Techniki I Markery Molekularne W Badaniach Zmienności

Transcript

Przeglądy – Overviews Notatki Ornitologiczne 2007, 48: 193–206 Techniki i markery molekularne w badaniach zmienności genetycznej ptaków Magdalena Zagalska-Neubauer, Anna Dubiec Sekwencja DNA, czyli ułożenie zasad w łańcuchu kwasu dezoksyrybonukleinowego, niesie dane o zmienności genetycznej osobnika, która może być analizowana na poziomie nukleotydów, genów i całych genomów. Ponieważ zmienność ta ma charakter jakościowy, może być identyfikowana za pomocą tzw. markerów genetycznych i analizowana w obrębie i między populacjami oraz na poziomie gatunków. Narzędziem umożliwiającym analizę zmienności genetycznej są techniki molekularne, wśród których kluczową rolę odgrywa reakcja łańcuchowa polimerazy, czyli PCR (ang. Polymerase Chain Reaction), technika opracowana w latach 1980. Niniejsza praca stanowi przegląd podstawowych zagadnień dotyczących badania zmienności genetycznej ptaków w oparciu o markery molekularne z wykorzystaniem technik bazujących na reakcji PCR. Oprócz przybliżenia pojęć i zasad dotyczących pracy z materiałem biologicznym i użyciem techniki PCR, przedstawiamy przykłady wykorzystania markerów molekularnych w badaniach zmienności genetycznej ptaków na poziomie populacyjnym i gatunkowym. Praca adresowana jest głównie do biologów-ornitologów, którzy nie posługiwali się jeszcze technikami molekularnymi, ale rozważają ich wykorzystanie w swoich badaniach. Zaznaczyć należy, że dla lepszego zrozumienia przedstawianych treści, nieodzowna jest podstawowa wiedza na temat właściwości i budowy materiału genetycznego (np. Krzanowska et al. 2002). Czytelnikom pragnącym poszerzyć swoją wiedzę na temat wykorzystania technik molekularnych w badaniach oraz specyfiki poszczególnych technik, polecamy książki wydane w Polsce: Berg & Singer (1997), Tuner et al. (2000), Pilot & Rutkowski (2005), King & Stansfield (2002) oraz pozycje anglojęzyczne: Avise (1994) oraz DeSalle & Schierwater (1998). Materiał biologiczny w terenie i laboratorium Pobieranie materiału biologicznego i izolacja DNA. Materiał biologiczny, z którego izolowane jest DNA może być pozyskiwany przyżyciowo, na drodze inwazyjnej lub nieinwazyjnej. W sposób nieinwazyjny materiał pobierany jest np. z odchodów (Regnaut et al. 2006), piór, które wypadły ptakom podczas pierzenia (Taberlet et al. 1999), z błony pergaminowej wyścielającej wewnętrzną powierzchnię skorupy jaja (Strausberger & Ashley 2001) lub też z innych części organicznych pochodzących z gniazda (Pearce et al. 1997). Od ptaków chwytanych można pobrać wymaz ze śluzówki policzkowej i języka (Handel et al. 2006). Ponadto, DNA może być wyizolowane z tkanek okazów muzealnych, np. z kości (Hagelberg et al. 1992) i piór (Ellegren 1991, Leeton et al. 1993). Badania związane z odłowem ptaków umożliwiają pozyskanie materiału genetycznego na drodze inwazyjnej, przez pobieranie krwi lub piór. Głównym źródłem DNA w krwi są jądrzaste erytrocyty, a w przypadku piór – komórki przylegające do nasady dudki (Morin et al.1994), gdy pióro znajduje się w fazie wzrostu lub ze skrzepu krwi znajdującego się wewnątrz stosiny piór wyrośniętych (Horváth et al. 2005). W przypadku osobników martwych lub zamarłych jaj do badań pobierane mogą być fragmenty tkanek z wątroby, mózgu lub tarczki zarodkowej. 193 Pobieranie materiału do analiz molekularnych powinno być prowadzone w sposób, który zminimalizuje ryzyko kontaminacji materiału, tj. zanieczyszczenie go obcym DNA. W trakcie gromadzenia materiału biologicznego należy przestrzegać następujących zasad: w miarę możliwości używać jednorazowych rękawiczek lub każdorazowo przemywać ręce alkoholem, używać jednorazowego sprzętu do pobierania materiału (kapilary, igły), miejsce iniekcji przetrzeć alkoholem, narzędzia wielokrotnego użytku (skalpel) dokładnie wyczyścić przed powtórnym użyciem, w trakcie pobierania materiału unikać dotykania miejsc gdzie może być inne DNA, unikać rozmowy czy kichania w trakcie pobierania materiału. Bezpośrednio po pobraniu materiał należy umieścić w jednorazowych, sterylnych probówkach typu eppendorf i przechowywać w środkach konserwujących, np. w stężonym alkoholu 96%, buforze EDTA lub buforze lizującym Qeen (Seutin et al. 1991). Każda próbka powinna być opisana w sposób umożliwiający łatwą identyfikację osobnika. Bardzo istotne w trakcie pobierania krwi od ptaków jest zminimalizowanie czasu i stresu związanego z zabiegiem. Całkowita objętość krwi ptaka to zwykle ok. 6–8 ml na 100 g masy ciała (Sturkie 1986). Według różnych autorów bezpieczne jest pobranie od 3–4% (Lubjuhn et al. 1998) do 10–20% całkowitej objętości krwi (Hoysak & Weatherhead 1991). W praktyce pobiera się zwykle ok. 30–60 µl krwi. Krótkotrwałe przechowywanie zebranych próbek zwykle nie wymaga specjalnych warunków, natomiast próby, które będą analizowane w okresie późniejszym mogą być przechowywane w lodówce w 4°C, lub zostać zamrożone w –20°C lub –40°C. W takich warunkach DNA jest stabilne i próby można przechowywać przez wiele lat. Przed przystąpieniem do analiz molekularnych konieczne jest wyizolowanie DNA z komórek pobranego materiału. W trakcie izolacji otrzymuje się DNA oczyszczone ze zbędnych składowych komórki, tj. białek i RNA. Uwolnienie DNA z jądra komórkowego i usunięcie zanieczyszczeń jest możliwe dzięki zastosowaniu różnego rodzaju detergentów, rozpuszczalników lub enzymów. Obecnie, powszechnie do izolacji i oczyszczania DNA wykorzystuje się komercyjne zestawy, które oferuje wiele firm zajmujących się sprzedażą odczynników stosowanych w analizach molekularnych. Oprócz firmowych zestawów do izolacji DNA można stosować też tańsze, jednak bardziej pracochłonne rozwiązania. Tradycyjna metoda ekstrakcji DNA polega na trawieniu białek proteinazą K oraz oczyszczaniu ekstraktu mieszaniną fenolu i chloroformu (Sambrook et al. 1989). Stosunkowo tanią i szybką metodą izolacji DNA jest metoda wykorzystująca chelex (Walsh et al. 1991). Łańcuchowa reakcja polimerazy (PCR) oraz wybrane techniki wykorzystujące tę metodę. Łańcuchowa reakcja polimerazy polega na namnażaniu z całkowitego DNA jego wyselekcjonowanych fragmentów (McPherson et al. 1995). Proces ten jest możliwy dzięki zdolności DNA do samopowielania oraz zastosowaniu enzymu polimerazy, specyficznych odcinków DNA, tzw. starterów i obecności wolnych nukleotydów. Ważnym etapem jest wybór odpowiedniej pary starterów, które będą przyłączać się do fragmentów flankujących poszukiwaną sekwencję