Transcript
Nilai LC 50 Dekokta Kumis Kucing (Orthosiphon stamineus, Benth) pada Embrio dan Ikan Zebra Dewasa Rery Tiara Amalia Dewanti, Diah Andriana, Arif Yahya Fakultas Kedokteran Universitas Islam Malang Abstract. An Antihypertensive materials require safety testing for their use, including through the LC50 value. Orthosiphon stamnineus, Benth decoction (DOSb) able to attract the active material of potentially as antihypertensives are flavonoids, terpenoids and metyhlripariochromene A that also can be potentially toxic during the early life and adult. This study aims to determine the value Lethal Concentration 50 (LC50) in zebrafish embryos and adults. Embryos fish Danio rerio 5.25 hours post-fertilization age exposed dekokta Orthosiphon Stamineus, Benth dose of 438 ppm, 578 ppm, 763 ppm, 1007 ppm and 1328 ppm were observed at 96 hours post-fertilization. Adults zebra fish at three-month-old exposed dekokta Orthosiphon Stamineus, Benth dose of 1528 ppm, 1752 ppm, 2012 ppm, 2311 ppm and 2655 ppm. Data retrieved by counting the number of embryos and adult fish were dead. Data were analyzed using probit anylisis Exposure dose of 438 ppm, 578 ppm, 763 ppm, 1007 ppm and 1328 ppm in embryonic zebrafish causing death respectively for 40%, 50 %, %, % and 95 %. Exposure dose of 1528 ppm, 1752 ppm, 2012 ppm, 2311 ppm and 2655 ppm caused the death of adult zebrafish, respectively for %, 50 %, 70 %, 80 % and 90 %. LC50 values DOSb zebrafish embryos at ppm. LC50 values DOSb adult zebrafish at ppm. Keywords: Lethal Concentration 50, Orthosiphon Stamineus, Benth decoction, Danio rerio embryos, adult fish Danio rerio Hipertensi merupakan salah satu penyakit dengan prevalensi tinggi di Indonesia yakni, sebesar 26,5% pada tahun Profil data kesehatan Indonesia menyebutkan hipertensi merupakan salah satu dari 10 penyakit dengan kasus rawat inap terbanyak di rumah sakit pada tahun 2010, dengan proporsi kasus 42,38% pria dan 57,62% wanita. 2 Kecenderungan peningkatan prevalensi menurut peningkatan usia, pada kelompok usia tahun sebesar 7%, naik menjadi 16% pada kelompok usia tahun dan pada kelompok umur 65 tahun atau lebih menjadi 29%. 3 Berdasarkan data empiris, masyarakat Indonesia mengenal beberapa herbal yang bermanfaat sebagai obat hipertensi, seperti seledri (Apium graveolens), kumis kucing (Orthosiphon stamineus, Benth), pegagan (Centella asiatica), meniran (Phyllanthus urinaria) dan temulawak (Curcuma xanthorrhiza). 4 Orthosiphon stamineus, Benth merupakan salah satu herbal yang memiliki efek menurunkan tekanan darah. Berdasarkan penelitian diketahui ada sekitar seratus kandungan zat aktif yang dapat diklasifikasikan sebagai monoterpen, diterpene, triterpene, saponin, flavonoid, organic acids terkandung pada Orthosiphon stamineus, Benth. 5 Methylripariochromene A merupakan salah satu zat aktif yang berfungsi sebagai diuretik dan menurukan cardiac output. 