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José António de Oliveira e Silva PROCESSOS PROTEOLÍTICOS E CARACTERÍSTICAS SENSORIAIS EM CARNE DE BOVINO DA RAÇA MARONESA Influência do ph final e tempo de maturação Dissertação apresentada à Universidade de Trásos-Montes e Alto Douro para obtenção do grau de Doutor em Ciência Alimentar, de acordo com o disposto no Decreto-Lei nº 216/92 de 13 de Outubro. UNIVERSIDADE DE TRÁS-OS-MONTES E ALTO DOURO VILA REAL, 2006 À minha família e em especial ao meu filho Pedro Agradecimentos Pela contribuição para a realização deste trabalho, gostaria de manifestar o meu sincero agradecimento: Ao Professor Doutor Armando Mascarenhas Ferreira, na qualidade de Reitor da Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro, o meu agradecimento pelas facilidades concedidas na realização deste trabalho, nomeadamente pela dispensa de serviço docente. À Professora Doutora Conceição Martins, a minha gratidão por ter aceite ser orientadora desta tese de Doutoramento, bem como o apoio e estímulo com que sempre me distingui ao longo da realização deste trabalho e em momentos particularmente determinantes. Ao Instituto Nacional de Investigação Agrária e das Pescas (INIAP), Programa Agro, Medida 8 - Desenvolvimento Tecnológico e Demonstração, Acção Desenvolvimento Experimental e Demonstração (DE&D) pelo suporte financeiro deste trabalho, incluindo a aquisição de equipamento. À Associação dos Criadores do Maronês, na pessoa da Engª Paula Teixeira e à Cooperativa Agrícola de Vila Real Agrupamento de produtores Carne Maronesa-DOP , na pessoa da Engª Marília Olhero, bem como ao Professor Doutor Virgílio Alves, pelas facilidades concedidas. À PEC-Nordeste, Penafiel, na pessoa do Sr. Engº César Vieira, pelas facilidades concedidas. Ao Engº João Monteiro e Engª Diana Silva pela sempre pronta disponibilidade e simpatia aquando das nossas deslocações à PEC-Nordeste. Ao Engº Paulo Fontes, do Departamento de Zootecnia, pela ajuda prestada na medição do ph das carcaças no matadouro da PEC-Nordeste. Aos serviços administrativos da UTAD, nomeadamente à D. Carla Barros pelo acompanhamento contabilístico do projecto, que suportou financeiramente este trabalho, e pela prontidão e simpatia manifestada. Aos serviços gráficos da UTAD, particularmente ao Sr. Emílio Santos, pelas facilidades concedidas na edição deste trabalho. À D. Graça Santos e D. Delmina Fraga pelo apoio em tarefas de secretaria. Aos técnicos do laboratório do Departamento de Ciências Veterinárias - Sector dos Produtos de Origem Animal da Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro, D. Ana Leite e em especial ao Sr Felisberto Borges, pelo apoio prestado em algumas tarefas. Aos meus estagiários Magda Lopes, Ana Fernandes e António Pires pela execução de algumas tarefas deste trabalho. Aos colegas e amigos Madalena Pinto, Alexandra Esteves, Conceição Fontes e Virgílio Falco pelo permanente incentivo e ombro amigo. Ao meu amigo e colega, de há longos anos, Luís Patarata um especial obrigado pela amizade, sugestões apresentadas e pelo determinante apoio nas minhas obrigações de docência. Aos amigos António Inês, Andrea Osório e Cristina Saraiva pela amizade incondicional e pelo apoio em momentos particularmente difíceis, nunca vos esquecerei. Aos meus pais e irmã pelo apoio e afecto imprescindíveis. Ao meu filho Pedro, pelo tempo que lhe roubei, em momentos tão importantes, obrigado pela tua compreensão filhote. ÍNDICE Resumo... vi Abstract...ix Lista de abreviaturas... xii Índice de quadros... xiv Índice de figuras... xvii INTRODUÇÃO... 