DNA. Sekwencje starterowe są projektowane przy użyciu specjalnie do tego przeznaczonych programów (np. Abd-Elsalam 2003) lub też mogą być wykorzystywane sekwencje już znane, dostępne w publikacjach. Startery są zwykle krótkimi, 20-nukleotydowymi odcinkami, które przyłączają się do DNA na zasadzie komplementarności przy udziale polimerazy. Niektóre techniki, jak np. RAPD (ang. Random Amplified Polymorphic DNA) wykorzystują pojedynczy starter o sekwencji losowej. W efekcie amplifikowane są przypadkowe fragmenty genomu, o nieznanej funkcji i lokalizacji. Klasyczna łańcuchowa reakcja polimerazy składa się z trzech, wielokrotnie (30–40 razy) powtarzających się etapów, w trakcie których kontrolowane zmiany temperatury w termocyklerze powodują: 194 1) denaturację dwuniciowego DNA – pod wpływem wysokiej temperatury (ok. 94–95°C) dochodzi do rozplecenia podwójnej helisy DNA i zatrzymania reakcji enzymatycznych, powstaje DNA jednoniciowe; 2) wiązanie starterów, tzw. annealing – w warunkach obniżonej temperatury (ok. 54–60°C) startery przyłączają się do pojedynczej nici DNA, która zawiera poszukiwaną przez badacza sekwencję; 3) wydłużanie, czyli syntezę nici komplementarnej – w podwyższonej temperaturze (ok. 72°C) enzym, polimeraza DNA, katalizuje przyłączanie wolnych nukleotydów i w efekcie odbudowane zostaje DNA dwuniciowe w obrębie poszukiwanego fragmentu. Po zakończeniu reakcji cyklicznych przeprowadzana jest kilku-kilkunastominutowa inkubacja w ok. 72°C. Jest to tzw. końcowe wydłużanie, które ma na celu dokończenie syntez rozpoczętych w poprzednich cyklach. Reakcja PCR prowadzi do namnożenia bardzo dużej n liczby wybranych fragmentów DNA (2 , gdzie n oznacza liczbę powtórzeń 3 etapowego cyklu). W efekcie poszukiwane fragmenty DNA mają przewagę ilościową nad innymi fragmentami, co ułatwia ich późniejszą identyfikację w próbie zawierającej całkowite DNA organizmu. Wiarygodność i powtarzalność reakcji PCR zależy od tzw. optymalizacji warunków reakcji (Kidd & Rauno 1995). Oznacza to, że dla danego gatunku czy docelowej sekwencji DNA często wymagane jest ustalenie indywidualnych warunków reakcji poprzez eksperymentalną manipulację: ilości DNA, ilości i stężenia reagentów, temperatury przyłączania starterów lub liczby powtórzeń cykli temperaturowych. Technika PCR może być poddawana różnym modyfikacjom, w zależności od analizowanego markera genetycznego, jednak zasada działania reakcji we wszystkich przypadkach pozostaje taka sama. Technika polimorfizmu losowo amplifikowanych sekwencji DNA, czyli RAPD wykorzystuje tzw. starter arbitralny, zwykle o długości 10-nukleotydów (Williams et al. 1990, Welsh & McClelland 1990). Losowa sekwencja krótkiego startera oraz stosunkowo niska temperatura przyłączania startera do nici DNA (zwykle około 35–40°C) wpływają na obniżenie specyfiki reakcji, a tym samym pozwalają na przyłączenie się startera w wielu miejscach w genomie (Williams et al. 1990, Bowditch et al. 1993). Pozwala to wygenerować znaczną liczbę polimorficznych fragmentów DNA (Rothuizen & van Wolferen 1994, Gu et al. 1997). Cecha ta jest zaletą przy badaniu polimorfizmu, ale może jednocześnie stanowić poważną wadę techniki, gdyż niska temperatura przyłączania startera sprzyja powstawaniu fragmentów niespecyficznych, tzw. struktur drugorzędowych w matrycowym DNA. Struktury te inhibują namnażanie lub też mogą zaburzać proces wydłużania nowej nici przez polimerazę. Prowadzić to może do niskiej powtarzalności wyników (Bowditch et al. 1993), dodatkowo potęgowanej przez szczególną wrażliwość techniki na zmiany warunków namnażania (Benecke 1998). Inną techniką pozwalającą wygenerować bardzo dużą liczbę polimorficznych, anonimowych fragmentów DNA jest technika określana jako polimorfizm długości amplifikowanych fragmentów, czyli AFLP (ang. Amplified Length Fragment Polymorphism) (Vos et al. 1995). Metoda ta łączy w sobie reakcję PCR i trawienie enzymami restrykcyjnymi. Pierwszy etap obejmuje trawienie całkowitego DNA genomowego dwoma różnymi enzymami restrykcyjnymi: jeden rozpoznaje w obrębie DNA liczne miejsca trawienia, natomiast drugi trawi DNA w małej liczbie miejsc. Enzymy w miejscach cięcia generują powstanie tzw. lepkich końców, do których w następnym etapie tzw. ligacji, przyłączane są 20–30 nukleotydowe adaptory. Kolejnym etapem jest amplifikacja niespecyficzna, tzw. preamplifikacja, w której bierze udział enzym oraz dwa startery. Startery dobrane są w ten sposób, aby były komplementarne do sekwencji adaptora i miejsca restrykcyjnego. Dodatkowo, na końcu 3’ startery posiadają jeden selektywny nukleotyd, np. cytozynę. W ostatnim etapie, amplifika195 cji specyficznej, wykorzystywana jest niewielka frakcja produktów poprzedniej preamplifikacji. Na tym etapie stosuje się dwa startery najczęściej wyposażone w jeszcze dwa dodatkowe nukleotydy na końcu 3’ (Bensch & Åkesson 2005). Dla większości gatunków wdrożenie techniki AFLP nie jest nadmiernie czasochłonne, w odróżnieniu od analiz markerów mikrosatelitarnych czy sekwencjonowania, i pozwala na przestudiowanie wielu loci (nawet powyżej 1000) przy umiarkowanych kosztach (Blears et al. 1998, Mueller & Wolfenbarger 1999). Problematyczny w analizie wyników, podobnie jak w technice RAPD, jest zwykle dominujący charakter wykrywanych fragmentów, czyli niemożność odróżnienia homozygoty dominującej od heterozygoty. Dominująca natura otrzymywanych fragmentów może zaburzać lub zafałszowywać wyniki, szczególnie w przypadku wykorzystywania metody w analizie pokrewieństwa osobników. Metoda SSCP (polimorfizm konformacyjny jednoniciowego DNA, ang. Single-Stranded Conformation Polymorphism) wykorzystuje reakcję PCR, jednak wykrywany polimorfizm wynika z różnic konformacyjnych jednoniciowego DNA (Orita et al. 1989). Łańcuchowa reakcja polimerazy z odpowiednimi starterami pozwala wyselekcjonować poszukiwane fragmenty DNA. Otrzymane produkty reakcji PCR, o długości do 250–300 par zasad (pz; ang. bp, base pare), poddaje się działaniu wysokiej temperatury (denaturacja produktu), a następnie przeprowadza się elektroforezę w żelu poliakrylamidowym. Odpowiednie warunki elektroforezy, tj. niska temperatura i niedenaturujące warunki, prowadzą do powstania pojedynczych łańcuchów DNA, tzw. ssDNA (ang. single-stranded DNA). Łańcuchy DNA różniące się składem zasad formują struktury (konformery) różniące się kształtem, powodujące różnice w mobilności fragmentów w strukturze żelu. Prawdopodobnie związane jest to z różnicami w