Transcript
Techniki sekwencjonowania DNA 1. Metoda chemicznej degradacji DNA (metoda Maxama i Gilberta – 1977) 2. Klasyczna metoda terminacji syntezy łańcucha DNA metoda Sangera lub dideoksy (Sanger i wsp. 1977) Obydwie metody sprowadzają się do uzyskania puli cząsteczek DNA zakończonych określonym nukleotydem A, C, G lub T, różniących się długością o 1 nt.
3. Metody sekwencjonowania „odmienne od tradycyjnych” (klasycznych) •Metody określane jako NGS – next generation sequencing: np. takie w których nie używa się ddNTP – np. pirosekwencjonowanie
Metoda terminacji łańcucha metoda Sangera lub dideoksy •
do uzyskania cząsteczek DNA zakończonych określonym nukleotydem A, C, G lub T stosuje się syntezę nowej nici DNA
•
Materiałem wyjściowym jest jednoniciowe - ssDNA (w tradycyjnej metodzie DNA trzeba sklonować do wektora, który umożliwia otrzymanie ssDNA np. fagowego M13 lub fagemidu)
•
Opiera się na zdolności polimerazy DNA do wbudowywania w syntetyzowaną nić DNA 3’dideoksynukleotydów, pozbawionych grupy hydroksylowej na końcu 3’ - ddNTP. Wbudowanie ddNTP sprawia, że łańcuch DNA nie może być dalej wydłużany, czyli ddNTP działa jak terminator syntezy DNA.
Ile nukleotydów można przeczytać w jednej reakcji? •Na standardowym 6% żelu poliakrylamidowym w którym stosunek akrylamidu do BIS wynosi 19:1 można odczytać kolejność kilkuset nukleotydów (ok. 650 nt)
Modyfikacje metody Sangera umożliwiające automatyzację procesu sekwencjonowania DNA wybór optymalnej polimerazy DNA
zamiana 33P na 35S do znakowania dNTP (ostrzejsze prążki, lepsze odczyty sekwencji – wczesne lata 80-te) wprowadzenie do znakowania dNTP barwników fluorescencyjnych zastosowanie ddNTP znakowanych różnymi barwnikami fluorescencyjnymi automatyczny sekwenator DNA LI-COR (koniec lat 80-tych)
Polimeraza do sekwencjonowania musi spełniać trzy warunki: 1.
Wysoka procesywność – zdolność syntezy odpowiednio długiego odcinka DNA i oddysocjowanie dopiero po włączeniu ddNTP
2.
Brak aktywności egzonukleazy 5’-3’ (lub nieznaczna taka aktywność) zdolność zastępowania istniejącego łańcucha DNA – zjawisko niekorzystne w sekwencjonowaniu, ponieważ usuwanie nukleotydów z końca 5’ nowosyntetyzowanego łańcucha skraca go uniemożliwiając odczytanie prawidłowej sekwencji z wzoru prążków po autoradiografii
3.
Brak aktywności egzonukleazy 3’-5’ (lub nieznaczna taka aktywność) aktywność korektorska – polimeraza pozbawiona tej aktywności nie usuwa wbudowanych ddNTP kończących łańcuch po ich włączeniu
Fragment Klonowa – pochodna pol DNA I E. coli, pozbawiona aktywność exo 5’-3’ – WADA: ma niską procesywność Sekwenaza: zmodyfikowana polimeraza faga T7 (1987)– wysoka procesywność, brak aktywności egzonukleolitycznej, dodatkowy atut to duża szybkość przeprowadzonej reakcji.
Sekwencjonowanie automatyczne (cykliczne ) •Zasada reakcji pozostaje bez zmian – opiera się na użyciu ddNTP •Otrzymaną pulę nici analizuje się albo przez elektroforezę w żelu poliakrylamidowym albo elektroforezę kapilarną Zmiana dotyczy sposobu przeprowadzenia syntezy DNA • Opiera się na reakcji PCR i wykorzystaniu termostabilnej polimerazy Taq, a właściwie jej zmodyfikowanej wersji, w której Phe z centrum aktywnego zastąpiono Tyr, co znacznie zmniejszyło dyskryminację ddNTP przez polimerazę Zalety w stosunku do metody oryginalnej metody Sangera: •Możliwość stosowania dsDNA jako matrycy, np. plazmidowe DNA – łatwość przygotowania matrycy •Do reakcji wystarcza bardzo mała ilość DNA co oznacza, że nie jest obligatoryjne konieczne sklonowania odcinka DNA przed sekwencjonowaniem, wystarczy np. produkt innej reakcji PCR
•Reakcja cyklicznego sekwencjonowania przebiega podobnie do reakcji PCR, ale wykorzystuje się w niej tylko jeden starter – syntetyzowana jest tylko jedna nić używanej cząsteczki matrycowego dsDNA-asymetryczny PCR •Każdy z ddNTP wyznakowany jest innym fluoroforem, co umożliwia prowadzenie reakcji w jednej próbówce
•1 matryca = 1 reakcja
Czy można odczytać sekwencje odcinka DNA długości kilkuset kpz w jednej reakcji enzymatycznej? 1. Sekwencjonowanie klonów biblioteki genomowej z dużymi wstawkami poprzez podklowanie fragmentów restrykcyjnych do „zwykłych” wektorów np. plazmidowych
2. Sekwencjonowanie z wykorzystaniem wędrówki starterów (primer walking)
fragment genomowego DNA 200 kpz
2. Sekwencjonowanie z wykorzystaniem wędrówki starterów (primer walking)
3. Metody określane jako NGS – next generation sequencing: Co je wyróżnia?
•nie używa się ddNTP – np. pirosekwencjonowanie •ogromna przepustowość (ang. highthroughput)
Pirosekwencjonowanie Nie używa się ddNTP, w czasie reakcji rejestruje się kolejność wbudowywania nukleotydów w trakcie syntezy nowej nici •Wbudowanie nukleotydu rejestruje się jako błysk chemiluminescencji indukowany przez pirofosforan, który uwalnia się z dNTP.
Pirosekwencjonowanie – schemat reakcji
Efekt pirosekwencjonowania – odczyt sekwencji - flowgram
The Genome Sequencer FLX System uses a revolutionary technology.
