Paulina Smyda - Ihar

Transcript

Ziemniak Polski 2012 nr 2 1 Hodowla i genetyka METODY ELIMINACJI WIRUSÓW Z ROŚLIN IN VITRO ZIEMNIAKA mgr Paulina Smyda IHAR – PIB, Oddział w Młochowie, ul. Platanowa 19, 05-831 Młochów e-mail: [email protected] ośliny rozmnażające się wegetatywnie, do których należy ziemniak uprawny (Solanum tuberosum L.), łatwo kumulują wirusy w różnych częściach rośliny, w tym w bulwach. W wyniku tego rośliny rozmnażane z bulw z każdym rokiem są coraz bardziej porażone wirusami. Choroby wirusowe osłabiają wigor roślin oraz obniżają odporność ziemniaka na inne patogeny, co prowadzi do obniżenia plonu i jakości bulw (Nascimento i in. 2003, Wang i in. 2008, Mahmoud i in. 2009). Dlatego też ważne jest, aby materiał służący do rozmnożeń, szczególnie sadzeniaki, był wolny od wirusów. Zdrowy materiał można uzyskać poprzez uwalnianie od wirusów zainfekowanych roślin. Do znanych metod uwalniania roślin należy kultura in vitro merystemów wierzchołkowych połączona z termo-, chemo- i/lub krioterapią (Mellor, Stace-Smith 1970; Mahmoud i in. 2009). Kultury in vitro pozwalają na szybkie namnożenie materiału roślinnego oraz poddanie roślin odpowiedniej terapii, prowadzącej do otrzymania zdrowych roślin o każdej porze roku (Nascimento i in. 2003). Najlepsze rezultaty daje zastosowanie co najmniej dwóch z wyżej wymienionych technik. R Kultura merystemów Rośliny przed wprowadzeniem do kultur in vitro są sprawdzane w testach ELISA pod kątem porażenia wirusami Y (PVY), M (PVM), X PVX), S (PVS) i liściozwoju (PLRV) ziemniaka. Sprawdzana jest także obecność wiroida wrzecionowatości bulw ziemniaka (PSTVd) i bakterii Clavibacter michiganen- sis, które są patogenami kwarantannowymi. Obecność patogenów kwarantannowych na ogół eliminuje formy z dalszej pracy. Spośród testowanych roślin wybiera się te, które są wolne od wirusów lub mają najniższą koncentrację wirusów. Z tych roślin pobiera się pędy wierzchołkowe i poddaje je sterylizacji powierzchniowej w celu ochrony przed infekcjami. Tak przygotowane rośliny wprowadza się w warunki in vitro. Jedną z najlepszych metod odwirusowywania zainfekowanych roślin jest kultura merystemów wierzchołkowych ziemniaka, którą można poprzedzić termo- lub chemoterapią (Nascimento i in. 2003, Awan i in. 2007). Kultura merystemów wierzchołkowych pędu jest pierwszą, najwcześniej stosowaną techniką eliminacji wirusów z roślin. Merystem wierzchołkowy pędu jest to mały, szczytowy jego obszar, który składa się z drobnych, szybko dzielących się komórek. W tych częściach rośliny nie ma wirusów lub ich koncentracja jest bardzo mała. Technika uwalniania roślin oparta na kulturze merystemów jest prosta, jednak ma pewne ograniczenia. Jest metodą długotrwałą, ponieważ czas regeneracji roślin wynosi od 6 do 8 tygodni. Izolowane merystemy muszą być bardzo małe (nie większe niż 0,3 mm), ponieważ efektywność eliminacji wirusów jest proporcjonalna do ich wielkości (Wang i in. 2006). W pracy tej wymagana jest duża precyzja w izolacji merystemów pod binokularem, gdyż drobne uszkodzenia mają wpływ na procent zregenerowanych merystemów wierzchołkowych (Dewi, Slack 1994). Termoterapia kultur in vitro 2 Ziemniak Polski 2012 nr 2 Termoterapia