trzeciorzędowej budowie cząsteczek DNA (Liu et al. 1999). Za pomocą techniki SSCP skanowane mogą być geny oraz polimorfizm anonimowych sekwencji DNA genomowego (Karl et al. 1992, Orti et al. 1997, Sunnucks et al. 2000). Zastosowanie metody SSCP do detekcji różnic w składzie zasad, a więc mutacji w łańcuchu DNA, w znacznym stopniu redukuje konieczność automatycznego sekwencjonowania wielu prób. Wykorzystanie techniki SSCP, jako metody przesiewowej, obniża koszty badań, gdyż sekwencjonowane są tylko te fragmenty DNA, o których wiadomo, że różnią się od siebie składem zasad. Optymalizacja warunków SSCP zwykle nie jest uciążliwa, należy jednak pamiętać, że zmiana warunków reakcji, jak np. temperatura elektroforezy, skład żelu czy buforów, przyłożone napięcie, może wpływać na czułość metody, a tym samym na powtarzalność wyników. Analiza powielonych w reakcji PCR wytypowanych fragmentów DNA, zwanych produktami reakcji, polega na wizualizacji otrzymanych fragmentów, w postaci prążków lub graficznych „pików”, i możliwa jest dzięki elektroforezie lub sekwencjonowaniu. Klasyczna analiza produktów prowadzona jest z użyciem aparatu do elektroforezy. W trakcie elektroforezy fragmenty DNA różniące się wielkością i/lub kształtem przemieszczają się w żelu z różną prędkością pod wpływem przyłożonego pola elektrycznego, prowadząc do rozdzielenia tych fragmentów. Na uzyskanie dobrej jakości rozdziału elektroforetycznego mają wpływ takie czynniki, jak napięcie i czas rozdziału podczas elektroforezy. Produkt PCR, wraz ze związanym wcześniej barwnikiem (np. bromek etydyny, związki srebra, sybr), nakłada się na żel agarozowy lub poliakrylamidowy. Wybór żelu, agarozowego lub poliakrylamidowego, do analizy produktów PCR uzależniony jest m.in. od wielkości analizowanych sekwencji. Przy niewielkiej różnicy w wielkościach analizowanych produktów zalecane jest stosowanie żeli poliakrylamidowych. Żele te charakteryzuje większa rozdzielczość i możliwe jest wykrywanie fragmentów DNA, które różnią się wielkością o zaledwie kilka par zasad. W przypadku żeli agarozowych rozdzielczość ulega znacznej poprawie, gdy stosuje się ich wysokoprocentowe warianty. Wielkość analizowanych fragmentów, mierzona w parach 196 zasad (pz) określana jest na podstawie ich położenia w żelu względem fragmentu o znanej wielkości, tzw. wzorca masy. Uzyskany profil prążków można oglądać w świetle białym lub UV, w zależności od barwnika związanego z produktem reakcji PCR. Bardziej zaawansowaną i kosztowną metodą analizy produktów reakcji PCR, np. dla sekwencji mikrosatelitarnych czy DNA mitochondrialnego (mtDNA), jest analiza fragmentów DNA w automatycznym sekwenatorze. Sekwencjonowanie pozwala poznać kolejność i skład zasad w analizowanych fragmentach, a ponadto określić wielkość fragmentów DNA z dokładnością do pojedynczej zasady. Obecnie sekwencjonowanie jest najdokładniejszą metodą analizy sekwencji i wielkości amplifikowanych fragmentów DNA. Zastosowanie markerów i technik molekularnych w analizie zmienności genetycznej ptaków Techniki molekularne pozwalają na detekcję różnic w sekwencji DNA organizmów i ich charakterystykę na poziomie nukleotydów, genów lub całych genomów. Analiza sekwencji specyficznych dla poszczególnych osobników oraz charakterystyka sekwencji w obrębie populacji lub gatunku pozwala uzyskać obraz zmienności genetycznej na każdym z tych poziomów. Należy jednak zaznaczyć, że dziedziczna zmienność genetyczna jest cechą dynamiczną i zmienia się w czasie i przestrzeni, podlegając modyfikującemu wpływowi czynników środowiskowych. Dynamika zmienności genetycznej związana jest m.in. z wielkością populacji, sukcesem reprodukcyjnym i kształtowana jest przez zmiany losowe (dryf genetyczny), dobór naturalny i migrację. Polimorfizm genetyczny, rozumiany jako obecność więcej niż jednego allelu w danym locus w populacji, może być identyfikowany dzięki markerom genetycznym (Dodgson et al. 1997, Kurył & Żukowski 1997, Sunnocks 2000), za pomocą metod molekularnych bazujących najczęściej na reakcji PCR. Klasyczny marker genetyczny charakteryzuje się zidentyfikowanym stopniem zmienności danej cechy (tj. sekwencji nukleotydowej DNA), dziedziczeniem mendlowskim i łatwą identyfikacją metodami analitycznymi. Analiza polimorfizmu markerów dotyczyć może zmienności w obrębie sekwencji kodujących lub niekodujących oraz polimorfizmu długości fragmentów DNA lub pojedynczych zmian nukleotydowych we fragmentach DNA. Źródłem zmienności w sekwencji DNA są mutacje m.in. insercja, delecja, substytucja i duplikacja, oraz zjawisko rekombinacji w trakcie mejozy. Część tych zmian na poziomie genomu prowadzić może do zmienności obserwowanej na poziomie fenotypowym, istotnym z ewolucyjnego punktu widzenia (Krzanowska et al. 2002). W odniesieniu do doboru naturalnego markery mogą mieć charakter neutralny bądź nie. Zakłada się, że markery neutralne nie podlegają doborowi, tzn. konkretne genotypy czy allel/e w danym locus lub loci nie są faworyzowane przez dobór. Jednym z najpowszechniej wykorzystywanych markerów neutralnych są sekwencje mikrosatelitarne, znajdujące zastosowanie w analizie struktury populacji. Locus mikrosatelitarne to sekwencja DNA zawierająca krótkie, od 1 do 6 nukleotydów, powtarzalne elementy w liczbie kopii różnej dla poszczególnych alleli (Bennet 2000, Primmer et al. 2005). Przykładem może być motyw (AC)n, gdzie n – liczba powtórzeń, A – adenina, C – cytozyna. Powtórzenia motywów wynoszą zwykle od 5–8 do 40–50 razy, np. allel (AC)5, tj. –ACACACACAC–. Mikrosatelity występują powszechnie w genomie organizmów prokariotycznych i eukariotycznych. W badaniach najczęściej wykorzystywane są powtórzenia dwu-, trzy- oraz czteronukleotydowe (Li et al. 2002). Fragmenty DNA okalające locus (miejsce) mikrosatelitarne, tzw. region flankujący, mają charakter konserwatywny (tj. identyczny) dla osobników tego samego gatunku. Pozwala to na prostą identyfikację locus mikrosatelitarnego poprzez identyfikację regionów flankujących. 