5 Selain itu, fraksi kloroform dari DOSb menunjukkan efek penghambatan respon kontraktil pada dinding otot polos aorta tikus yang dirangsang dengan KCl terlebih dahulu. Penelitian lain menyebutkan pada ekstrak hidroalkohol dosis 50 mg/kg, menunjukkan efek yang sama dengan hydrochlorotiazide dengan dosis 10 mg/kg. 6 Tetapi, konsumsi flavonoid dosis tinggi dapat mengakibatkan mutasi, bersifat pro oksidan dan meningkatkan resiko kematian fetus, sehingga memerlukan penelitian efek teratogenik pada model embrio 7,8 Oleh karena itu penggunaan DSOb secara berlebihan harus diwaspadai efek sampingnya Pengukuran melalui LC 50 untuk bahan alam bertujuan untuk uji teratogenik dan uji keamanan. Lethal Concentration 50 (LC 50 ) adalah parameter toksisitas akut yang menjadi prioritas utama untuk menilai keamanan herbal. 9 Embrio ikan zebra merupakan model yang tepat sebagai hewan uji teratogenik, karena beberapa alasan yakni, perkembangannya di luar tubuh induk, embrionya transparan, mudah dipelihara dan Jurnal Kedokteran Komunitas Volume 3, Nomor 1, Desember % sekuen DNA pada ikan zebra menyerupai manusia. 10 Beberapa penelitian menunjukkan zat kimia maupun obat mempunyai kesamaan efek toksik antara embrio ikan zebra dengan manusia. 10 Kecenderungan peningkatan prevalensi menurut peningkatan usia pada hipertensi 3 menjadi landasan penggunaan ikan zebra dewasa karena memiliki beberapa keuntungan meliputi mudah didapat, mudah diamati, sensitif dan ikan zebra dapat digunakan sebagai bioindikator polutan. 11 Berdasarkan latar belakang diatas maka perlu dilakukan pengujian toksisitas DOSb dengan menguji nilai Lethal Concentration 50 (LC 50 ) pada embrio dan ikan zebra dewasa. METODE PENELITIAN Desain Penelitian Metode yang digunakan pada penelitian ini adalah eksperimental laboratorium dengan desain control group post test only pada embrio dan ikan dewasa zebra yang bertujuan untuk mengetahui efek toksik akut dari ekstrak herbal Orthosiphon stamineus, Benth melalui pengamatan kematian (LC 50 ) embrio dan ikan zebra dewasa. Prosedur Penelitian Pemeliharaan dan Pemijahan Ikan Zebra Ikan zebra dipelihara dengan pemberian makan artemia setiap hari. Pemijahan terdiri dari 20 ikan zebra (13 jantan dan 12 betina) ditempatkan pada akuarium pemijahan pada Perlakuan dan Pengamatan Kematian Ikan Zebra Dewasa Ikan zebra dewasa berusia 3 bulan dipapar DOSb. Perlakuan dilakukan sampai jam ke-96 dan diamati setiap 24 jam. DOSb diberikan pada lima kelompok, yakni kelompok perlakuan 1 (P1) dengan dosis 1528 ppm, kelompok perlakuan 2 (P2) dengan dosis 1752 ppm, kelompok perlakuan 3 (P3) dengan dosis 2012 ppm, kelompok perlakuan 4 (P4) dengan dosis 2311 ppm dan kelompok perlakuan 5 (P5) dengan dosis 2655 ppm. Kematian ikan dewasa ditandai dengan mengapungnya ikan dan hilangnya pergerakan ikan. Analisa Data suhu 27 0 C dan ph 7, di dekat akuarium dipasang lampu otomatis dengan siklus 10 jam gelap : 14 jam terang dan diberi oksigenasi, selain itu dibawah akuarium dipasang spawning trap. 12 Keterangan kelaikan etik penelitian ini diperoleh dan disetujui oleh komisi etik penelitian kesehatan Fakultas Kedokteran Universitas Brawijaya pada tanggal 10 Juni 2015 dengan nomor 343/EC/KEPK-S1-PD/06/2015. Ekstraksi Herbal antihipertensi Orthosiphon stamineus, Benth diperoleh dari Balai Materia Medica Batu dalam bentuk serbuk simplisia. Serbuk simplisia diekstraksi menggunakan metode dekoktasi. Dekokta kemudian disaring dan diberikan pada embrio dan Danio rerio dewasa pada kelompok uji. Perlakuan dan Pengamatan Kematian Embrio Ikan Zebra Embrio ikan zebra dipapar DOSb pada awal masa gastrulasi (5,25 jam paska fertilisasi). Perlakuan dilakukan sampai jam ke-96 paska