1 PARTE I - REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 1. INTRODUÇÃO MODIFICAÇÕES DURANTE A MATURAÇÃO DA CARNE Modificações bioquímicas Proteínas miofibrilhares Tecido conjuntivo Modificações ultra-estruturais das miofibrilhas Degradação da linha Z Diminuição da densidade da linha M Separação do sarcolema Fragmentação das miofibrilhas na banda I Fissura longitudinal das miofibrilhas Perda do alinhamento transversal das miofibrilhas Outras modificações das proteínas miofibrilhares MECANISMOS ENVOLVIDOS NA MATURAÇÃO DA CARNE Mecanismos enzimáticos Proteases dependentes do cálcio: calpaínas i Perspectiva histórica Caracterização molecular das calpaínas Mecanismo de activação das calpaínas Autólise das calpaínas Activadores das calpaínas Calpastatina, o inibidor específico das calpaínas Outros inibidores das calpaínas Isoformas das calpaínas Acção proteolítica das calpaínas nas proteínas miofibrilhares e relação com a maturação da carne Proteases lisossomais: catepsinas Tipos e características gerais Regulação da actividade Acção proteolítica das catepsinas nas proteínas miofibrilhares e relação com a maturação da carne Proteassoma Estrutura e características gerais Regulação da actividade Acção proteolítica do proteassoma nas proteínas miofibrilhares e relação com a maturação da carne Serina proteases Características gerais Acção proteolítica das serina proteases nas proteínas miofibrilhares e relação com a maturação da carne Caspases Características gerais Acção proteolítica das caspases nas proteínas miofibrilhares e relação com a maturação da carne Mecanismos não enzimáticos Força iónica Teoria da interacção actina-miosina Teoria da tenrificação pelos iões cálcio ii PARTE II - TRABALHO EXPERIMENTAL 4. OBJECTIVOS MATERIAL E MÉTODOS Avaliação da ocorrência de carnes DFD Influência do ph f e tempo de maturação nos processos proteolíticos e nas características sensoriais Amostras ph e temperatura Comprimento dos sarcómeros Perdas por cocção Força de corte Cor Análise sensorial Determinação da actividade da catepsina D Obtenção das fracções livre e ligada Determinação da actividade enzimática Determinação da actividade da -calpaína, m-calpaína e da calpastatina Preparação dos extractos Separação cromatográfica Determinação da actividade enzimática Electroforese em SDS-PAGE Preparação das miofibrilhas Separação electroforética em SDS-PAGE das proteínas miofibrilhares Western blotting Electrotransferência das proteínas Incubação com os anticorpos Detecção Análise dos dados iii 6. RESULTADOS E DISCUSSÃO Avaliação da ocorrência de carnes DFD Influência do ph f e tempo de maturação nos processos proteolíticos e nas características sensoriais Parâmetros tecnológicos e sensoriais da carne ph 3h, T 3h, ph f e comprimento dos sarcómeros Força de corte e tenrura avaliada sensorialmente Perdas por cocção e suculência avaliada sensorialmente Flavor e apreciação global avaliadas sensorialmente Coordenadas de cor L*a*b* Actividade da catepsina D Actividade da -calpaína, m-calpaína e calpastatina Actividade enzimática isolada Relação -calpaína/calpastatina e m-calpaína/calpastatina Degradação das proteínas miofibrilhares Titina Nebulina e Filamina Bandas 145-kDa e 110-kDa Actinina e banda 97-kDa Bandas 85-kDa e 83-kDa Desmina Bandas 56-kDa e 43-kDa Troponina T e bandas de 34 kda a 24 kda Troponina I e bandas de reduzida massa molecular Relação dos vários parâmetros com a tenrura Parâmetros tecnológicos e sensoriais da carne Actividade enzimática Degradação miofibrilhar CONCLUSÕES BIBLIOGRAFIA iv ANEXO I ANEXO II ANEXO III v Resumo Durante o processo de transformação do músculo em carne, vários factores condicionam os processos bioquímicos e físicos, que influenciam de forma marcante a qualidade final da carne. Entre estes factores, o ph final (ph f ) da carne é referido como um importante condicionador das características sensoriais e tecnológicas da carne. A tenrura é, na carne de bovino, particularmente importante contudo, o tipo de relação existente entre o ph f e a tenrura, bem como as suas causas não são unanimemente aceites. Durante o armazenamento da carne (maturação), existem evidências que, a degradação de algumas proteínas miofibrilhares poderão contribuir para a tenrificação da carne. O envolvimento de proteases endógenas, principalmente as catepsinas e as calpaínas, ainda que extensivamente estudadas, tem conduzido a resultados controversos. Pelo contrário, os conhecimentos