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INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS SECCIÓN DE ESTUDIOS DE POSGRADO E INVESTIGACIÓN ESTUDIO CINÉTICO DE LA ENZIMA ÁCIDO CIANÚRICO AMIDOHIDROLASA DE LOS INTEGRANTES DE UN CONSORCIO MICROBIANO QUE DEGRADA ÁCIDO CIANÚRICO T E S I S QUE PARA OBTENER EL GRADO DE MAESTRO EN CIENCIAS QUIMICOBIOLÓGICAS PRESENTA: Marco Antonio Llamas Martínez DIRECTORES DE TESIS: Dra. Deifilia Ahuatzi Chacón Dra. Nora Ruiz Ordaz México, D.F. 2010 El presente trabajo fue realizado en el Laboratorio de Bioingeniería de la Escuela Nacional de Ciencias Biológicas del Instituto Politécnico Nacional, bajo la dirección de la Dra. Deifilia Ahuatzi Chacón y la Dra. Nora Ruiz Ordaz. ABSTRACT A bacterial community able to degrade cyanuric acid, whose identified constituents were Agrobacterium tumefaciens GPA and Acinetobacter sp. GPC enriched with Serratia marcescens nima, wase used to carry out kinetic studies about the intracellular accumulation of the enzyme cyanuric acido amidohyrdrolase, and cyanuric acid removal in batch cultures. From these strains, Serratia marcescens nima showed the highest enzyme levels, and cyanuric acid removal efficiencies (η CA ). In addition, the genes involved in atazine biodegradation atzbc were detected in a S. marcescens nima plasmid, and the genes atzabc were detected in its total DNA. Using the bacterial community inmobilized in a packed bed biofilm reactor (PBR), values of η CA, higher than 90% were obtained when the reactor was fed with mineral salts medium containing cyanuric acid plus glucose (50 and 125 mg L-1 each). Along PBR s continuous operation, two previously undetected bacteria, identified as Burkholderia sp. and Ralstonia sp., were selected. These bacteria, together with Serratia marcescens nima predominated over Agrobacterium tumefaciens GPA y Acinetobacter sp GPC. Genes atzb and atzc were identified in total DNA of Ralstonia sp. and gene atzb was detected in total DNA of Burkholderia sp. However, the gene which encodes the enzyme cyanuric acid amidohydrolase was not detected in any of the consortium members, possibly for being different from those previously reported. From each one of the bacterial community members, the cyanuric acid amidohydrolase was characterized by determining its optimum ph and temperature, the effect of substrate concentration on enzyme activity, as well as its stability. In general the optimum ph ranged between 7.94 and 8.72, and optimum temperature ranged between 40 o C and 55 o C. The highest affinity for substrate was showed by the enzyme of Burkholderia sp. and the lowest by the enzyme of Agrobacterium tumefaciens GPA. RESUMEN Se realizaron estudios cinéticos de remoción de ácido cianúrico y de la acumulación intracelular de la enzima ácido cianúrico amidohidrolasa, en cultivos por lote de bacterias integrantes de una comunidad previamente aislada, que degrada ácido cianúrico: Agrobacterium tumefaciens GPA y Acinetobacter sp GPC, así como de la cepa Serratia marcescens nima. De estas tres cepas, Serratia marcescens nima presentó los mayores niveles de la enzima y la mayor eficiencia de remoción del ácido cianúrico; también fueron detectados, en el DNA total de esta cepa, los genes involucrados en la degradación de herbicidas triazínicos atzabc y los genes atzb y atzc en su DNA plasmídico. La comunidad original, de la que formaban parte Agrobacterium tumefaciens GPA, Acinetobacter sp GPC enriquecida con Serratia marcescens nima fue cultivada en un reactor de biopelícula, logrando una eficiencia de remoción de ácido cianúrico superior al 90% cuando se alimentó un medio con 50 ppm de ácido cianúrico, complementado con 125 ppm de glucosa como fuente adicional de carbono y energía. Durante la operación del reactor en régimen continuo, se seleccionaron dos bacterias no detectadas previamente, que fueron identificadas como Ralstonia sp y Burkholderia