Nowoczesne Systemy Ekspresji Genów

Transcript

Nowoczesne systemy ekspresji genów Ekspresja genów w organizmach żywych GEN - pojęcia podstawowe promotor sekwencja kodująca RNA terminator gen   Gen - odcinek DNA zawierający zakodowaną informację wystarczającą do wytworzenia jednego rodzaju białka (definicja jest prawdziwa w odniesieniu do większości genów komórki, ale istnieją też geny, które kodują na przykład cząsteczki rRNA i tRNA) Cistron - sekwencja kodująca RNA, której ekspresja prowadzi do powstania pojedynczego łańcucha polipeptydowego GEN - pojęcia podstawowe   Promotor  Część genu, do której przyłączają się czynniki transkrypcyjne i polimeraza RNA. Jest jedną z części regulatorowych genu. Od przyłączenia polimerazy RNA do promotora rozpoczyna się transkrypcja Terminator  Odcinek genu, na którym kończy się transkrypcja GEN - pojęcia podstawowe  Sekwencje regulatorowe – części genu, które nie zawierają informacji genetycznej, ale kierują jej odczytywaniem  wzmacniacze ekspresji (Wz)  wygaszacze ekspresji (Wy)  inne - niezwiązane z działaniem czynników transkrypcyjnych, np. sekwencje liderowe DNA Ekspresja genów Ekspresja genów może zachodzić z różną wydajnością w zależności od środowiska i warunków gen a A A gen b A A A A B Ekspresja genów w organizmach prokariotycznych i eukariotycznych Prokariota Eukariota  Transkrypcja  Transkrypcja    Transkrypcja jest połączona z translacją Geny transkrybowane są przez jeden rodzaj polimerazy RNA Pod kontrolą jednego promotora może znajdować się więcej niż jeden cistron – taką jednostkę ekspresyjną nazywamy operonem    Transkrypcja jest rozdzielona od translacji Geny są transkrybowane przez trzy różne polimerazy RNA Pod kontrolą jednego promotora znajduje się jeden cistron Systemy ekspresji (nadekspresji) genów Nadekspresja białek - sens zastosowania Eksperyment – badanie represora lac  10 cząstek białka w jednej komórce  1 μmol cząsteczek potrzebny do badań biochemicznych  1 μmol = 6x1017 cząsteczek białka Czyli do eksperymentu potrzeba 6x1016 komórek  1 litr hodowli E. coli w fazie stacjonarnej zawiera ~4x1011 komórek  Czyli (zakładając 100% wydajność procesu oczyszczania) 1 μmol represora lac = 150000 litrów hodowli E. coli Zastosowanie  Badania podstawowe:  określenie struktury białek (NMR, krystalografia)  enzymologia manipulacje genetyczne (mutageneza)  badanie oddziaływań międzycząsteczkowych   Zastosowania terapeutyczne i komercyjne: medycyna  diagnostyka  przemysł chemiczny  przemysł spożywczy  Schemat postępowania  Klonowanie eukariotycznego cDNA lub genu prokariotycznego  (Przeklonowanie sekwencji do wektora ekspresyjnego)  Przeniesienie konstruktu do komórek gospodarza/komórek  Charakterystyka produktu (białka):  oczyszczanie  testy enzymatyczne Przygotowanie do eksperymentu  Wybór gospodarza  systemy in vivo (przykłady)       Escherichia coli Saccharomyces cerevisiae Pichia pastoris hodowla tkankowa komórek ssaczych organizmy transgeniczne wyspecjalizowane systemy in vitro Przygotowanie do eksperymentu  Wybór wektora  wydajność  sposób oczyszczania  modyfikacje potranslacyjne  konieczność przeprowadzenia modyfikacji genu/cDNA  koszt  stopień trudności http://www.biotechnantes.com/Conferences/Business%201/Jeudi/14h00/02%20Thiry.pdf#search=%22protein%20expression%20systems%20ppt%22 http://www.biotechnantes.com/Conferences/Business%201/Jeudi/14h00/02%20Thiry.pdf#search=%22protein%20expression%20systems%20ppt%22 Przygotowanie do eksperymentu  wybór protokołu klonowania/ekspresji  