Identyfikacja Taksonomiczna Mikroorganizmów

Transcript

Identyfikacja taksonomiczna mikroorganizmów Identyfikacja taksonomiczna mikroorganizmów Identyfikacja taksonomiczna mikroorganizmu określenie przynależności badanego organizmu do odpowiedniej jednostki taksonomicznej, najczęściej gatunku  Gatunek - populacja mikroorganizmów wykazujących wysoki stopień podobieństwa w ściśle określonym zakresie cech, a różniących się od innych gatunków tego samego rodzaju Identyfikacja taksonomiczna bakterii  Szczep – grupa drobnoustrojów potomnych jednej komórki  Szczep referencyjny – izolat danego gatunku opisany jako pierwszy i najlepiej scharakteryzowany (wzorzec)  Gatunek – wiele szczepów podobnych w ściśle określonym zakresie cech  Gatunek – grupa szczepów, w tym szczep referencyjny, wykazujących co najmniej 70% homologii pełnego genomowego DNA Identyfikacja taksonomiczna bakterii  Gatunek – grupa szczepów różniących się zawartością G+C w genomowym DNA nie więcej niż o 3% molowe nG + nC % G+C = x 100% nA + nT + nC + nG  W obrębie rodzaju różnice w %mol G+C nie mogą przekroczyć 10% Cechy umożliwiające identyfikację bakterii                 morfologia skład chemiczny ściany komórkowej obecność inkluzji komórkowych i substancji zapasowych zdolność do tworzenia pigmentów sposób odżywiania wymagania pokarmowe źródła C, N, S skład jakościowy i ilościowy produktów fermentacji wymagania tlenowe zakres temperatur i pH wzrostu wrażliwość na antybiotyki patogenność zależności symbiotyczne z innymi organizmami środowisko występowania obecność określonych antygenów (charakterystyka immunologiczna) sekwencja DNA genomowego Metody identyfikacji mikroorganizmów Podział metod identyfikacji mikroorganizmów: a) biochemiczne b) biofizyczne c) biologii molekularnej d) immunochemiczne Metody biochemiczne Polegają na określeniu zdolności mikroorganizmów do asymilacji, fermentacji lub rozkładu określonych związków chemicznych  cechy biochemiczne określa się na podstawie reakcji chemicznych zachodzących w odpowiednio skomponowanych pożywkach wzrostowych  wyniki testów biochemicznych odczytuje się makroskopowo • wzrost lub jego brak • zmiana zabarwienia pożywki • reakcja barwna po wprowadzeniu odczynnika reagującego z wytwarzanym metabolitem • wytworzenie gazu Testy biochemiczne Zawieszenie Naniesienie INKUBACJA (18 – 48 h) Interpretacja wyników w teście API (bioMerieux) Metody biofizyczne Umożliwiają identyfikację taksonomiczną mikroorganizmów poprzez oznaczanie produktów ich metabolizmu lub wybranych związków wchodzących w skład struktur komórkowych  Techniki elektroforetyczne  Techniki oparte na chromatografii gazowej Identyfikacja drobnoustrojów za pomocą technik elektroforetycznych  Analiza profili białkowych • skład ilościowy i jakościowy wszystkich białek komórkowych Sposób postępowania:     izolacja białek komórkowych rozdział elektroforetyczny w żelu poliakrylamidowym barwienie rozdzielonych białek porównanie z profilami białkowymi bazy danych Metoda pozwalająca określić przynależność gatunkową mikroorganizmu Identyfikacja drobnoustrojów za pomocą technik elektroforetycznych Elektroforeza dwukierunkowa Identyfikacja mikroorganizmów w oparciu o chromatografię gazową  Analiza profili kwasów tłuszczowych pochodzących z lipidów ściany komórkowej • skład kwasów tłuszczowych jest unikalny i charakterystyczny dla każdego gatunku mikroorganizmu przy zachowaniu kontrolowanych warunków hodowli • zarówno ilościowy, jak i jakościowy skład ściany komórkowej bakterii kodowany