sp, además de que estas junto con Serratia marcescens nima, predominaron sobre Agrobacterium tumefaciens GPA y Acinetobacter sp GPC. En estas cepas se detectó el gen atzb en el DNA total de Burkholderia sp y los genes atzb y atzc en el DNA total de Ralstonia sp; sin embargo, no pudo detectarse en ninguna de las integrantes del consorcio al gen que codifica para la enzima ácido cianúrico amidohidrolasa, probablemente por ser diferente a los reportados previamente. Se caracterizó la enzima ácido cianúrico amidohidrolasa, de cada una de las integrantes del consorcio seleccionado en el reactor de biopelícula, determinando su ph y temperatura óptimos, el efecto de la concentración de sustrato y de enzima, así como su estabilidad. En términos generales el ph óptimo osciló entre 7.94 y 8.72 y la temperatura óptima entre 40 o C y 55 o C. La mayor afinidad por el sustrato la presenta la enzima de Burkholderia sp. y la de menor afinidad la de Agrobacterium tumefaciens GPA. ÍNDICE GENERAL 1. INTRODUCCIÓN Generalidades Clasificación de herbicidas Triazinas Degradación de un herbicida triazínico Ácido cianúrico Toxicidad del ácido cianúrico Biodegradación del ácido cianúrico Microorgainsmos con capacidad de degradar ácido cianúrico Ácido cianúrico amidohidrolasa ANTECEDENTES Biodegradación de ácido cianúrico Ácido cianúrico amidohidrolasa JUSTIFICACIÓN OBJETIVOS Objetivo general Objetivos específicos METODOLOGÍA Desarrollo experimental MATERIALES Propagación de los microorganismos Biorreactor de lecho empacado MÉTODOS Caracterización del material de soporte Inmovilización del cultivo en el lecho empacado Preparación de extractos enzimáticos Actividad enzimática Caracterización cinética de la enzima 22 8. MÉTODOS ANALÍTICOS Determinación de unidades formadoras de colonias Determinación de la concentración de ácido cianúrico Determinación de proteínas por el método de Lowry Cuantificación de glucosa Técnica para el aislamiento de DNA bacteriano Condiciones para la PCR Identificación de las bacterias por PCR-Secuenciación del 16S rdna Detección de los genes específicos en la degradación de herbicidas triazínicos Electroforesis en gel de agarosa Obtención del perfil de plásmidos RESULTADOS Y DISCUSIÓN Degradación de ácido cianúrico en cultivos por lote Estandarización de la obtención de extractos enzimáticos Cinética de acumulación intracelular de la enzima ácido cianúrico amidohidrolasa Detección de los genes específicos en la degradación de herbicidas triazínicos Inmovilización en un reactor de lecho empacado Enriquecimiento y selección del consorcio en el reactor de lecho empacado Identificación de las integrantes del consorcio enriquecido y seleccionado en el reactor Detección de los genes específicos en la degradación de herbicidas triazínicos en las bacterias aisladas Caracterización de la enzima ácido cianúrico amidohidrolasa 48 9 CONCLUSIONES BIBLIOGRAFÍA 58 No. de figura ÍNDICE DE FIGURAS Nombre Página 1 Estructura química de algunos herbicidas triazínicos 3 2 Degradación de simazina 4 3 Estructura química del ácido cianúrico 5 4 Crecimiento celular en cultivo por lote 29 5 Cinética de remoción de ácido cianúrico en cultivo por lote 30 6 Consumo de glucosa en cultivo por lote 30 7 Disminución de la viabilidad por sonicación de suspensiones celulares de las tres cepas bacterianas 32 8 Aumento de proteína soluble por sonicación de suspensiones celulares de las tres cepas bacterianas 32 9 Disminución de la viabilidad por rompimiento mecánico de 33 suspensiones celulares de las tres cepas bacterianas 10 Aumento de proteína soluble por rompimiento mecánico de suspensiones celulares de las tres cepas bacterianas Producción de enzima en cultivos por lote de las cepas bacterianas Electroferograma de los amplicones de los genes atza, atzb, atzc en el DNA de Serratia marcescens nima Perfil de plásmidos de Serratia marcescens nima Electroferograma de los amplicones de los