÄ…cÄ… Â
nić kodujÄ…ca, sensowna DNA   budowa polimerazy  u prokariota – cztery podjednostki z ktĂłrych dwie sÄ… identyczne a, a, b, b` u eukariota – trzy typy; posiadajÄ… co najmniej 10 podjednostek, duĹĽy rozmiar  wymieĹ„ metody hybrydyzacji: Southern Blotting – sĹ‚uĹĽy do lokalizacji konkretnej sekwencji DNA po elektroforezie. Na drodze dyfuzji DNA przenoszone jest z ĹĽelu na membranÄ™ nitrocelulozowa lub nylonowÄ…. Inkubuje siÄ™ jÄ… ze znakowanymi izotopowo sondami komplementarnymi z poszukiwanym fragmentem, ktĂłry nastÄ™pnie uwidacznia siÄ™ na zdjÄ™ciu rentgenowskim. Northern Blotting – czyli elektroforetyczno – hybrydyzacyjna detekcja transkryptĂłw. SĹ‚uĹĽy do poszukiwania sekwencji RNA i badania aktywnoĹ›ci pojedynczych genĂłw. Wykorzystuje siÄ™ w niej sondy DNA wyznakowane radioaktywnie. Western blotting – do biaĹ‚ek DNA fingerprinting, czyli metoda genetycznych odciskĂłw palcĂłw – wyizolowane DNA trawi siÄ™ odpowiednimi enzymami restrykcyjnymi, a nastÄ™pnie poddaje elektroforezie i przenosi na filtr nitrocelulozowy, gdzie Ĺ‚Ä…czÄ… siÄ™ z radioaktywnie wyznakowanymi sondami. W ten sposĂłb otrzymuje siÄ™ „genetyczne odciski palcĂłw”, czyli charakterystyczny dla danego osobnika ukĹ‚ad paskĂłw DNA. Hybrydyzacja in situ (ang. in situ hybridization ISH) Z Ĺ‚ac. in situ - w miejscu naturalnego wystÄ™powania. Znakowany polipeptyd tworzy hybrydÄ™ z komplementarnymi sekwencjami znajdujÄ…cego siÄ™ w komĂłrce kwasu nukleinowego. Metoda ta pozwala wykryć poszukiwanÄ… sekwencjÄ™ oraz zlokalizować jej poĹ‚oĹĽenie w komĂłrce i na chromosomie. Wykonuje siÄ™ jÄ… bezpoĹ›rednio na szkieĹ‚ku podstawowym po uprzedniej denaturacji DNA chromosomowego oraz sondy dla uzyskania form jednoniciowych (wysoka temperatura, formamid). Preparat oczyszcza siÄ™ z biaĹ‚ek, a w przypadku stosowania sond DNA naleĹĽy rĂłwnieĹĽ uprzednio strawić go RNazÄ…. Niezhybrydyzowane lub sĹ‚abo zhybrydyzowane fragmenty zostajÄ… wypĹ‚ukane przed uwidocznieniem. Â
 W jaki sposĂłb moĹĽe wiÄ…zać siÄ™ czynnik transkrypcyjny z DNA (motywy biaĹ‚kowe) Klasyfikacja biaĹ‚ek wiÄ…ĹĽÄ…cych DNA -         ze wzglÄ™du na domeny wiÄ…ĹĽÄ…ce DNA         HTH (helisa-skrÄ™t-helisa)         Palce cynkowe -         Ze wzglÄ™du na domeny dimeryzacji         HLH (helisa-pÄ™tla-helisa)         Zamek leucynowy  Farmakogenetyka – badanie wpĹ‚ywu pojedynczego genu na odpowiedĹş organizmu na lek, obejmujÄ…cÄ… skuteczność, bezpieczeĹ„stwo oraz interakcje miÄ™dzy lekami Â
Farmakogenomika – badanie genetycznej zmienności odpowiedzi na lek będącej wynikiem zróżnicowanej ekspresji wielu genów w kom poszczególnych tk  Metabolizm leków Enzymy I fazy: członkowie superrodziny ludzkiego chromosomu p450 (CYP); esterazy; hydrolaza epoksydu Enzymy II fazy: N-acetylotransferaza NAT1 i NAT2; glukuronylotransferaza UGT; hydrolaza epoksydu; S-transferaza glutationu GST; sulfotransferaza ST; metylotransferazy COMT   Blokowanie replikacji poprzez tworzenie połączenia pomiędzy dwoma niciami DNA lub dodanie dużych grup alkilowych uniemożliwiających postęp replikacji. Związki dołączające grupy alkilowe (najczęściej do guaniny):         Metanosulfonian metylowy MMS         Metanosulfonian etylowy EMS         Dimetylonitrozoamina   Terapeutyczne zastosowania strategii antysensu 102-119 -         leki antysensowne oddziałują z mRNA lub genem kodującym dane białko -         hybrydyzacja ASO (antysensowny oligonukleotyd – krótki, jednoniciowy fragment kwasów nukleinowych) do komplementarnego DNA lub RNA hamuje replikację/transkrypcję/translację -         Strategia antygenowa, polegająca na oddziaływaniu ASO z komplementarnym fragmentem dwuniciowej cząsteczki DNA i zahamowaniu powstawania transkryptu mRNA. Dzieje się to poprzez stabilizację trypleksu ASO/DNA przez wiązania wodorowe między zasadami trzeciej nici a zasadami purynowymi dwuniciowej cząsteczki DNA, tzw. wiązania Hoogstena. Utworzony trypleks może inhibować proces transkrypcji w zależności od miejsca hybrydyzacji poprzez uniemożliwienie tworzenia się kompleksu inicjującego DNA-polimeraza lub przez zablokowanie odczytu informacji DNA -         Strategia antysensowa, zazwyczaj stosowana do zahamowania translacji zsyntetyzowanego już mRNA. W tym przypadku ASO przyłącza się do komplementarnego fragmentu mRNA, tworząc dupleks z mRNA za pomocą wiązań typu Watsona-Cricka. W ten sposób dochodzi do zablokowania dostępu rybosomu do informacji zakodowanej w mRNA. Dupleks DNA/mRNA może również aktywować działanie endogennego enzymu, RNazy H, która przecina mRNA, uniemożliwiając w ten sposób proces biosyntezy białka przez degradację matrycy. -         Strategia rybozymowa...
Plik z chomika: krysia.b20
Inne pliki z tego folderu:
kolos 3 stary.doc (2344 KB) 11169999_1161261293899274_6084208611761011855_n.jpg (79 KB) 11146303_956343151065371_1332326212594702547_n.jpg (80 KB) 2015 termin 2.doc (19 KB) aaa.jpg (90 KB)
Inne foldery tego chomika:
artykuły i ich streszczenia do zal I II III książki
Zgłoś jeśli naruszono regulamin
Strona główna Aktualności Kontakt Dla Mediów Dział Pomocy Opinie Program partnerski
Regulamin serwisu Polityka prywatności Ochrona praw autorskich Platforma wydawców
Copyright © 2012 Chomikuj.pl