w celu eliminacji wirusów polega na traktowaniu roślin wysoką temperaturą przez określony czas (Kryszczuk 1999). Traktowanie roślin in vitro ziemniaka temperaturą 33-45oC przez ok. 2 tygodnie eliminuje kilka wirusów, głównie PLRV, PVY i wirus A (PVA), oraz niektóre systemiczne bakterie. Proces termoterapii rozpoczyna się od namnożenia porażonych wirusami roślin in vitro w drodze kultury wierzchołków i pąków bocznych pędów na pożywce regeneracyjnej MS (Murashige-Skooga). Po czterech tygodniach kultury rośliny in vitro przenosi się do komory fitotronowej, w której przez dwa tygodnie są poddawane wysokiej temperaturze, czyli termoterapii. Po termoterapii z roślin izoluje się merystemy wierzchołkowe wielkości 1 mm i umieszcza na pożywce MS wzbogaconej hormonami roślinnymi. Na efektywność termoterapii największy wpływ mają takie czynniki jak temperatura, czas trwania oraz wrażliwość genotypu na stres termiczny (Kryszczuk 1999). Rośliny niektórych genotypów na działanie wysokiej temperatury reagują stresem termicznym, pojawiają się na nich nekrozy lub dochodzi do zamierania całych roślin. Dlatego warunki termoterapii, czyli czas oraz wysokość temperatury, należy dostosować indywidualnie do poszczególnych genotypów. Ograniczeniem termoterapii jest jej czasochłonność i brak wrażliwości niektórych wirusów (PVM, PVS, PVX) na wysokie temperatury. Dodanie do pożywki związków zwiększających tolerancję roślin na wysoką temperaturę (kwasu salicylowego lub nadtlenku wodoru) indukuje termotolerancję i może zwiększyć przeżywalność roślin poddanych procesowi termoterapii (Lopez-Delgado i in. 1998, Lopez-Delgado i in. 2004). W niektórych przypadkach wzrost temperatury wywołuje jedynie zmniejszenie koncentracji wirusów w tkance roślinnej, a nie ich eliminację (Paet i in. 1990). Chemoterapia Coraz częściej stosowaną metodą uwalniania roślin ziemniaka od wirusów jest chemoterapia. Jest to metoda uzupełniająca w stosunku do termoterapii. W chemoterapii wykorzystuje się antymetabolity – związki chemiczne, naturalne lub syntetyczne, blokujące metabolizm wirusów oraz substancje induku- jące odporność na dane wirusy. Najczęściej wykorzystuje się analogi nukleotydów blokujące syntezę wirusowego RNA lub DNA (Nascimento i in. 2003). Antymetabolitem najbardziej znanym i najczęściej stosowanym do eliminacji wirusów z roślin ziemniaka jest rybawiryna (RBV). Jest to inhibitor replikacji wirusów ziemniaka, zwłaszcza PVM, PVS i PVX. Zaletą tej metody jest jej prostota. Chemoterapia połączona z kulturą merystemów wierzchołkowych może całkowicie eliminować wirusy X i Y ziemniaka (Klein, Livingston 1983). Związki antywirusowe są dodawane do pożywki w czasie trwania kultury. Efektywność działania rybawiryny może ulec osłabieniu, gdy koncentracja wirusa w roślinie jest wysoka lub gdy roślina jest zainfekowana kilkoma wirusami (Griffiths i in. 1990; Dewi, Slack 1994). Najlepszym sposobem eliminacji wirusów z roślin ziemniaka jest połączenie obydwu technik, termoterapii i chemoterapii, prowadzonych w warunkach in vitro (Griffiths i in. 1990, Nascimento i in. 2003). Krioterapia Krioterapia merystemów wierzchołkowych to stosunkowo nowa technika uwalniania roślin od wirusów, oparta