genes atzb y atzc en el DNA plasmídico de Serratia marcescens nima Esquema del reactor Testigo abiótico: saturación del reactor Velocidad volumétrica de remoción (RV) en función de la carga de ácido cianúrico (BV) (100 ppm de ácido cianúrico) en el reactor de lecho empacado 18 Sustrato a la salida del reactor medido espectrofotométricamente Velocidad volumétrica de remoción (RV) en función de la carga de ácido cianúrico (BV) (50 ppm de ácido cianúrico con 125 ppm de glucosa) en el reactor de lecho empacado Electroferograma del amplicón del gen atzb de Burkholderia sp. 47 (carril1) 21 Electroferograma de los amplicones de los genes atzb y atzc del DNA de Ralstonia sp Efecto de la concentración de enzima en la actividad resultante en el ensayo 23 Efecto de la concentración de sustrato en la velocidad de reacción de la ácido cianúrico amidohidrolasa Efecto del ph en la actividad de la ácido cianúrico amidohidrolasa de las cinco cepas Efecto de la temperatura en la actividad de la ácido cianúrico amidohidrolasa de las cinco cepas 26 Estabilidad de la enzima ácido cianúrico amidohidrolasa de las cinco cepas ÍNDICE DE CUADROS No. de cuadro Nombre Página 1 Número de herbicidas por grupos que han surgido de toxíforos individuales 2 2 Distribución ambiental del ácido cianúrico 6 3 Algunos valores de toxicidad en ratas, ratones y conejos 8 4 Constantes cinéticas de la enzima ácido cianúrico amidohidrolasa 12 5 Composición química del medio mínimo mineral 18 6 Composición química de la solución de oligoelementos 19 7 Iniciadores utilizados para la detección de genes específicos en la degradación de triazínicos 27 8 Eficiencia global de remoción de ácido cianúrico y máxima actividad enzimática de los cultivos por lote 35 9 Diámetro interno, altura interna y volumen por etapa del reactor Características del material de soporte Porcentaje de remoción de ácido cianúrico en el reactor de lecho empacado y UFC/mL en cada etapa Eficiencia de remoción de ácido cianúrico en el reactor de lecho empacado Identificación de dos integrantes del consorcio enriquecido y 46 seleccionado en el reactor 14 Propiedades cinéticas de la cianúrico amidohidrolasa de las bacterias integrantes del consorcio 56 1. INTRODUCCIÓN 1.1 Generalidades Hasta mediados del siglo XX el control de las hierbas adventicias de los cultivos se hacía por medios mecánicos, mediante azada o arado, con un elevado costo en mano de obra. Los herbicidas, o matamalezas químicos, han reemplazado en gran parte estos métodos mecánicos de control de malezas, en países donde se practica la agricultura intensiva y altamente automatizada. Junto con los fertilizantes, otros pesticidas, y variedades mejoradas de plantas, los herbicidas han hecho una importante contribución, aumentando los rendimientos, ayudando a disminuir los crecientes costos y también a prescindir de la escasa mano de obra agrícola de algunos países (Carpenter y Ware, 2004). El uso de herbicidas para el control de malezas no sólo ha generado beneficios, una de las más grandes desventajas de su uso es que gran parte de los herbicidas no se degradan en el ambiente, y si bien evitan el crecimiento de malezas que son indeseadas, el tóxico, que difícilmente se degrada de manera natural en la zona donde es aplicado, puede ser arrastrado por la lluvia, o filtrarse hasta los mantos acuíferos causando problemas serios de contaminación en el agua que probablemente sea utilizada como agua potable. Así que, nuevamente, como en muchos otros casos, se tiene una situación en la que la solución a un problema genera otros secundarios tal vez más graves que el inicial, y por lo tanto se deben de encontrar posibles soluciones, de manera que el entorno sea modificado lo menos posible. 1.2 Clasificación de los herbicidas Desde que se observó la efectividad de los herbicidas, se han desarrollado diferentes grupos de estos fitotóxicos mediante la selección al azar en el invernadero y la subsiguiente modificación química (Cuadro 1). 