197 Powszechne wykorzystywanie markerów mikrosatelitarnych wynika m.in. z faktu, że mają one pojedynczy locus, są kodominujące i generalnie charakteryzuje je wysoki stopień mutacji, co znajduje odzwierciedlenie w stosunkowo wysokiej zmienności alleli (DeWoody 2005, Selkoe & Toonen 2006). W zależności od postawionego przez badacza pytania wykorzystywane mogą być loci o wysokiej lub niskiej zmienności alleli. Przykładowo, w badaniach mających na celu określenie potencjalnych, historycznych barier dla przepływu genów lub analizę rekolonizacji terytorium przez gatunek od czasów ostatniego zlodowacenia, wskazane jest przeanalizowanie markera o niższym tempie mutacji. Natomiast prześledzenie najnowszej demografii populacji, czy wykrycie zmian genetycznych dotyczących np. okresu obejmującego od 10 do 100 generacji, wymagać będzie wykorzystania loci mikrosatelitarnych o wysokim tempie mutacji i znacznej zmienności allelicznej. Loci mikrosatelitarne o najwyższej zmienności wykorzystywane są do analizy pokrewieństwa osobników w populacji. Innym przykładem markerów, dla których przyjmuje się, że mają charakter neutralny są markery identyfikowane za pomocą technik RAPD (Williams et al. 1990, 1993) i AFLP (Vos et al. 1995). Techniki te identyfikują wiele miejsc w genomie, a stopień wykrywanego polimorfizmu jest zwykle znaczny. Mogą być wykorzystywane do określania zmienności genetycznej w obrębie i między populacjami. Obie techniki bazują na reakcji PCR i nie wymagają wcześniejszej wiedzy na temat sekwencji, przez co znajdują zastosowanie w badaniach gatunków o słabo poznanych genomach. RAPD i AFLP nie są jednak powszechnie wykorzystywane w badaniach ptaków. Najszersze zastosowanie znalazły one w badaniach genomów i konstrukcji map genetycznych szeregu gatunków roślin (Bensch & Åkesson 2005). Poza markerami neutralnymi w badaniach zmienności genetycznej powszechnie wykorzystywane są funkcjonalne geny, czyli geny odpowiadające za powstawanie konkretnych białek. W odróżnieniu od markerów neutralnych funkcjonalne geny mogą podlegać doborowi, tzn. w przypadku, gdy w genie powstaną mutacje powodujące obniżenie dostosowania będą one eliminowane z populacji. Z powodu tych różnic markery neutralne oraz funkcjonalne geny wykorzystywane są w badaniach mających na celu uzyskanie odpowiedzi na odmienne pytania. Przykładem genów DNA genomowego o dużym znaczeniu ewolucyjnym mogą być geny kompleksu zgodności tkankowej (MHC, ang. Major Histocompatibility Complex) (np. Edwards & Hedrick 1998, Jordan & Burford 1998). Geny te charakteryzuje bardzo wysoki stopień polimorfizmu, kodują one białka kluczowe dla działania systemu immunologicznego, biorące udział w rozpoznawaniu własnych i obcych białek. Polimorfizm genów MHC u ptaków analizowany jest w kontekście wyboru partnera i stopnia heterozygotyczności potomstwa (von Schantz et al. 1997, Ekblom et al. 2004). Zgodnie z teorią, dobór faworyzuje osobniki heterozygotyczne pod względem genów MHC, ponieważ większa liczba wariantów tych genów pozwala na odpowiedź immunologiczną na szerszą gamę patogenów, w rezultacie może to prowadzić do zwiększenia dostosowania i przeżywalności potomstwa (Penn et al. 2002). Najprostszą metodą wykrywania polimorfizmu w obrębie tych genów jest technika SSCP. Pozwala ona na różnicowe wykrywanie wariantów polimorficznych i wytypowanie fragmentów do dalszych analiz (np. Goto et al. 2002). Geny oraz regiony genomu różnią się stopniem polimorfizmu, tempem mutacji, rodzajem doboru, sposobem dziedziczenia i frekwencją w populacji. Z tego względu wybór markera genetycznego do badań powinien być uzależniony od postawionego przez badacza pytania. Należy uwzględnić właściwości markera, a także dostępność materiału do badań, potrzebnych starterów, funduszy i możliwości sprzętowe do przeprowadzenia analiz. Przy projektowaniu badań należy również wziąć pod uwagę sposób próbkowania. Przykładowo, próbkowanie wielu miejsc w genomie poprzez porównywanie danych dla wielu loci dostar198 cza bardziej precyzyjnych danych o większej wiarygodności statystycznej przy porównaniach w obrębie i między populacjami (Pearse & Crandall 2004). Analiza zmienności genetycznej w badaniach ptaków – przykłady wykorzystania technik molekularnych na poziomie populacji i gatunków Zmienność genetyczna na poziomie populacji. Populację zasiedlającą dane środowisko charakteryzuje określona struktura genetyczna, która związana jest ściśle ze specyfiką genetyczną poszczególnych osobników. Struktura genetyczna populacji danego gatunku określana jest pojęciem puli genowej (Krzanowska et al. 2002). Pula ta charakteryzowana jest liczbą i frekwencją alleli i genotypów, modyfikowaną dzięki swobodnej rekombinacji i przepływowi genów między populacjami. Zjawiska te prowadzić mogą do znacznych różnic w składzie genetycznym izolowanych populacji danego gatunku. Markery genetyczne wykorzystywane do analizy zmienności genetycznej w obrębie i między populacjami oraz do oceny stopnia heterozygotyczności charakteryzować powinien średni lub wysoki stopień polimorfizmu. Na obraz ogólnej zmienności genetycznej populacji wpływa zmienność poszczególnych osobników. Zmienność osobnicza w populacji kształtowana jest m.in. przez zachowania rozrodcze. Zastosowanie markerów molekularnych, głównie o charakterze neutralnym, pozwoliło na zweryfikowanie dotychczasowej wiedzy o systemach kojarzenia u ptaków. W centrum zainteresowania znalazły się zagadnienia dotyczące kojarzeń pozapartnerskich, pokrewieństwa ptaków tworzących parę oraz wyboru partnera do rozrodu. Markery o wysokim stopniu polimorfizmu, najczęściej loci mikrosatelitarne, pozwalają uzyskać unikatowy profil genetyczny osobnika, odziedziczony po rodzicach, przy zastosowaniu niekiedy kilku loci (Queller et al. 1993). Porównanie otrzymanych fragmentów (alleli) i ich statystyczna analiza pozwala na określenie stopnia pokrewieństwa osobników w populacji, w tym na wykluczenie ojcostwa (Blouin 2003). Innymi metodami wykorzystywanymi do określenia indywidualnego genotypu osobnika są techniki RAPD i AFLP (Parker et al. 1998, Petrie et al. 1998, Questiau et al. 1999, Bensch & Åkesson 2005). Na podstawie badań polimorfizmu genetycznego stwierdzono m.in., że kojarzenia pozapartnerskie są stosunkowo częstym zjawiskiem nawet wśród ptaków powszechnie uznawanych za monogamiczne (Lack 1968, Petter et al. 1990). U ptaków wróblowych aż u 86% gatunków występuje genetyczna poliandria (Griffith et al. 2002). Ponadto, ocena ojcostwa genetycznego pozwoliła poszerzyć wiedzę biologów na temat pasożytnictwa lęgowego u ptaków (Sorenson & Payne 2002). Markery molekularne znalazły również zastosowanie w ocenie stopnia pokrewieństwa między osobnikami w kontekście kojarzenia krewniaczego i zjawiska depresji wsobnej. Przykładowo u darwinek (Geospiza scandens i G. fortis) stwierdzono, że wyższy poziom kojarzeń krewniaczych wpływa na gorszą przeżywalność osobników (Keller et al. 2002). W praktyce, wyniki badań dotyczących