sobre o efeito do ph f da carne de bovino na actividade enzimática e na degradação miofibrilhar são praticamente inexistentes. Com o presente trabalho, pretendeu-se contribuir para o conhecimento da influência do ph f da carne de bovino da raça Maronesa e tempo de maturação, ao nível da proteólise miofibrilhar e da actividade enzimática das calpaínas e catepsina D. As repercussões ao nível das características tecnológicas e sensoriais da carne foram, igualmente, avaliadas. Visando colmatar a falta de dados relativos à ocorrência de carnes com ph f elevado (DFD), avaliou-se a ocorrência deste tipo de carnes nesta raça bovina. A avaliação da ocorrência da condição DFD foi efectuada em 277 carcaças ao longo de um ano, procedendo-se à avaliação do ph f (avaliado às 24 horas post mortem, pm) nos músculos longissimus lumborum, semimembranosus e psoas major. Para a avaliação da influência do ph f e tempo de maturação, após abate em matadouro comercial, foram recolhidas amostras às 3 h pm (dia 0) no músculo longissimus thoracis et lumborum (n=30) de bovinos machos da raça Maronesa. Às 24 h pm (dia 1), após a excisão deste músculo, foi dividido em porções que embaladas sob vácuo foram refrigeradas (4ºC) até aos dias 3, 7 e 14 pm. Com base no ph f os músculos foram divididos em três grupos: grupo Normal (ph 5,8), grupo DFD moderado (DFDmod, 5,8 pH 6,2) e DFD (ph 6,2), para a avaliação da ocorrência da condição DFD e do efeito do ph f e tempo de maturação. A avaliação da ocorrência DFD, revelou 25,3% de casos DFD no músculo longissimus lumborum, 8,7% no músculo semimembranosus e apenas 1,4% no músculo psoas major. A ocorrência da condição DFD no músculo longissimus lumborum, foi nos machos 8 vezes superior à das fêmeas (40,0 e 5,1% respectivamente). O ph f da carne influiu, de forma marcante, nas características sensoriais e tecnológicas da carne. A carne DFD foi considerada pelo painel como sendo mais tenra, mais suculenta, com um melhor flavor e melhor pontuada em termos de apreciação global. A carne DFD apresentou uma capacidade de retenção de água (CRA) superior à da carne Normal e uma menor força de corte. Neste trabalho foi encontrado uma relação linear entre a tenrura, avaliada tanto pelo painel como pela força de corte, não tendo sido encontrada uma influência do ph f no encurtamento muscular, avaliado pelo comprimento dos sarcómeros. A maior tenrura da carne DFD fez-se notar desde o dia 1 pm e, mesmo após 14 dias de armazenamento a 4ºC, manteve-se mais tenra do que a carne Normal. O efeito do tempo pm no incremento da tenrura fez-se sentir duma forma particularmente evidente do dia 1 ao dia 3 nos três grupos de ph f. A maturação da carne vi também exerceu um efeito positivo na avaliação da suculência e da apreciação global, mas apenas nos grupos Normal e DFDmod. O armazenamento da carne até aos 14 dias pm não teve repercussões negativas no flavor da carne. Contrariamente aos parâmetros referidos, o ph f teve um efeito negativo na cor. A carne DFD apresentou uma cor mais escura (menor L*), menos vermelha (menor a*) e menos amarela (menor b*), comparativamente à carne Normal. Estas carnes têm ainda, quando expostas ao ar, uma menor capacidade de adquirir a cor vermelha brilhante atraente para o consumidor e característica da carne com ph f normal. A avaliação da actividade enzimática da catepsina D revelou que, ao longo do período de maturação da carne, ocorreu o aumento da fracção livre em todos os grupos de ph f. A actividade desta enzima foi semelhante nos três grupos para os dias 0 a 7 pm, no entanto no dia 14 o grupo DFDmod apresentou uma actividade ligeiramente superior à dos outros grupos. Os resultados sugerem que, durante o armazenamento em refrigeração, pode ocorrer a desestabilização das membranas lisossomais, com a libertação destas enzimas para o espaço miofibrilhar, podendo desta forma entrar em contacto com o substrato e assim exercer a sua acção proteolítica ao nível das proteínas miofibrilhares, ainda que a actividade da catepsina