1 Cuadro 1. Número de herbicidas por grupos que han surgido de toxíforos individuales Descubrimiento del primer herbicida en el grupo Grupo de herbicidas Número actual de herbicidas en el grupo 1945 fenoxiacéticos Carbamatos Triazinas dinitroanilinas Difeniléteres Sulfonilureas 16 Fuente: Parry, Triazinas Las triazinas están formadas por anillos heterocíclicos de seis átomos, de los cuales tres son nitrógenos. Las triazinas tienen relativamente baja solubilidad en agua y se formulan como polvos humedecibles, suspensiones concentradas y granulados. Su volatilidad y fotodescomposición son bajos, siendo estables sobre las superficies de las plantas y en el suelo. Comúnmente se aplican al suelo donde son absorbidos por las raíces y, en menor medida, por las partes subterráneas de la planta, donde se mueven con la corriente transpiratoria del apoplasto. Generalmente requieren de lluvia o irrigación para su movilidad en el suelo, y son más efectivas cuando se aplican sobre suelo húmedo comparado con el suelo seco. Cuando se aplican con coadyuvantes, la mayoría de las triazinas pueden ser absorbidas foliarmente. Estos herbicidas son activos contra un amplio espectro de malezas de hoja ancha y gramíneas. La movilidad descendente en el suelo depende de las propiedades químicas del herbicida, como son su solubilidad en agua y su capacidad para adsorberse en los coloides del suelo. También influyen las propiedades del suelo, en aspectos como su contenido de materia orgánica, de arcilla y de agua (Komives, 1992). Las triazinas se usan de manera selectiva en ciertos cultivos y no selectiva en otros. La mayor cantidad se aplica en la producción de maíz y en forma no selectiva en sitios no productivos, como bordes de carreteras y vías férreas. 2 Las estructuras químicas de los herbícidas triazínicos más comúnmente utilizados, se muestran en la Figura 1. Figura 1. Estructura química de algunos herbicidas triazínicos 1.4 Degradación de un herbicida triazínico Los herbicidas triazínicos presentan una alta persistencia, porque su degradación química o biológica en los diferentes receptores del ambiente es muy lenta. Se ha demostrado que la atrazina prácticamente no sufre fotodescomposición en el aire o en el agua, aunque puede sufrir reacciones de oxidación con radicales hidroxilo en la atmósfera (Pellizzetti y col., 1990; Curran y col., 1992). Este herbicida puede ser metabolizado por algunos microorganismos, sin embargo el proceso suele ser lento (Mandelbaum y col., 1993; Feakin y col., 1994; Seybold y col., 1999). Asimismo, su tendencia a adsorberse fuertemente al suelo puede limitar su biodisponibilidad para los microorganismos degradadores (Seybold y col., 1999). El destino y la persistencia de la atrazina en el ambiente facilitan su distribución ubicua, encontrándose así en todo tipo de muestras ambientales (ATSDR, 2001). En la Figura 2 se muestra la vía de degradación de la simazina (Erickson y Lee, 1989; Karthikeyan y col., 2003). 3 Degradación química Cl Degradación biológica N N H 3 C N H N N H C H3 Cl simazina AtzA O H N N N N H 3 C N H N N H2 H 3 C N H N N H C H3 2-cloro-4-amino-6-etilamino-s-triazina 2-hidroxi-4,6-bis(etilamino)s-triazina Cl AtzB O H N N N N H 2 N N N H2 AtzC H 3 C N H N O H O H 2-cloro -4,6-diamino-s-triazina HO N N N O H 2,4-dihidroxi-6-etilamino- s-triazina N-etilamelida ACIDO CIANURICO AtzD NH 2 NH 2 AtzE O NH O O Biuret NH 2 O - H 2 N NH 2 O NH O Urea Alofanato AtzF 2NH 3 + CO Figura 2. Degradación de simazina (Erickson y Lee, 1989; Karthikeyan y col., 2003). 