kojarzenia w bliskim pokrewieństwie mogą mieć szczególne znaczenie dla powodzenia programów hodowlanych gatunków zagrożonych i reintrodukcji osobników do populacji naturalnych. Dla charakterystyki genetycznej i demograficznych modeli populacji bardzo ważnymi parametrami są dyspersja i przepływ genów. Szacunkowa ocena dyspersji może być trudna nawet dla populacji o szczegółowych danych demograficznych, uzyskanych np. dzięki obrączkowaniu ptaków. Zastosowanie markerów molekularnych może znacząco polepszyć wiedzę o przepływie genów między osobnikami i populacjami. Jako przykład posłużyć mogą badania nad europejską populacją edredona Somateria mollissima, analizujące histo199 rię rekolonizacji gatunku po ostatnim zlodowaceniu i obecnej dyspersji osobników między koloniami (Tiedemann et al. 2004). Na podstawie przeprowadzonych analiz DNA mitochondrialnego (mtDNA), które dziedziczone jest w linii matczynej, stwierdzono znaczne różnice między poszczególnymi koloniami, które wynikały z bardzo wysokiej filopatrii samic. Analiza loci mikrosatelitarnych pozwoliła natomiast stwierdzić, że dyspersja ptaków na dużych dystansach jest obecnie bardzo ograniczona. Uznano, że małe różnice w DNA genomowym między populacjami prawdopodobnie indukowane są głównie przez samce przemieszczające się między koloniami. W badaniach struktury genetycznej populacji gatunków słabo poznanych wykorzystana może być technika RAPD. Przykładowo Paterson & Snyder (1999) przeanalizowali markery RAPD dla nawałnika dużego Oceanodroma leucorhoa w trzech oddalonych od siebie koloniach lęgowych na Północnym Atlantyku. Dyspersja i migracja tego gatunku są słabo poznane, ze względu na jego nocną aktywność, niewielkie rozmiary i brak dymorfizmu płciowego. Badania wykazały, że nawałniki duże zasiedlające poszczególne kolonie są genetycznie zbliżone. Obserwowana zmienność genetyczna w większości wynikała z różnic osobniczych, a jedynie 5% wykrytej zmienności sugerowało różnice genetyczne na poziomie populacyjnym. Zastosowanie markerów molekularnych w badaniach populacyjnych daje możliwość oszacowania sukcesu reprodukcyjnego osobników, w tym również liczbę potencjalnie lęgowych samców, na podstawie analizy genotypów osobników dorosłych i piskląt. Przykładowo, w populacji orłosępa Gypaetus barbatus, gatunku zagrożonego wyginięciem, ocena zmienności genetycznej potomstwa pozwoliła na oszacowanie zmienności genetycznej populacji oraz liczby ptaków przystępujących do rozrodu i efektywnej wielkości populacji (Gautschi et al. 2003). Ponadto, porównano zmienność loci mikrosatelitarnych u piskląt pochodzących z niewoli i z populacji dzikiej. Stwierdzono, że zmienność mierzona jako średnia liczba alleli na locus i średnia oczekiwana i obserwowana heterozygotyczność, była wyższa w populacji utrzymywanej w niewoli. Dane tego typu są bardzo istotne w planowaniu kojarzeń ptaków w niewoli, m.in. unikania kojarzeń w bliskim pokrewieństwie, i dają szansę na reintrodukcję osobników o odpowiednim składzie genetycznym. Zmienność genetyczna na poziomie gatunków. Analiza materiału genetycznego pozwala wykrywać nieciągłości między gatunkami, oceniać ich rozmiar i znaczenie dla integralności taksonów. W ornitologii techniki molekularne wspomagają definiowanie statusu taksonów o niepewnej filogenezie lub pozycji systematycznej (Helbig et al. 2002). Markery wykrywające zmienność na poziomie ponadpopulacyjnym znalazły więc zastosowanie w badaniach filogenezy gatunków, ich filogeografii oraz zjawiska hybrydyzacji. Stopień polimorfizmu wykorzystywanych markerów uzależniony jest od analizowanego zagadnienia, zwykle jednak na tym poziomie markery charakteryzuje umiarkowany polimorfizm. W badaniach zmienności genetycznej na poziomie gatunkowym często wykorzystywane jest DNA mitochondrialne. MtDNA zawiera geny rRNA, tRNA, geny kodujące białka oraz niekodujący region kontrolny (Brown 1985). U zwierząt mtDNA w stosunku do DNA genomowego generalnie ewoluuje szybciej, a dla poszczególnych składowych mtDNA można oszacować tempo mutacji. Specyfiką markerów mitochondrialnych jest też fakt, że dziedziczą się w linii matczynej, tzn. potomstwo otrzymuje niezrekombinowane mtDNA od matki. Ten sposób dziedziczenia sprawia, że mtDNA niesie informację o charakterze haploidalnym (1n) i wykrywane są haplotypy, a nie diploidalne genotypy (2n), jak w przypadku DNA genomowego. Powyższe cechy predysponują mtDNA do badań taksonomicznych (np. Zink 2004), filogeograficznych (np. Lucchini & Randi 1998), ale też struktury populacji, szczególnie w przypadku różnic w dyspersji między płciami (np. Tiedemann et al. 2004). 200 Interesującym przykładem wykorzystania fragmentu genu mitochondrialnego do genetycznej identyfikacji gatunków jest tzw. barkodowanie (ang. DNA barcoding) (Herbert et al. 2003, Dasmahapatra & Mallet 2006); wykorzystywana jest tu jedynie krótka sekwencja, ok. 650 pz, z jednego z genów mtDNA, zwanego oksydazą cytochromową (zwany też COXI lub COI). Dla poszczególnych osobników porównywana jest kolejność zasad w analizowanym fragmencie, a następnie dla tych danych konstruowane jest drzewo filogenetyczne, na którym osobniki potencjalnie najbliżej spokrewnione są grupowane razem. Metoda ta stwarza możliwości wykrywania gatunków morfologicznie nierozróżnialnych, tzw. kryptycznych. Ponadto uważa się, że metoda ta pozwala wykrywać istniejącą prawdopodobnie ścisłą korelację danych ekologicznych i różnic wynikających z sekwencji analizowanego genu. Na podstawie pojedynczej, krótkiej sekwencji fragmentu genu COI określono m.in. przynależność do gatunku 260 taksonów ptaków z Ameryki Północnej, przy czym poprawność tej klasyfikacji wahała się od 98 do 100% (Herbert et al. 2004). Hybrydyzacja jest dość powszechnym zjawiskiem (Arnold 1997) i uważa się, że dotyczy ok. 10% gatunków ptaków (Grant & Grant 1992). Polega ona na przełamaniu bariery rozrodczej i kojarzeniu osobników różnych gatunków, co umożliwia przepływ genów z jednej puli genowej do drugiej na drodze introgresji. Dopływ genów obcych i zjawisko hybrydyzacji może wpływać niekorzystnie na lokalne adaptacje populacji, a ponadto prowadzić do spadku dostosowania i wielkości populacji. Techniki molekularne stwarzają możliwość badania przebiegu hybrydyzacji oraz detekcję potencjalnych mieszańców i identyfikację introgresji obcych genów. Przykładem mogą być badania dotyczące hybrydyzacji dwóch gatunków kaczek, krzyżówki Anas platyrhynchos i brązówki A. rubripes, współwystępujących w Ameryce