D não mostrou restar relacionada com a tenrura da carne. A -calpaína sofreu uma perda de actividade substancial ao longo do período pm, em todos os grupos de ph f, indicando a sua autólise, activação e perda de actividade. A actividade da m- calpaína, pelo contrário, manteve-se constante sugerindo que não desempenha um papel central na degradação miofibrilhar. A calpastatina, inibidor natural das calpaínas, decresceu de forma acentuada, ao longo do tempo pm, no entanto, a perda de actividade foi dependente do ph f. No grupo DFD a diminuição da actividade da calpastatina foi menos acentuada que nos restantes grupos resultando que aos 3 e 7 dias pm a actividade inibitória foi superior no grupo DFD. A maior actividade da calpastatina no grupo DFD, contraria uma possível acção proteolítica superior na carne com um ph f mais propício à sua actividade, se bem que a menor actividade da -calpaína, observada no dia 3 pm no grupo DFD, possa resultar de uma maior actividade proteolítica, contribuindo para a maior tenrura desta carne. Neste dia pm a actividade da - calpaína correlacionou-se com a tenrura avaliada sensorialmente. A avaliação da degradação miofibrilhar por SDS-PAGE e por Western blotting, revelaram que várias proteínas miofibrilhares são degradadas ao longo do período pm, com o aparecimento de polipéptidos resultantes da sua degradação. As proteínas titina, nebulina, filamina, desmina, troponina T e I, foram degradadas durante o periodo pm, mas a taxas diferentes. O polipéptido 29 kda, referido como indicador geral da proteólise, aumentou de intensidade ao longo do período pm, mas de uma forma mais acentuada no grupo Normal, não estando relacionado com a tenrura da carne. A incubação com o anticorpo anti-troponina T revelou que este polipéptido é um produto da degradação da troponina T. A titina sofreu uma degradação pm lenta, mas visível após o dia 1, sugerindo pela analise do fragmento 1200-kDa, uma degradação ligeiramente superior no grupo DFD, relacionando-se com a tenrura. Foi, igualmente, demonstrada a degradação da nebulina ao longo do período pm nos três grupos de ph f, que ocorreu a uma taxa superior à degradação da titina. A avaliação da densidade da banda nos géis e a incubação com o anticorpo anti-nebulina por Western blotting, revelaram que a degradação foi menor no grupo DFD. A desmina foi igualmente outra proteína miofibrilhar que sofreu proteólise, ao longo do tempo pm em todos os grupos de ph f, contudo no grupo DFD foi observada uma maior degradação, logo nos primeiros dias pm, quer pela intensidade das bandas quer por Western blotting, após incubação com o anticorpo antidesmina. A degradação desta proteína mostrou estar relacionada com a tenrura da carne. A degradação lenta e parcial da filamina e troponina I, durante o periodo pm, não foi influenciada pelo ph f da carne, nem se relacionou com a tenrura. O ph f da carne exerceu, ao nível da vii degradação miofibrilhar, um efeito diferencial, dependente do tipo de proteína. A maior degradação verificada no grupo DFD das proteínas titina e principalmente desmina, poderão contribuir para a maior tenrura da carne DFD. Os resultados obtidos, no presente trabalho revelaram que o ph f da carne influiu marcadamente nas características sensoriais e tecnológicas da carne, nomeadamente na tenrura. Exceptuando a cor, a carne DFD apresentou melhores características sensoriais e tecnológicas, devendo ser reavaliado o efeito negativo do ph f na qualidade da carne. A diminuição da actividade da -calpaína e o aumento da actividade da fracção livre da catepsina D, bem como a observação da degradação de proteínas miofibrilhares, que são passíveis de ser degradadas pelas calpaínas e catepsinas, sugerem que estas enzimas poderão contribuir para a proteólise miofibrilhar e por conseguinte pelo aumento da tenrura ao longo do período pm. Não excluindo a influência da CRA na maior tenrura da carne DFD, a observação duma maior degradação da titina e especialmente da desmina, sugerem que a degradação