na technice zamrażania merystemów w ciekłym azocie o temperaturze -196oC (Wang, Valkonen 2009). Po potraktowaniu zainfekowanych merystemów ciekłym azotem odmraża się je, a następnie regeneruje (Wang i in. 2009). W zregenerowanych roślinach nie ma wirusów lub ich koncentracja jest obniżona. Technika ta nie jest skomplikowana i można jednocześnie uwolnić od wirusów dużą liczbę próbek. Zoptymalizowana procedura krioterapii pozwala na efektywne uwalnianie roślin ziemniaka od wirusów, szczególnie od PVY i PLRV (Wang i in. 2009). Efektywność regeneracji roślin z merystemów po krioterapii wynosi od 10 do 85% w zależności od genotypu (Wang i in. 2006, Smyda 2011) i może być niższa w porównaniu z regeneracją z kultury merystemów. Jednak liczba roślin uwolnionych od wirusów metodą krioterapii jest większa, 83-95% dla PLRV i PVY, niż w metodzie kultur merystemów – 56-62% dla tych samych wirusów (Wang i in. 2006). Ziemniak Polski 2012 nr 2 Zastosowanie metod odwirusowywania roślin w oddziale IHAR-PIB w Młochowie W Młochowie prowadzi się prace mające na celu uwalnianie od wirusów cennych genotypów ziemniaka. Po uwolnieniu genotypy te zabezpiecza się w banku genów in vitro i/lub zostają one wprowadzone do ciekłego azotu i w takich warunkach są długoterminowo przechowywane (kriokonserwacja). Rośliny ziemniaka uwalnia się od wirusów w kulturach merystemów za pomocą uzupełniających się metod termo- i chemoterapii. Wprowadzone do kultur in vitro rośliny wyselekcjonowanych genotypów namnaża się na pożywce MS. Po uzyskaniu odpowiedniej liczby kopii roślin przystępuje się do procesu termoterapii. Czterotygodniowe, ukorzenione rośliny (ok. 20 z genotypu) umieszcza się w komorze fitotronowej z regulowaną temperaturą na 2 tygodnie. W czasie termoterapii wprowadza się fotoperiod: w ciągu dnia (16 godzin) temperatura wynosi 37oC, a podczas ośmiogodzinnej nocy jest obniżona do 35oC. Po zakończeniu termoterapii z roślin izoluje się merystemy wierzchołkowe i umieszcza je na pożywce MS wzbogaconej hormonami roślinnymi. Zregenerowane rośliny dzieli się na dwie kopie i ukorzenia na pożywce MS. Po ok. 4 tygodniach przeprowadza się test serologiczny ELISA w celu wykrycia wirusów. W wypadku stwierdzenia nieobecności któregokolwiek z wirusów w roślinie jej kopia zostaje przekazana do banku genów in vitro. Jeżeli nie uzyskano roślin wolnych od wirusów, stosuje się kolejny cykl termoterapii. Ponieważ w wyniku termoterapii usuwane są głównie PLRV i PVY, po cyklu termoterapii przeprowadza się proces chemoterapii, skierowany szczególnie na PVM, PVS i PVX. Jako środek przeciwwirusowy wykorzystuje się rybawirynę. Na pożywce MS z dodatkiem rybawiryny następuje namnożenie materiału roślinnego. Po 4 tygodniach izoluje się merystemy wierzchołkowe i umieszcza na pożywce MS z hormonami. Po ukorzenieniu dzieli się każdą z roślin na dwie kopie. Po ok. 4 tygodniach przeprowadza się test ELISA i podobnie jak to ma miejsce w termoterapii zdrowe rośliny zostają wprowadzone do banku genów in vitro. W ostatnim czasie, stosując połączone metody termo- i chemoterapii, uwolniono od 3 wirusów 24 genotypy ziemniaka i zabezpieczono je w kolekcji in vitro. Proces uwalniania roślin ziemniaka od wirusów