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1 Terapia Gênica Isabela Campanelli Rachel Santini Renata MelloProf. Dr. Marcos Túlio2 Terapia gênica é o tratamento de doenças baseado na transferência de material genético. Em sua forma mais simples a terapia gênica consiste inserção de genes funcionais em células que apresentam genes defeituosos com função de substituir ou complementar esses genes causadores de doenças. A Terapia gênica é o uso de genes ao invés de drogas para tratamento de doenças.3 Um gene pode ser inserido em uma célula para Marcação gênica Um gene pode ser inserido em uma célula para servir como um marcador genotípico ou fenotípico Terapia gênica Através do desenvolvimento de linhas de células geneticamente marcadas; compreendeu-se o mecanismo de transformação celular em mamíferos pelos vírus polioma e SV40. O que possibilitou, posteriormente, criação de técnicas de DNA recombinante permitindo, assim, a primeira tentativa de transferência gênica em organismos complexos. (Friedman T, 1992 e Morsy MA,1991). De maneira análoga, um gen estranho pode ser inserido em uma célula para servir como um marcador genotípico ou fenotípico, que pode ser usado tanto em protocolos de marcação gênica quanto na própria terapia gênica. O panorama atual indica que a terapia gênica não se limita às possibilidades de substituir ou corrigir genes defeituosos, ou eliminar seletivamente células marcadas. Um espectro terapêutico muito mais amplo se apresenta à medida em que novos sistemas são desenvolvidos para permitir a liberação de proteínas terapêuticas, A terapia gênica é a esperança de tratamento para um grande número de doenças até hoje consideradas incuráveis por métodos convencionais, das hereditárias e degenerativas às diversas formas de câncer e doenças infecciosas.4 Das hereditárias e degenerativasA terapia gênica seria a esperança de tratamento para um grande número de doenças até hoje consideradas incuráveis por métodos convencionais!! Das hereditárias e degenerativas às diversas formas de câncer e doenças infecciosas. Dani,S.U. Terapia gênica. Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento.5 Primórdios da terapia gênicaA partir da década de 1940, a genética tomou grande Impulso: descobertas sobre a natureza, composição química, propriedades do material genético, manipulações do DNA de bactérias Geram expectativas de novos avanços terapêuticos!!! Em meados da década de 1960, começou a especulação sobre a possibilidade de utilizar vírus para transferir genes à seres humanos com doenças genéticas (Friedmann, 1997). Então, já acreditava- se na possibilidade de vírus como vetores!!! Entretanto, foi só no início da década seguinte que Paul Berg conseguiu de fato manipular uma molécula de DNA (Jackson et al., 1972), criando a tecnologia do DNA recombinante.6 Duas tentativas iniciais de aplicar na prática clínica o conceito de terapia gênica fracassaram: Uma delas por se apoiar em uma premissa sobre propriedades de um vírus, a qual, mais tarde, se mostrou falsa (Rogers, 1952; Rogers & Rous, 1951; Andrewes, 1966; Friedman, 2001; Scaglia & Lee, 2006); E outra, embora tecnicamente justificável e já utilizando metodologias de DNA recombinante, foi maculada por grave deslize ético (Mercola & Cline, 1980).7 Cenas para o próximo capítulo...Em 1989, um novo teste, feito de acordo com as regras vigentes na época, restabelecendo expectativas positivas nessa área de pesquisa. A paciente tratada era uma menina de quatro anos de idade incapaz de levar uma vida normal, porque sofria de uma doença genética causada por deficiência da enzima adenosina desaminase (ADA). Mas nem tudo deu errado!!! Cenas para o próximo capítulo...8 Métodos A maneira mais simples de transferir genes para células e tecidos é por meio da inoculação de DNA puro. A terapia gênica é realizada através da transferência gênica, existem várias formas de se transferir um gen, mas a forma mais simples é para células ou tecidos é através da inoculação de DNApuro. Técnicas como de biobalística, eletroporação e microinjeção.9 Microinjeção Microinjeção é o método mais direto e preciso para a inserção de macromoléculas dentro de uma célula ou compartimento celular. Uma técnica que se trabalha principalmente com animais. Para introdução do material genético, usa-se uma pipeta de vidro para segurar a célula e uma espécie de seringa para colocar um fragmento de código genético.10 Biobalística Uma técnica bastante utilizada é da biobalística, está técnica consiste na lógica da arma de fogo. Microprojéteis de tungstênio ou de ouro são embebidos por genes de interesse que são lançados a aproximadamente 1500 km/h em tecidos que entram nas células junto com os microprojéteis e se integram ao genoma. Uma vez inserido o gene de interesse com seu respectivo promotor, terminador e genes marcadores.11 Eletroporação12 Dani,S.U. Terapia gênica. Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento.13 Métodos mais elaborados e mais eficientes incluem a administração de DNA encapsulado (liposomos) ou através de vetores virais; Outra forma de transferência de DNA envolve a entrega de RNA diretamente ao citoplasma das células, mas o RNA é mais instável que o DNA, o que limita a aplicação dessa modalidade de transferência gênica; O uso de mitocôndrias ou DNA mitocondrial (mtDNA) como vetores gênicos citoplasmáticos tem aplicação potencial na reposição do mtDNA à células com deficiência no metabolismo energético da fosforilação oxidativa causada por mutações no mtDNA.14 Vetor ideal Acomodar um tamanho ilimitado de DNA inserido;Disponível em uma forma concentrada; Facilmente produzido; Direcionado a tipos específicos de células; Garantia de expressão gênica a longo prazo; Não-tóxico e não-imunogênico.15 Mais utilizados DNA Plasmidial complexado; Vetores retrovirais;16 DNA Plasmidial complexadoDani,S.U. Terapia gênica. Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento.17 Vetores retrovirais Dani,S.U. Terapia gênica. Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento.18 Dani,S.U. Terapia gênica. Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento.19 Argumentos a favor da terapia gênica20 Existe, entre os profissionais da área da saúde, a obrigação moral de por em prática os melhores métodos disponíveis para tratamento de doenças; Os pais devem ter plena autonomia e direito de acesso à tecnologia disponível visando a obtenção de gerar filhos sadios; Deve-se preservar a liberdade de pesquisa e o valor intrínseco do conhecimento.21 Resnik sugere que esse melhoramento genético seja governado por regulamentação própria e acompanhado de educação adequada, não necessitando violentar reconhecidos princípios de moralidade e justiça social. Gardner avança além, prevendo que o melhoramento genético das pessoas terá forte apelo para os pais que competem por filhos mais capazes e por nações que competem pelo acúmulo de capital humano de melhor qualidade.22 Argumentos contrários a terapia gênica23 Quando começa a vida individual e a quem pertence o patrimônio genético de cada pessoa?Para alguns, a pessoa está presente a partir do momento da concepção; para outros, é necessário o cumprimento de etapas mais tardias para reconhecimento dessa presença.24 Intervenção terapêutica sobre um embrião, independentemente do número de células existentes, quatro, oito ou mais, é reconhecidamente uma intervenção sobre uma pessoa por vir a ser e seus descendentes.25 Estudo de caso26 Em 1989, Ashanti, uma paciente de 4 de idade foi submetida a terapia gênica:- Sofria de uma doença genética causada por deficiência da enzima adenosina desaminase (ADA), indispensável para o desenvolvimento do sistema imune. Várias mutações no gene que codifica a enzima deficiência de ADA resultando em degeneração das células T do sistema imune constituindo uma das principais causas de síndrome de imunodeficiência combinada severa (SCID) (Buckley, 2004) doença é conhecida pela sigla SCID-ADA. Crianças afetadas, são conhecidas como "crianças da bolha“. A paciente tratada em 1989 era uma menina de quatro anos de idade incapaz de levar uma vida normal, porque sofria de uma doença genética causada por deficiência da enzima adenosina desaminase (ADA), indispensável para o desenvolvimento do sistema imune. Várias mutações no gene que codifica a enzima provocam deficiência de ADA, o que resulta em degeneração das células T do sistema imune (Buckley, 2004) e constitui uma das principais causas de síndrome de imunodeficiência combinada severa (SCID, do inglês severe combined immunodeficiency). No caso em questão, a doença é