Północnej. Mank i inni (2004) porównali dane z analiz sekwencji mikrosatelitarnych dla prób historycznych, pochodzących z muzeum, oraz prób zebranych w czasach obecnych i wykazali, że w przeciągu ostatnich 50 lat doszło do introgresji genów krzyżówki do genomu brązówki, co spowodowało redukcję różnic genetycznych między gatunkami z 0,146 do 0,008. Zjawisko przełamania barier izolacji rozrodczej może prowadzić do powstawania mieszańców. Identyfikacja osobników mieszańcowych ma szczególne znaczenie w przypadku gatunków o znaczeniu gospodarczym, takich jak np. przepiórka Coturnix coturnix coturnix i przepiórka japońska C. c. japonica. W warunkach naturalnych podgatunki te są allopatryczne, przepiórka występuje w Europie i zachodniej Azji, natomiast przepiórka japońska gniazduje na obszarze wschodniej Azji. Masowe wypuszczanie przepiórek japońskich hodowanych jako gatunek łowny lub jej hybrydów, szczególnie w zachodniej Europie, może potencjalnie zagrażać puli genetycznej populacji dzikiej (Barilani et al. 2005). Zastosowanie markerów mtDNA oraz loci mikrosatelitarnych pozwoliło na wyróżnienie podgatunków oraz detekcję hybrydów wśród ptaków hodowlanych i w populacjach naturalnych. Na stosunkowo prostą identyfikację hybrydów i mieszańców wstecznych pozwala też technika AFLP, jak wykazały wyniki badań prowadzonych na piecuszku Phylloscopus trochilus (Bensch et al. 2002). Identyfikację mieszańców oparto na różnicach we frekwencji markerów AFLP. Najbardziej przydatnymi markerami do identyfikacji hybrydów były te, które wykazały znaczne różnice we frekwencji między populacjami. Do detekcji hybrydów może być też wykorzystana technika RAPD. Barbanera et al. (2007) ocenili zmienność genetyczną góropatwy azjatyckiej Alectoris chukar na podstawie regionu kontrolnego mtDNA oraz identyfikowali mieszańce góropatwy azjatyckiej i czerwonej A. rufa, w potencjalnej strefie hybrydyzacji we Włoszech, Grecji i na Cyprze. Na podstawie indywidualnego profilu genetycznego RAPD badacze stwierdzili, że introgresja genów góropatwy czerwonej do genomu góropatwy azjatyckiej zachodzi jedynie w populacji włoskiej. Identyfikacja gatunków góropatwy azjatyckiej 201 i czerwonej i ich mieszańców możliwa jest też z użyciem markerów SSCP wykrytych w obrębie DNA mitochondrialnego (cytochrom b i pętla D) oraz jądrowego (ITS, ang. Ribosomal DNA-intervening transcribed spacer) (Tejedor et al. 2006). Za twórcze uwagi i krytyczne komentarze do manuskryptu dziękujemy Sylwii Czarnomskiej, Jolancie Klukowskiej, Adrianowi Surmackiemu oraz Grzegorzowi Neubauerowi. Summary: Molecular techniques and markers in studies of genetic variation in birds.The paper reviews basic issues of molecular methods based on the PCR (Polymerase Chain Reaction) techniques in the studies of avian genetic variation using molecular markers. Biological material used to DNA extraction can be obtained as invasive (blood or other tissues, growing feather quills) or non-invasive samples (faeces, dropped feathers, tissues from museum specimens). Short-term storage of samples (especially ones preserved in alcohol) does not usually require special treatment, but samples which are going to be analyzed later are best kept frozen (in –20°C or –40°C DNA is stable). Before a PCR is performed, DNA must be extracted from cells using commercial kits or other, cheaper but time-consuming, procedures. Typically, the PCR technique involves three stages: denaturation of double stranded DNA (94°–95°C), annealing (primers binding to the single DNA strand, 54°–60°C) and synthesis of the complementary DNA strand (72°C). Thus, during a PCR, the selected fragments of DNA are amplified from the total DNA in a huge number; repeatability or reliability of the reaction usually requires experimentally fixed conditions by manipulation of the DNA amount, amount and concentration of reagents, annealing temperature, number of repeated cycles. A number of modifications to the PCR techniques have been developed. The RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) technique, with arbitrary primers, allows generation of a big number of RAPD markers which could be useful in estimation of genetic polymorphism. Similarly, the AFLP (Amplified Length Fragment Polymorphism), technique combines use of RAPD markers and restriction enzymes, which enables to obtain a very high number of anonymous fragments dominant in character. To detect polymorphism, the SSCP (Single-Stranded Conformation Polymorphism) method could also be very useful. However, this method employs the PCR technique but polymorphism is detected during electrophoresis, as fragments differences result from different conformation of single stranded DNA fragments. Visualization of PCR products is traditionally performed using gel electrophoresis, which allows separation of the PCR products that differ in size (because of differences in size they move with different speed in the gel). DNA sequencing is the most advanced (and expansive) method of PCR product analysis: the sequence composition and its exact length are obtained. Due to their application in the detection of polymorphisms at different levels (nucleotide, gene and genome), molecular techniques and markers are useful tools in avian evolutionary and ecological studies. Markers, neutral or particular genes, differ in polymorphism level, frequencies in populations, mutation ratio, type of selection and way of inheritance. Thus, the choice of molecular markers to be used in the studies depends on the question being addressed. Further studies should take into consideration the specific character of markers, the samples and primers availability and also the financial and technical capacities. Molecular markers are widely applied to the analyses of genetic polymorphism in species and between and among populations. At the population level, analyses of mating systems and paternity as well as demography and migration behaviour which make use of molecular markers have received most attention, whereas phylogeography and hybridization, including hybrid detection, have extensively been investigated at the species level. Examples of these studies are presented and discussed. Literatura Abd-Elsalam K.A. 2003. Bioinformatic tools and guideline for PCR primer design. African J. Biotechnol. 2: 91–95. Arnold M.L. 1997. Natural hybridization and evolution. Oxford University Press, New York. Avise J.C. 1994. Molecular markers, natural history & evolution. Chapman & Hall, New York, London. 