fertilisasi dan diamati setiap 24 jam. DOSb diberikan pada lima kelompok, yakni kelompok perlakuan 1 (P1) dengan dosis 438 ppm, kelompok perlakuan 2 (P2) dengan dosis 578 ppm, kelompok perlakuan 3 (P3) dengan dosis 763 ppm, kelompok perlakuan 4 (P4) dengan dosis 1007 ppm dan kelompok perlakuan 5 (P5) dengan dosis 1328 ppm. Kematian embrio ditandai dengan penggumpalan atau koagulasi telur. Data yang dianalisa adalah data tentang kematian embrio ikan zebra dan ikan zebra dewasa. Data kematian embrio dan ikan dewasa selanjutnya ditabulasi dan dianalisa secara statistik menggunakan analisis probit. HASIL PENELITIAN Karakteristik Sampel Embrio Ikan Zebra Penelitian ini menggunakan hewan coba embrio ikan zebra yang berusia 5.25 paska fertilisasi. Jumlah sampel adalah 100 embrio yang terbagi dalam lima kelompok dengan tiga kali pengulangan. Masing-masing embrio diletakkan pada setiap well. Perlakuan dilakukan selama 96 jam paska fertilisasi. DOSb diberikan pada lima kelompok, yakni kelompok perlakuan 1 (P1) dengan dosis 438 ppm, kelompok perlakuan 2 Page 22 Rery Tiara Amalia Dewanti, Nilai LC50 Dekokta Kumis Kucing (Orthosiphon stamineus, Benth) pada Embrio (P2) dengan dosis 578 ppm, kelompok perlakuan 3 (P3) dengan dosis 763 ppm, kelompok perlakuan 4 (P4) dengan dosis 1007 ppm dan kelompok perlakuan 5 (P5) dengan dosis 1328 ppm. Karakteristik Sampel Ikan Zebra Dewasa Penelitian ini menggunakan hewan coba ikan zebra dewasa yang berusia 3 bulan. Jumlah sampel adalah 50 ekor ikan yang terbagi dalam lima kelompok dengan tiga kali pengulangan. 10 ekor ikan diletakkan pada aquarium perlakuan. Perlakuan dilakukan selama 96 jam. DOSb diberikan pada lima kelompok, yakni kelompok perlakuan 1 (P1) dengan dosis 1528 ppm, kelompok perlakuan 2 (P2) dengan dosis 1752 ppm, kelompok perlakuan 3 (P3) dengan dosis 2012 ppm, kelompok perlakuan 4 (P4) dengan dosis 2311 ppm dan kelompok perlakuan 5 (P5) dengan dosis 2655 ppm. Benth pada Embrio Ikan Zebra Persentase kematian embrio dihitung berdasarkan jumlah rata- rata kematian dalam persen dari tiga kali pengulangan di setiap dosis, dapat dilihat pada tabel 1. Dan hasil perhitungan probit dapat dilihat pada tabel 2. Tabel 1. Persentase Kematian Embrio No Kelompok Jumlah Kematian Embrio Perlakuan embrio jam 1 Dosis 438 ppm 60 40,00 ± 5,00 2 Dosis 578 ppm 60 50,00 ± 10,00 3 Dosis 763 ppm 60 61,67 ± 5,77 4 Dosis 1007 ppm ± 5,77 5 Dosis 1328 ppm ± 5,00 Berdasarkan tabel di atas menunjukan bahwa pada kelompok perlakuan 1 dosis 438 ppm menyebabkan kematian pada embrio ikan zebra sebesar 40%, perlakuan 2 dosis 578 ppm sebesar 50%, perlakuan 3 dosis 763 ppm sebesar 61,67%, perlakuan 4 dosis 1007 ppm sebesar 86,67%, dan perlakuan 5 dosis 1328 ppm sebesar 95%. Berikut pemaparan tabel hasil probit probabilty nilai LC 50 embrio pada jam ke 96 adalah 490,760 ppm. Tabel 2. Hasil LC 50 Berdasarkan Analisis Probit Waktu 96 Jam 95% Confidence Limits for Dosis Probability Estimate Lower Upper, , , ,651, , , ,566, , ,624-21,748,200-33, ,737 88,438,250 70,743-66, ,584, ,206 37, ,652, , , ,068, , , ,100, , , ,443, , , ,517, , , ,657, , , ,249, , , ,890, , , ,588, , , ,120, , , ,764, , , ,043, , , ,974, , , ,897 Benth pada Ikan Zebra Dewasa Persentase kematian ikan zebra dewasa dihitung berdasarkan jumlah rata- rata kematian dalam persen