destas proteínas poderão estar igualmente implicadas na maior tenrura da carne DFD. O efeito diferencial do ph f na degradação miofibrilhar, realça a natureza complexa dos processos de tenrificação da carne. Palavras chave: Qualidade da carne de bovino, ph final, maturação, calpaínas, catepsina D, proteólise miofibrilhar. viii Abstract During the conversion of muscle to meat, several factors that conditioning the biochemical and physical phenomenon, greatly affects meat quality. Among these factors, the ultimate meat ph (ph u ) is referred as an important conditioning factor of sensorial and technological meat characteristics. The tenderness is in beef meat an important quality factor, however the type of relationship between ph u and tenderness and the causes of this relationship are not unanimously accepted. Evidences exists that the degradation of some proteins during storage of meat contributes to meat tenderisation. The role of endogenous proteases, mainly cathepsins and calpains, despite extensive research, is still not clearly established. In contrast, the studies of the effect of ph u of beef meat on enzymatic activity and on myofibrillar degradation are practically inexistent. The present work, intended to contribute to the knowledge of the influence of ph u of bovine Maronesa meat and ageing period on myofibrillar proteolysis and on the activity of calpains and cathepsin D. The consequences on technological and sensorial characteristics of the meat were also evaluated. In order to resolve the lack of data regarding the occurrence of meat with high ph u (DFD), such occurrence was evaluated in this bovine breed. The evaluation of DFD occurrence was done during one year in 277 carcasses on longissimus lumborum, semimembranosus and psoas major muscles, by measure of the ph u (at 24 hours post mortem, pm). For evaluation of the influence of ph u and ageing, after slaughter in commercial abattoir, samples were collected at 3 h pm (day 0) on the muscle longissimus thoracis et lumborum (n=30) of males of Maronesa breed. At 24 h pm (day 1), the muscle was excised, divided in portions, vacuum packed and aged (4ºC) to 3, 7 and 14 days pm. Based on ph u, the muscles where grouped into three classes: normal (ph 5.8), moderated DFD (DFDmod, 5.8 pH 6.2) and DFD (ph 6.2), for the evaluation of DFD incidence and the effect of phu and ageing period. The evaluation of DFD occurrence showed 25.3% of cases on longissimus lumborum muscle, 8.7% on semimembranosus and only 1.4% on psoas major muscle. The occurrence of DFD condition in males was 8 times higher than in females on longissimus lumborum muscle (40.0 and 5.1%). The meat ph u influenced the sensorial and technological characteristics of meat. The DFD meat was considered by the sensory panel as being more tender, more juicy, with a better flavour and with the best global appreciation. The DFD meat presented a higher water holding capacity (WHC) than Normal meat and a smaller shear force. In this work a linear relationship between tenderness (evaluated by the panel and by shear force) and ph u was found. It was not found any influence of the ph u on cold shortening, evaluated by sarcomere length. The higher tenderness of DFD meat was observed since day 1 pm and, even after 14 days of storage at 4ºC, it was still more tender than the Normal meat. The effect of the duration of ageing in the increment of the tenderness was particularly evident from day 1 to day 3 in the three groups of ph u. The ageing of the meat had also a positive effect on juiciness and global appreciation, but only in the Normal and DFDmod groups. Meat storage during 14 days pm did not have a negative effect on flavor. Contrarily to the above mencioned parameters, the ph u had a negative effect on meat colour. The DFD group presented a darker colour (lower L*), less red (lower a*) ix and less yellow (lower b*) comparatively to the Normal meat. This meat also had, when exposed to air, a lower capacity to acquire the cherry red colour