202 Barbanera F., Guerrini M., Hadjigerou P., Panayides P., Sokos C., Wilkinson P., Khan A.A., Cappelli F., Dini F. 2007. Genetic insight into Mediterranean chukar (Alectoris chukar, Galliformes) populations inferred from mitochondrial DNA and RAPD markers. Genetica DOI 10.1007/ s10709-006-9138-x Barilani M., Deregnaucourt S., Gallego S., Galli L., Mucci N., Piombo R., Puigcerver M., Rimondi S., Rodrigez-Teijeiro J.D., Spanò S., Randi E. 2005. Detecting hybridization in wild (Coturnix c. coturnix) and domesticated (Coturnix c. japonica) quail populations. Biol. Conserv. 126: 445–455. Benecke M. 1998. Random amplified polymorphic DNA (RAPD) typing of necrophageous insects (Diptera, Coleoptera) in criminal forensic studies: validation and use in practice. Forensic. Sci. Int. 98: 157–168. Bennett P. 2000. Microsatellites. J. Clin. Pathol. Mol. Pathol. 53: 177–183. Bensch S., Åkesson M. 2005. Ten years of AFLP in ecology and evolution: why so few animals? Mol. Ecol. 14: 2899–2914. Bensch S., Helbig A.J., Salomon M., Seibold I. 2002. Amplified fragment lenght polymorphism analysis identifies hybrids between two subspecies of warblers. Mol. Ecol. 11: 473–481. Berg P., Singer M. 1997. Język genów. Poznawanie zasad dziedziczenia. Prószyński i S-ka, Warszawa. Blears M.J., De Grandis S.A., Lee H., Trevors T.J. 1998. Amplified fragment length polymorphism (AFLP): a review of the procedure and its applications. J. Ind. Microbio. Biotechnol. 21: 99–114. Blouin M.S. 2003. DNA-based methods for pedigree reconstruction and kinship analysis in natural populations. Trends Ecol. Evol. 18: 503–511. Bowditch B.M., Albright D., Williams J., Braun M.J. 1993. The use of randomly amplified polymorphic DNA markers in comparative genome studies. W: Zimmer E.A., White T.J., Cann R.L., Wilson A.C. (eds). Methods in Molecular Evolution: Producing the Biochemical Data. Vol. of Methods in Enzymology, series 224: 294–309. Academic Press, San Diego. Brown W.M. 1985. The mitochondrial genome of animals. W: MacIntyre R.J. (ed.). Evolution of genes and proteins. Plenum Press, New York. Dasmahapatra K.K., Mallet J. 2006. DNA barcodes: recent succeses and future prospects. Heredity 97: 254–255. DeSalle R., Schierwater B. (eds). 1998. Molecular Approaches to Ecology and Evolution. Birkhauser Verlag, Basel. DeWoody J.A. 2005. Molecular approaches to the study of parentage, relatedness, and fitness: practical applications for wild animals. J. Wildl. Manag. 69: 1400–1418. Dodgson J.B., Cheng H.H., Okimoto R. 1997. DNA marker technology: a revolution in animal genetics. Poult. Sci. 76: 1108–1114. Edwards S.V., Hedrick P.W. 1998. Evolution and ecology of MHC molecules: from genomics to sexual selection. Trends Ecol. Evol. 13: 305–311. Ekblom R., Sæther A., Grahn M., Fiske P., Kålås A., Höglund J. 2004. Major histocompatibility complex variation and mate choice in a lekking bird, the great snipe (Gallinago media). Mol. Ecol. 13: 3821–3828. Ellegren H. 1991. DNA typing of museum birds. Nature 354: 113. Gautschi B., Müller J.P., Schmid B., Shykoff J.A. 2003. Effective number of breeders and maintenance of genetic diversity in the captive bearded vulture population. Heredity 91: 9–16. Goto R.M., Afanassieff M., Ha J., Iglesias G.M., Ewald S.J., Briles W.E., Miller M.M. 2002. Single-Strand Conformation Polymorphism (SSCP) assays for Major Histocompatibility Complex B genotyping in chicken. Poult. Sci. 81: 1832–1841. Grant P.R., Grant B.R. 1992. Hybridization of birds species. Science 256: 193–197. Griffith S.C., Owens I.P.F., Thuman K.A. 2002. Extra pair paternity in birds: a review of interspecific variation nad adaptive function. Mol. Ecol. 11: 2195–2212. Gu W.K., Acland G.M., Aguirre G.D., Ray K. 1997. Evaluation of RAPD analysis for identification of polymorphisms in canine genomic DNA. Animal Biotechnology 8: 207–219. Hagelberg E., Gray I.C., Jeffreys A.J. 1992. Identification of the skeletal remains of a murder victim by DNA analysis. Nature 352: 427–429. Handel C.M., Pajot L.M., Talbot S.L., Sage G.K. 2006. Use of buccal swabs of sampling DNA from nestling and adult birds. Wildlife Soc. Bull. 34: 1094–1100. 203 Helbig, A.J., Knox A.G., Parkin D.T., Sangster G., Collinson M. 2002. Guidelines for assigning species rank. Ibis 144: 518–525. Herbert P.D.N., Cywinska A., Ball S.L., DeWaard J.R. 2003. Biological identifications through DNA barcodes. Proc. R. Soc. Lond. B Biol. Sci. 270: 313–321. Herbert P.D.N., Stoeckle M.Y., Zemlak T.S., Francis C.M. 2004. Identyfication of birds through DNA barcodes. PLOS Biology 2: 1657–1663. Horváth M.B., Martínez-Cruz B., Negro J.J., Kalmár L., Godoy J.A. 2005. An overlooked DNA source for non-invasive genetic analysis in birds. J. Avian Biol. 36: 84–88. Hoysak D.J., Weatherhead P.J. 1991. Sampling blood from birds: a technique and assessment of its effect. Condor 93: 746–752. Jordan W.C., Burford M.W. 1998. New perspectives on mate choice and the MHC. Heredity 81: 127–133. Karl S.A., Bowen B.W., Avise J.C. 1992. Global population genetic structure and male-mediated gene flow in the green turtle (Chelonia mydas): RFLP analyses of anonymous nuclear loci. Genetics 131: 163–173. Keller L.F., Grant P.R., Grant R.B, Petren K. 2002. Environmental conditions affect the magnitude of inbreeding depression in survival of Darwin’s finches. Evolution 56: 1229–1239. Kidd K.K, Rauno G. 1995. Optimizing PCR. W: McPherson M.J., Hames B.D., Taylor G.R. (eds). PCR 2: A Practical Aproach. Oxford University Press. King R.C., Stansfield W. 2002. Słownik terminów genetycznych. Ośrodek Wydawnictw Naukowych PAN, Poznań. Krzanowska H., Łomnicki A., Rafiński J., Szarski H., Szymura J. M. 2002. Zarys mechanizmów ewolucji. PWN, Warszawa. Kurył J., Żukowski M. 1997. Markery genetyczne u zwierząt gospodarskich. W: Zwierzchowski L., Jaszczak K., Modliński J. (red.). Biotechnologia zwierząt. Wyd. Nauk. PWN, Warszawa. Lack D. 1968. Ecological adaptations for breeding in birds. London, Methuen. Leeton P., Christidis L., Westerman M. 1993. Feathers from museum birds skins – a good source of DNA for phylogenetic studies. Condor 95: 465–466. Li Y.C., Korol A.B., Fahima T., Beiles A., Nevo E. 2002. Microsatellites: genomic distribution, putative functions, and mutational mechanisms: a review. Mol. Ecol. 11: 2453–2465. Liu Q., Feng J., Buzin C. 1999. Detection of virtually all mutations-SSCP (DOVAM-S): a rapid method for mutation scanning with virtually 100% sensitivity. Biotechniques 26: 932–942. Lubjuhn T., Brün J., Winkel W. 1998. Effects of blod sampling in Great Tits. J. Field Ornithol. 