dari tiga kali pengulangan di setiap dosis, dapat dilihat pada tabel 3. Dan hasil perhitungan probit dapat dilihat pada tabel 4. Tabel 3. Persentase Kematian Ikan Dewasa No Kelompok ikan Kematian Ikan Perlakuan dewasa Dewasa jam 1 Dosis 1528 ppm 30 33,33 ± 5,77 2 Dosis 1752 ppm 30 50,00 ± 10,00 3 Dosis 2012 ppm 30 70,00 ± 0,00 4 Dosis 2311 ppm 30 80,00 ± 10,00 5 Dosis 2655 ppm 30 90,00 ± 0,00 Berdasarkan tabel 3 di atas menunjukan bahwa pada kelompok perlakuan 1 dosis 1528 ppm menyebabkan kematian pada ikan zebra dewasa sebesar 33,33%, perlakuan 2 dosis 1752 ppm menyebabkan kematian ikan zebra dewasa sebesar 50%, perlakuan 3 dosis 2012 ppm menyebabkan kematian ikan zebra dewasa sebesar 70%, perlakuan 4 dosis 2311 ppm menyebabkan kematian ikan zebra dewasa sebesar 80%, dan perlakuan 5 dosis 2655 ppm menyebabkan kematian ikan zebra dewasa sebesar 90%. Berikut pemaparan tabel hasil probit probabilty nilai LC 50 ikan zebra dewasa pada jam ke 96 adalah 1694,823 ppm. Tabel 4. Tabel Hasil Probit 23 Page Jurnal Kedokteran Komunitas Volume 3, Nomor 1, Desember 2015 Waktu 96 Jam 95% Confidence Limits for Dosis Probability Estimate Lower Upper, ,105 13, ,001, , , ,610, , , ,639, , , ,051, , , ,572, , , ,138, , , ,328, , , ,190, , , ,025, , , ,780, , , ,298, , , ,499, , , ,577, , , ,264, , , ,310, , , ,473, , , ,916, , , ,362, , , ,334 PEMBAHASAN Karakteristik Sampel Hewan coba yang digunakan dalam penelitian ini adalah embrio dan ikan zebra dewasa. Ikan zebra merupakan salah satu hewan coba yang dapat digunakan sebagai model uji toksisitas dan model teratogen. Pengamatan ikan zebra dewasa digunakan karena memiliki beberapa keuntungan meliputi mudah didapat, mudah diamati, sensitif dan ikan zebra dapat digunakan sebagai bioindikator polutan. 11 Beberapa penelitian menunjukkan zat kimia maupun obat mempunyai kesamaan efek toksik antara embrio ikan zebra dengan manusia. Embrio zebrafish merupakan model yang tepat sebagai hewan uji teratogenik, karena beberapa alasan yakni, perkembangannya di luar tubuh induk, embrionya transparan, mudah dipelihara dan 70% sekuen DNA pada ikan zebra menyerupai manusia. 12 Pada kelompok embrio, jumlah sampel yang digunakan adalah 100 embrio yang terbagi dalam 5 kelompok. Sehingga, dalam setiap plate terdiri dari 20 embrio, dan dalam setiap well terdiri 1 embrio agar jika terdapat salah satu embrio yang mati tidak mempengaruhi embrio yang lain. Pada penelitian ini dilakukan tiga kali pengulangan untuk meminimalisir bias. Pada ikan zebra dewasa jumlah sampel yang digunakan adalah 50 embrio yang terbagi dalam 5 kelompok. Dalam setiap akuarium perlakuan terdiri dari 10 ekor ikan dewasa. Pada penelitian ini dilakukan tiga kali pengulangan untuk meminimalisir bias. Benth pada Embrio Ikan Zebra (Danio rerio) Uji LC 50 adalah suatu pengujian untuk menetapkan potensi toksisitas akut, menilai berbagai gejala toksik, spektrum efek toksik dan mekanisme kematian. Tujuan uji LC 50 adalah untuk mendeteksi adanya toksisitas suatu zat, menentukan organ sasaran dan kepekaannya, memperoleh informasi awal yang dapat digunakan untuk menetapkan tingkat dosis yang diperlukan. 