conhecida pela sigla SCID-ADA. Crianças afetadas pelas diversas formas de SCID (ibidem) têm baixíssima resistência a infecções e, se não forem tratadas, morrem em geral antes dos seis meses de idade. São conhecidas como "crianças da bolha", por necessitarem de isolamento feito, frequentemente, por meio de compartimentos de plástico transparente.27 O tratamento é usualmente feito por reposição da enzima através de injeções semanais.No 2º ano de tratamento a criança voltou a sofrer infecções frequentes e desenvolveu uma alergia ao preparado da enzima usado para injeções. Os indícios eram de que a terapia de reposição enzimática estava falhando!! O tratamento é usualmente feito por reposição da enzima através de injeções semanais. Naquele caso, depois de um período de um ano em que houve relativo sucesso, no segundo ano de tratamento a criança voltou a sofrer infecções frequentes e desenvolveu uma alergia ao preparado da enzima usado para injeções. Os indícios eram de que a terapia de reposição enzimática estava falhando. O médico William French Anderson, da Universidade do Sul da Califórnia, obteve então autorização dos comitês de ética para iniciar um teste de terapia gênica (Anderson et al., 1990).28 Até que então... O médico William French Anderson, da Universidade do Sul da Califórnia, obteve então autorização dos comitês de ética para iniciar um teste de terapia gênica (Anderson et al., 1990).29 Inserção do gene da ADA nas células A cada 2 meses, células T eram retiradas Inserção do gene da ADA nas células Indução à proliferação dessas células no laboratório Essas células tratadas eram devolvidas para o sangue da paciente Enzimas (Culver et al., 1991)30 Resultados... Melhora clínica com uma redução da quantidade de enzima que era necessário repor; Observou-se que os níveis da enzima no sangue das pacientes aumentaram progressivamente com a terapia gênica e se mantiveram estáveis no intervalo de descanso de seis meses (Blaese et al., 1995; Mullen et al., 1996). Doze anos após terminarem as infusões, época em que foi feita uma reavaliação do caso, grandes números de células T continuaram expressando o gene terapêutico no sangue da paciente. (Muul et al., 2003). Ainda a questões técnicas relacionadas a esse estudo, que não permitem considerá-lo um completo sucesso clínico. Houve melhora clínica com uma redução da quantidade de enzima que era necessário repor. Observou-se que os níveis da enzima no sangue das pacientes aumentaram progressivamente com a terapia gênica e se mantiveram estáveis no intervalo de descanso de seis meses (Blaese et al., 1995; Mullen et al., 1996). Finalmente, doze anos após terminarem as infusões, época em que foi feita uma reavaliação dos dois casos, grandes números de células T continuaram expressando o gene terapêutico no sangue da primeira paciente, cujo tratamento foi mais bem-sucedido do que o da segunda (Muul et al., 2003). Deve-se assinalar que ainda há questões técnicas relacionadas a esse estudo, que não permitem considerá-lo um completo sucesso clínico. Como as crianças continuaram a receber reposição da enzima, embora em doses menores, há dúvida sobre o quanto a terapia gênica terá de fato contribuído para que, por exemplo, a primeira paciente esteja hoje, aos 24 anos de idade, saudável e ativa. No entanto, a partir das observações feitas ao longo do tratamento dessas duas primeiras pacientes, a terapia gênica para SCID-ADA evoluiu e hoje é considerada um sucesso clínico (Aiuti et al., 2009; Kohn & Candotti, 2009). Mesmo incipiente, o estudo iniciado em 1989, que obteve pelo menos alguns resultados positivos observando os requisitos éticos, é um marco na história da terapia gênica e inspirou o crescimento subsequente dessa área de investigação científica.31 (Aiuti et al., 2009; Kohn & Candotti, 2009).No entanto,a terapia gênica para SCID-ADA evoluiu e hoje é considerada um sucesso clínico. (Aiuti et al., 2009; Kohn & Candotti, 2009). Mesmo “rudimentar”, o estudo iniciado em 1989, é um marco na história da terapia gênica e inspirou o crescimento subsequente dessa área de investigação científica.32 Conclusão Muitos estudos tem sido realizados, porém, no ponto de vista ético muitas coisas são questionáveis. Além dos riscos causadas pela maioria das técnicas utilizadas.33 Obrigada!!!!