wymaga ciągłej optymalizacji metod, uwzględniania indywidualnych reakcji poszczególnych genotypów, by zwiększyć efektywność terapii i uzyskać oczekiwane efekty. Literatura 1. Awan A. R., Mughal S. M., Iftikhar Y., Khan H. Z. 2007. In vitro elimination of potato leaf roll polerovirus from potato varieties. – Eur. J. Sci. Res. 18: 155-164; 2. Dewi I. S., Slack S. A. 1994. Therapy cycling to eliminate high-titered, multiple virus infection in vitro potato plantlets. – Bull. Agron. 22(2): 35-43; 3. Griffitths H. M., Slack S. A., Dodds J. H. 1990. Effect of chemical and heat therapy in virus concentrations in vitro potato plantlets. – Can. J. Bot. 68: 1515-1521; 4. Klein R. E., Livingston C. H. 1983. Eradication of potato viruses X and S from potato shoot tip cultures with ribavirin. – Phytopathology 65: 826-828; 5. Kryszczuk A. 1999. Termoterapia i kultura merystemów jako jedna z metod uzyskiwania roślin ziemniaka wolnych od wirusów. – Biul. IHAR 212: 151-157; 6. Lopez-Delgado H., Dat J. F., Foyer C. H., Scott I. M. 1998. Induction of thermotolerance in potato microplants by acetylsalicylic acid and H2O2. – J. Exp. Bot. 49(321): 713-720; 7. Lopez-Delgado H., Mora-Herrera M. E., Zavaleta-Mancera H. A., Cadena-Hinojosa M., Scott I. M. 2004. Salicylic acid enhanced heat tolerance and Potato Virus X (PVX) elimination during thermotherapy of potato microplants. – Am. J. Potato Res. 81: 171-176; 8. Mahmoud S. Y. M., Hosseny M. H., Abdel-Ghaffar M. H. 2009. Evaluation of some therapies to eliminate potato Y potyvirus from potato plants. – Int. J. Virol. 5(2): 64-76; 9. Mellor F. C., Stace-Smith R. 1970. Virus strain differences in eradication of potato virus X and S. – Phytopathology 60: 1587-1590; 10. Nascimento C. L., Pio-Ribeiro G., Willadino L., Andrade G. P. 2003. Stock indexing and potato virus Y elimination from potato plants cultivated in vitro. – Sci. Agric. 60(3): 525-530; 11. Paet C. N., Zamora A. B. 1990. Efficacy of thermotherapy and group culture of isolated potato meristems for elimination of single and mixed infections of Potato Virus Y, Potato Virus S and Potato Leaf Roll Virus. – Philipp J. Crop Sci. 15(2): 113-118; 12. Smyda P. 2011. Zastosowanie kriokonserwacji do przechowywania zasobów genowych ziemniaka. – Ziemn. Pol. 2: 12-15; 13. Wang Q., Liu Y., Xie Y., You M. 2006. Cryotherapy of potato shoot tips for efficient elimination of Potato Leafroll Virus (PLRV) and Potato Virus Y (PVY). – Potato Res. 49: 119-129; 14. Wang Q., Cuellar W. J., Rajamäki M-L., 4 Ziemniak Polski 2012 nr 2 Hirata Y., Valkonen J. P. T. 2008. Combined thermotherapy and cryotherapy for efficient virus eradication: relation of virus distribution, subcellular changes, cell survival and viral RNA degradation in shoot tips. – Mol. Plant Path. 9(2): 237-250; 15. Wang Q. C., Panis B., Engelmann F., Lambardi M., Valkonen J. P. T. 2009. Cryotherapy of shoot tips: a technique for pathogen eradication to produce healthy planting materials and prepare healthy plant genetic resources for cryopreservation. – Ann. Appl. Biol. 154: 351-363; 16. Wang Q., Valkonen J. P. T. 2009. Cryotherapy of shoot tips: novel pathogen eradication method. – Trends Plant Sci. 14(3): 119-122