13 Percobaan toksisitas akut telah dilakukan terhadap dekokta Orthosiphon stamineus, Benth pada embrio ikan zebra dalam beberapa dosis. Persentase kematian 50% embrio ikan zebra ditunjukkan pada dosis 578 ppm. Berdasarkan analisis probit didapatkan dosis 490,760 ppm sebagai dosis LC 50. Penelitian ini menunjukkan bahwa dekokta Orthosiphon stamineus, Benth memiliki nilai LC 50 pada klasifikasi 100 mg/l, yaitu termasuk kategori toksisitas ringan. 14 Semakin lama waktu penyerapan dekokta Orthosiphon stamineus, Benth, nilai LC 50 yang didapatkan akan semakin kecil. Hal ini diduga adanya tanggapan fisiologi embrio ikan zebra yang sangat peka pada kondisi awal terhadap bahan aktif herbal tersebut. Aplikasi dekokta Orthosiphon stamineus, Benth secara tiba-tiba ke dalam media hidup embrio ikan menyebabkan stress yang sangat tinggi selanjutnya embrio ikan mengalami kematian. Sedangkan pada waktu yang lebih lama embrio ikan zebra berhasil beradaptasi dan mentoleransi penyerapan zat aktif herbal sehingga semakin survive dan respon mortalitas semakin berkurang. 15 Kematian 50% embrio Danio rerio disebabkan oleh kandungan senyawa metabolit sekunder dalam dekokta Orthosiphon stamineus, Benth. Semakin kecil nilai LC 50 dari suatu sampel maka semakin tinggi senyawa bioaktifnya. Tingginya aktivitas bioaktif dari DSOb terhadap embrio Danio rerio disebabkan adanya kandungan senyawa flavonoid, terpenoid yang cukup tinggi. 16,17 Flavonoid dalam dosis berlebih akan menjadi pro-oksidan sehingga dapat menurunkan fungsi mitokondria, yang akan menyebabkan deplesi ATP dan memicu kematian sel. 16 Selain itu, terpenoid dalam dosis berlebih memiliki sifat sitotoksik dan dapat menyebabkan abrasi kromosom. 17 Kedua hal tersebut dapat menghambat pembentukan multi-organ pada Page 24 Rery Tiara Amalia Dewanti, Nilai LC50 Dekokta Kumis Kucing (Orthosiphon stamineus, Benth) pada Embrio ikan zebra, sehingga dapat menyebabkan kematian embrio. Benth pada Ikan Zebra Dewasa (Danio rerio) Percobaan toksisitas akut telah dilakukan terhadap dekokta Orthosiphon stamineus, Benth pada ikan zebra dewasa dalam beberapa dosis. Rerata persentase kematian 50% ikan zebra dewasa ditunjukkan pada dosis 1752 ppm. Berdasarkan analisis probit didapatkan dosis 1694,823 ppm sebagai dosis LC 50. Penelitian ini menunjukkan bahwa dekokta Orthosiphon stamineus, Benth memiliki nilai LC 50 pada klasifikasi 100 mg/l, yaitu termasuk kategori toksisitas ringan. 14 Kematian 50% ikan dewasa Danio rerio diduga disebabkan oleh kandungan senyawa Methylripariochromene A. 5 Methylripariochromene A ini bekerja pada reseptor Antagonis-Adenosine A1 yang dapat menghambat reabsorbsi Na + di tubulus. 18 Hal ini sejalan dengan penelitian yang dilakukan Omar (2012) dalam dosis 5 gram/kg dekokta Orthosiphon stamineus, Benth dapat berefek meningkatkan ekskresi minor Na + dan Cl - dan bisa berefek pula meningkatkan ekskresi mayor K Peningkatan ekskresi minor Na + dan Cl - dan ekskresi mayor K + akan menyebabkan deplesi K + sehingga dapat menyebabkan hipokalemi. Hipokalemi akan memicu terjadinya aritmia sehingga dapat terjadi cardiac death yang akan menyebabkan kematian ikan zebra dewasa. 