69: 595–602. Lucchini V., Randi E. 1998. Mitochondrial DNA sequence variation and phylogeographical structure of rock partridge (Alectoris graeca) populations. Heredity 81: 528–536. Mank J.E., Carlson J.E., Brittingham M.C. 2004. A century of hybridization: decrising genetic distance between American black duck and mallards. Conserv. Genet. 5: 395–403. McPherson M.J., Hames B.D., Taylor G.R. (eds). 1995. PCR 2: A Practical Approach. Oxford University Press. Morin P.A., Messier J., Woodruff D.S. 1994. DNA extraction, amplification, and direct sequencing from hornbill feathers. J. Sci. Soc. Thailand 20: 31–41. Mueller U.G., Wolfenbarger L.L. 1999. AFLP genotyping and fingerprinting. Trends Ecol. Evol. 14: 389–395. Orita M., Suzuki Y., Sekiya T., Hayashi K. 1989. Rapid and sensitive detection of point mutations and DNA polymorphisms using the polymerase chain reaction. Genomics 5: 874–879. Orti G., Hare M.P., Avise J.C. 1997. Detection and isolation of nuclear haplotypes by PCR-SSCP. Mol. Ecol. 6: 575–580. Parker P.G., Snow A.A., Schug M.D., Booton G.C., Fuerst P.A. 1998. What molecules can tell us about populations: choosing and using a molecular marker. Ecology 79: 361–382. Paterson I.G., Snydre M. 1999. Molecular genetic (RAPD) analysis of Leach’s Storm-Petrels. Auk 116: 338–344. Pearce J.M., Fields R.L., Scribner K.T. 1997. Nest materials as a source of genetic data for avian ecological studies. J. Field Ornithol. 68: 471–481. 204 Pearse D.E., Crandall K.A. 2004. Beyond FST: analysis of population genetic data for conservation. Conservation Genetics 5: 585–602. Penn D.J., Damjanovich K., Potts W.K. 2002. MHC heterozygosity confers a selective advantage against multiple-strain infections. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99: 11260–11264. Petrie M., Doums C., Møller A.P. 1998. The degree of extra-pair paternity increases with genetic variability. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 9390–9395. Petter S.C., Miles D.B., White M.M. 1990. Genetic evidence of mixed reproductive strategy in a monogamous bird. Condor 92: 702–708. Pilot M., Rutkowski R. (red.). 2005. Zastosowanie metod molekularnych w badaniach ekologicznych. Muzeum i Instytut Zoologii PAN, Warszawa. Primmer C.R., Painter J.N., Koskinen M.T., Palo J.U., Merilä J. 2005. Factors affecting avian cross-species microsatellite amplification. J. Avian Biol. 36: 348–360. Queller D.C., Strassmann J.E., Hughes C.R. 1993. Microsatellites and kinship. Trends Ecol. Evol. 8: 285–288. Questiau S., Eybert M.C., Taberlet P. 1999. Amplified fragment length polymorphism (AFLP) markers reveal extra-pair parentage in bird species: the bluethroat (Luscinia svesica). Mol. Ecol. 8: 1331–1339. Regnaut S., Lucas F.S., Fumagalli L. 2006. DNA degradation in avian faecal samples and feasibility of non-invasive genetic studies of threatened capercaille populations. Conservation Genetics 7: 449–453. Rothuizen J., van Wolferen M. 1994. Randomly amplified DNA polymorphisms in dogs are reproducible and display Mendelian transmission. Anim. Genet. 25: 13–18. Sambrook J., Fritsche E.F., Maniatis T. 1989. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd ed. Cold Spring Harbor, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Selkoe K.A., Toonen R.J. 2006. Microsatellites for ecologists: a practical guide to using and evaluating microsatellite markers. Ecol. Lett. 9: 615–629. Seutin G., White B.N., Boag P.T. 1991. Preservation of avian blood and tissue samples for DNA analyses. Can. J. Zool. 69: 82–90. Sorenson M.D., Payne R.B. 2002. Molecular genetic perspectives on avian brood parasitism. Integ. Comp. Biol. 42: 388–400. Strausberger B.M., Ashley M.V. 2001. Eggs yield nuclear DNA from egg-laying female cowbirds, their embryos and offspring. Conservation Genetics 2: 385–390. Sturkie P.D. 1986. Body fluids: blood. W: Sturkie P.D. (ed.). Avian physiology. Springer-Verlag, New York. Sunnocks P. 2000. Efficient genetic markers for population biology. Trends Ecol. Evol. 15: 199–203. Sunnucks P., Wilson A.C.C., Beheregaray L.B., Zenger K., French J., Taylor A.C. 2000. SSCP is not so difficult: the application and utility of single-stranded conformation polymorphism in evolutionary biology and molecular ecology. Mol. Ecol. 9: 1699–1710. Taberlet P., Waits L.P., Luicart G. 1999. Noninvasive genetic sampling: Look before you leap. Trends Ecol. Evol. 14: 323–327. Tejedor M.T., Monteagudo L.V., Arruga M.V. 2006. DNA Single Strand Conformation Polymorphisms (SSCP’s) studies on Spanish Red-legged Partridges. Wildl. Biol. Pract. 2: 8–12. Tiedemann R., Paulus K.B., Scheer M., von Kistowski K.G., Skírnisson K., Bloch D., Dam M. 2004. Mitochondrial DNA and mikrosatellite variation in the eider duck (Somateria mollissima) indicate stepwise postglacial colonization of Europe and limited current long-distance dispersal. Mol. Ecol. 13: 1481–1494. Tuner P.C., McLennan A.G., Bates A.D., White M.R.H. 2000. Biologia molekularna. Krótkie wykłady. PWN, Warszawa. von Schantz T., Wittzell H., Göransson G., Grahn M. 1997. Mate choice, male condition-dependent ornamentation and MHC in the pheasant. Hereditas 127: 133–140. Vos P., Hogers R., Bleaker M., Reijans M., Van De Lee T., Hornes M., Fritjers A., Pot J., Peleman J., Kuiper M., Zabeau M. 1995. AFLP: a new technique for DNA fingerprinting. Nucl. Acids Res. 23: 4407–4414. 205 Walsh P.S., Metzger D.A., Higuchi R. 1991. Chelex 100 as a medium for simple extraction of DNA for PCR-based typing from forensic material. Biotechniques 10: 506–513. Welsh J., McClelland M. 1990. Fingerprinting genomes using PCR with arbitrary primers. Nucl. Acids Res. 18: 7213–7218. Williams J.G.K., Hanafey M.K., Rafalski J.A., Tingey S.V. 1993. Genetic analysis using random amplified polymorphic DNA markers. Method Enzymol. 218: 704–740. Williams J.G.K., Kubelik A.R., Livak K.J., Rafalski J.A., Tingey S.V. 1990. DNA polimorphisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers. Nucl. Acids Res. 18: 6531–6535. Zink R.M. 2004. The role of subspecies in obscuring avian biological diversity and misleading conservation policy. Proc. R. Soc. Lond. B 271: 561–564. Magdalena Zagalska-Neubauer, Anna Dubiec Stacja Ornitologiczna, Muzeum i Instytut Zoologii PAN Nadwiślańska 108, 80-680 Gdańsk [email protected], [email protected] 206