4 En esta ruta metabólica intervienen los genes: atza, atzb, atzc, atzd, atze, y atzf, los cuales codifican las enzimas correspondientes a cada etapa, siendo las tres primeras enzimas del grupo de las proteínas amidohidrolasas; este tipo de enzimas se ha encontrado únicamente en tres tipos de organismos: Eubacteria, Archae y Escaria y se cree que los genes que codifican a dichas enzimas han evolucionado recientemente, contribuyendo así en la biodegradación de la atrazina. Los herbicidas triazínicos convergen todos en un compuesto intermediario metabólico común, el acido cianúrico, el cual es un compuesto clave, ya que la ruptura de su anillo es el paso limitante en la degradación de los mismos (Cook y col., 1981). 1.5 Ácido cianúrico Este compuesto se encuentra dentro del grupo de las triazinas, que son especies químicas conformadas por un anillo heterocíclico de seis miembros compuesto por tres nitrógenos que remplazan las unidades de hidrógeno-carbono en la estructura del anillo bencénico. Los nombres de sus tres isómeros indican la posición en la cual las unidades de carbonohidrógeno han sido reemplazadas por nitrógenos, llamados 1,2,3-triazina, 1,2,4-triazina, y 1,3,5- triazina, respectivamente. La molécula simétrica 1,3,5-triazina o ácido cianúrico es la más común. El ácido cianúrico es también conocido como 2,4,6-triol-s-triazina/ ácido isocianúrico/ 2,4,6(1H,3H,5H)-Triona de 1,3,5-triazina (Figura 3); su fórmula química condensada es: C 3 N 3 (OH) 3. Es un polvo cristalino, higroscópico y sin olor; su solubilidad en agua es de 0.2 g/ 100 ml a 25ºC; su punto de fusión se encuentra entre 320 y C su pka 1 es 6.88 su pka 2 es su pka 3 es 13.5, su peso molecular es de (OECD SIDS, 1999). Figura 3. Estructura química del ácido cianúrico 5 El ácido cianúrico no es fácilmente biodegradable; para evaluar su impacto en el ambiente, es útil calcular su distribución ambiental probable cuando es liberado. Todas las sustancias se desplazan entre los compartimientos ambientales (aire, agua, suelo/sedimento y biota) y son objeto de partición ambiental. Las sustancias se desplazarán desde su punto de entrada en el ambiente hasta el compartimiento ambiental hacia el cual tienen mayor afinidad. A partir de ahí, las sustancias pueden ser trasladadas nuevamente a otros compartimientos. Se han desarrollado modelos que permiten calcular esta distribución ambiental, en el modelo de fugacidad concebido por Mackay y desarrollado por Calamari y sus colaboradores, la fugacidad ha sido definida como la tendencia de una sustancia química a escaparse de una fase a otra. En la práctica, después de aplicar el modelo de fugacidad (nivel I) se puede saber en cual compartimiento se encuentra la mayor parte del compuesto y en donde están las concentraciones más altas. El nivel II, que es más complejo, también está en equilibrio e incluye reacciones de transformación y advección. El nivel III es un sistema más complejo de estado constante, que no está en equilibrio y da una idea del flujo del transporte entre las fases (Calamari, 1993). Se han reportado los porcentajes de distribución del ácido cianúrico en el ambiente. La distribución en los receptores ambientales predicha por el modelo de fugacidad Mackay de nivel III se muestra en el cuadro 2. Cuadro 2. Distribución ambiental del ácido cianúrico. Receptor Liberación en aire (100%) Liberación en agua (100%) Liberación en suelo (100%) Aire 0.1 % 0.0% 0.0% Agua 46.55% 99.6% 40.5% Suelo 53.3% 0.0% 59.3% Sedimento 0.2% 0.4% 0.2% Fuente: OECD (Organization for Economie Co-operation and Development) SIDS (Screening Information Data Set), Estos datos muestran que el ácido cianúrico tiene a distribuirse preferentemente en el agua y el suelo y es menos probable encontrarlo en otros receptores ambientales, por lo que los estudios para su remoción se han enfocado al tratamiento del agua contaminada con este químico. 1.6 Toxicidad del ácido cianúrico La toxicidad de este compuesto en organismos acuáticos es baja, puesto que los datos de toxicidad son superiores a 32 mg/l (NOEC para reproducción de Daphnia magna), NOEC es el nivel de efecto no observado, es decir la dosis máxima o concentración ambiental que un organismo puede tolerar durante un período específico, sin mostrar n