jest przez DNA genomowe i nie ma na niego wpływu informacja genetyczna zawarta w plazmidach  Analiza jakościowa – obecność specyficznych kwasów tłuszczowych  Analiza ilościowa – określenie zawartości poszczególnych kwasów tłuszczowych Identyfikacja mikroorganizmów w oparciu o chromatografię gazową Sposób postępowania:      saponifikacja i uwolnienie kwasów tłuszczowych metylowanie ekstrakcja z fazy wodnej rozdział z zastosowaniem chromatografii gazowej analiza wyników i porównanie z bazą danych Metoda pozwalająca określić przynależność gatunkową mikroorganizmu Identyfikacja mikroorganizmów w oparciu o chromatografię gazową Microbial Identification System HP 5898 A firmy Hewlett Packard Metody biologii molekularnej Metody identyfikacji oparte na badaniu homologii fragmentów kwasów nukleinowych  Metody hybrydyzacyjne  Metody oparte o technikę PCR Metody hybrydyzacyjne Polegają na zastosowaniu tzw. sond genetycznych  sondy są to krótkie jednoniciowe fragmenty DNA, zawierające sekwencje unikalne dla danego organizmu  kwas nukleinowy pełniący rolę sondy genetycznej jest znakowany • radioaktywnym fosforem [32P] lub wodorem [3H] • barwnikiem fluorescencyjnym • enzymem Metody hybrydyzacyjne • Najpopularniejsze systemy detekcji wykorzystują sondy DNA komplementarne do charakterystycznych dla identyfikowanego mikroorganizmu sekwencji rybosomalnego RNA (rRNA) • Wykorzystanie rRNA zwiększa czułość oznaczenia, gdyż występuje on w komórce bakteryjnej w dużej liczbie kopii (od 1 000 do 10 000) • Inną zaletą tego rozwiązania jest dostępność informacji odnośnie sekwencji rRNA pochodzących od różnych, często bardzo blisko genetycznie spokrewnionych mikroorganizmów, dzięki czemu możliwe jest otrzymywanie sond o bardzo wysokiej specyficzności Metody hybrydyzacyjne Dot blot Metody hybrydyzacyjne Southern blotting Metody hybrydyzacyjne • homologia kwasów nukleinowych powyżej 60% świadczy o przynależności organizmu do określonego gatunku • stopień hybrydyzacji powyżej 20% wskazuje na zgodność identyfikowanego drobnoustroju z danym rodzajem • hybrydyzacja od 1 do 5% może zachodzić między DNA lub RNA organizmów niespokrewnionych FISH – hybrydyzacja fluorescencyjna in situ Umożliwia identyfikację mikroorganizmów widzianych pod mikroskopem FISH – hybrydyzacja fluorescencyjna in situ Wynik FISH dla mieszaniny wybranych bakterii z rodzaju Bacillus, Escherichia, Pseudomanas, Shigella Metody wykorzystujące technikę PCR Technika PCR (Polymerase Chain Reaction) enzymatyczna amplifikacja (zwielokrotnienie) in vitro specyficznej sekwencji nukleotydów  gen kodujący 16S rRNA mikroorganizmów prokariotycznych  gen kodujący 18S rRNA mikroorganizmów eukariotycznych Sposób postępowania:  amplifikacja fragmentu DNA  sekwencjonowanie  porównanie wyników z danymi zamieszczonymi w banku genów • 5% różnica w sekwencji wystarczy dla wyodrębnienia gatunku Metody wykorzystujące technikę PCR badanie mieszanej populacji mikroorganizmów Metody wykorzystujące technikę PCR  Geny kodujące białka bakteryjne • • • • • • • • • • • białko szoku termicznego Hsp 70 białko szoku termicznego Hsp 60 syntaza asparaginylo-tRNA syntaza alanylo-tRNA dehydrogenaza glutaminianowa hydrolaza pirofosforanu podjednostka β polimerazy RNA (RpoB) podjednostka β’ polimerazy RNA (RpoC) czynniki elongacyjne: EF 1α/Tu, EF-Tu, Ef-G/2 białka rybosomowe: L2, L5, L11, L14, L15, L22, L23, S5, S12 gyrazy Metody immunochemiczne Reakcja aglutynacji Metody immunochemiczne Test ELISA Metody immunochemiczne Test immunochromatograficzny