20 KESIMPULAN Berdasarkan hasil analisa data dan pembahasan pada penelitian ini disimpulkan bahwa: 1. Dosis LC 50 dekokta Orthosiphon stamineus, Benth terhadap embrio ikan zebra sebesar 490,760 ppm. 2. Dosis LC 50 dekokta Orthosiphon stamineus, Benth terhadap ikan zebra dewasa sebesar 1694,823 ppm. SARAN Berdasarkan hasil penelitian yang telah dilakukan, maka saran penelitian ini untuk pengembangan lebih lanjut, adalah: 1. Perlu dilakukan penelitian toksisitas kronis dekokta Orthosiphon stamineus, Benth sebagai obat anti hipertensi yang digunakan dalam jangka panjang pada hewan coba. 2. Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut untuk mengetahui efek dekokta Orthosiphon stamineus, Benth pada hewan yang lebih tinggi tingkatannya dari ikan. DAFTAR PUSTAKA 1. Departemen Kesehatan RI Riset Kesehatan Dasar, Jakarta: Direktorat Jendral Bina Pelayanan Medik 2. Departemen Kesehatan RI Riset Kesehatan Dasar, Jakarta: Direktorat Jendral Bina Pelayanan Medik. 3. Departemen Kesehatan RI Survei Kesehatan Rumah Tangga (SKRT), Jakarta: Badan Litbangkes, Supriyatna., Sukandar, Hadiyana., Maesaroh, Imas Analisis Simplisia Saintifikasi Jamu Anti-hipertensi, Anti-hiperglikemia, Antihiperkolesterolemia dan Anti-hiperurisemia. IJPST: volume Adyana, IK., Setiawan, F., Insanu, M From Ethnopharmacology to Clinical Study of Orthosiphon stamineu, Benth. International Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences. Bandung. 6. Beaux D, Fleurentin J, Mortier F. Effect of extracts of Orthosiphon stamineus Benth. Phytother Res 1999;13(3): C.F Skibola, M.T Smith. Potential health impacts of excessive flavonoid intake, Free. Radic. Biol. Med : Wirasuta, I.M.A.G., & Niruri, R. (2007). Buku ajar toksikologi umum. Denpasar: Jurusan Kimia-FMIPA Universitas Udayana. 9. Loomis, T.A Toksikologi Dasar. Diterjemahkan oleh : Donatus, I.A., Edisi III. IKIP Semarang Press, Semarang. 10. Wang, S., Liu, K., Wang, X Toxic effects of celastrol on embryonic development of zebrafish (Danio rerio). Drug Chem Toxicol, 34(1), Zebrafish assays for drug toxicity screening. (2006).(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubme d/ ), diakses 14 Juli Robert OA, Jens PT. Improving Production of Zebra Fish Embryos in the Lab. J Env Prot 2011, 2, Mansur Ibrahim, Akhyar Anwar, Nur Ihsani Yusuf Lethal Dose 50% (LD50) Test of 25 Page Jurnal Kedokteran Komunitas Volume 3, Nomor 1, Desember 2015 Poliherbal (Curcuma Xanthorriza, Kleinhovia hospita, Nigella sativa, Arcangelisia flava and Ophiochepalus striatus) on Heparmin in Mice (Mus musculus). Research & Development. Pt Royal Medicalink Pharmalab. 14. Koesoemadinata Pedoman Umum Pengujian Laboratorium Lethal Pestisida pada Ikan untuk Keperluan Pendaftaran. Komisic Pestisida Departemen Pertanian, Jakarta; 24 hal. 15. Kimmel, C.B., Ballard, W.W., Kimmel, S.R., Ullmann, B., & Schilling, T.F. (1995). Stages of embryonic development of the zebrafish, Developmental Dynamics, 203(3), C.F Skibola, M.T Smith. Potential health impacts of excessive flavonoid intake, Free. Radic. Biol. Med : Ramos,A., R. Rivero, A. Visozo, J. Piloto and A.Garcia Parthenin, a sesquiterpene lactone of Parthenium hysterophorus L. is a high toxicity clastogen. Mutat. Res., 514: Michael M. Givertz, MD Adenosine A1 Receptor Antagonists at a Fork in the Road. American Heart Association, Inc. 19. Omar, Z dkk Orthosiphon stamineus:traditional Uses, phytochemistry, Pharmacology, and Toxicology: A Review. J Med Food 15 (8) 2012, Penang, Malaysia. Kjeldsen, Keld Hypokalemia and Sudden Cardiac Death. Exp Clin Cardiol; 15 (4):e 96- e99. Page 26