rodzaj białka  rozpuszczalność i stabilność białka  miejsce produkcji białka (cytoplazma, pożywka)  sposób oczyszczania białka Etap I – poszukiwanie informacji Źródła informacji gdy sekwencja genu jest znana 1. ― ― Publikacje naukowe zawierają informacje o systemach ekspresyjnych użytych do ekspresji danego genu powinny zawierać odnośnik do sekwencji genu w postaci tzw. „Accession No.” dla wybranej bazy danych dostępnej w internecie np. NCBI (www.ncbi.nih.gov) Źródła informacji gdy sekwencja genu jest znana 2. ― ― Bazy sekwencji nukleotydowych NCBI: National Centre for Biotechnology Information (Rockville Pike, Bethesda) Dostęp do sekwencji genów można uzyskiwać poprzez:  podanie accession no. uzyskany z publikacji (Vonakis et al. J. Biol. Chem. 272 (38), 24072-24080 (1997)) Accession No: AF000301 Jak zdobyć informacje o genie jeśli sekwencja jego nie jest znana – ale znana jest sekwencja białka lub jej fragmenty Sekwencję białka mozna poznać dysponując jego czystym preparatem dzięki ograniczonej proteolizie i sekwencjonowaniu uzyskanych peptydów Jak zdobyć informacje o genie jeśli jego sekwencja nie jest znana W oparciu o sekwencje białka można zaprojektować zdegenerowane startery, które użyjemy w reakcji PCR i uzyskamy: Który prążek wybrać do sekwencjonowania??? Należy oprzeć się o przybliżenie: 1 kD białka – 333 par zasad DNA i znaną masę białka (w kD) Jak zdobyć informacje o genie jeśli sekwencja jego nie jest znana i nie jest znana sekwencja białka ale: Znamy właściwości fizykochemiczne białka, przede wszystkim jego Mw:    W przypadku Prokariota możemy stworzyć bibliotekę DNA genomowego w celu uzyskania sekwencji W przypadku Eukariota możemy stworzyć bibliotekę DNA genomowego w celu uzyskania sekwencji Jak zdobyć informacje o genie jeśli nie jest znana jego sekwencja, ani sekwencja kodowanego przez niego białka Wykorzystując dane uzyskane z bibliotek cDNA możemy uzyskać sekwencję genów interesujących nas białek Jak zdobyć informacje o genie, jeśli znamy tylko jego źródło? Istnieje możliwość zastosowania zasady genomiki porównawczej:    Odnalezienie informacji o dostępności sekwencji analogicznych genów z najbliższych „taksonomicznie” krewnych Porównanie sekwencji nukleotydowych wybranych genów z organizmów pokrewnych do organizmu źródłowego Programy komputerowe Gene doc Programy komputerowe VectorNTI (INVITROGEN)   Contig Express AlignX AlignX MfAJ252337 McAY213657 MeAJ252330 rubrumAJ270808 Consensus (1) (1) (1) (1) (1) (1) (255) MfAJ252337(222) McAY213657(245) MeAJ252330(222) rubrumAJ270808(219) Consensus(255) 1 10 20 30 40 50 60 70 80 -------------------------------ATCATTAACGCGCAAGAGGTCGAAGTTGGCCCCCGAAGCTCTTCCGTCTCCCCCC --------TCCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTAACGCGCAAGAGGTCGAAGTTGGCCCCCGAAGCTCTTCCGTCTCCCCCC -------------------------------ATCATTAACGCGCAAGAGGTCGAAGTTGGCCCCCGAAGCTCTTCCGTCTCCCCCC ACAAGGTTTCCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTAACGCGCNGGCCG--GAGGCTGGCCCCCCACGAT---A----------TCCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTAACGCGCAAGAGGTCGAAGTTGGCCCCCGAAGCTCTTCCGTCTCCCCCC 255 260 270 280 290 300 310 320 CGCTCGCCGGAGGATTACTCTGGAAAACACACTCTTGAAAGAACATACCGTCTGAGCG---AGCAACGCAAAT CGCTCGCCGGAGGATTACTCTGGAAAACACACTCTTGAAAGAACATACCGTCTGAGCG---AGCAACGCAAAT CGCTCGCCGGAGGATTACTCTGGAAAACACACTCTTGAAAGAACATACCGTCTGAGCG---AGCAACGCAAAT CGCCCGCCGGAGGACAGACACCAAGAAAAAATTCTCTGAAGAGCTGTCAGTCTGAGCGTTTAGCAAGCACAAT CGCTCGCCGGAGGATTACTCTGGAAAACACACTCTTGAAAGAACATACCGTCTGAGCG AGCAACGCAAAT