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Aislamiento y elucidación estructural de metabolitos secundarios a partir de esponjas, corales, tunicados y briozoos del Atlántico Sur y la Antártida Patiño Cano, Laura Patricia 2013 Tesis Doctoral Facultad de Ciencias Exactas y Naturales Universidad de Buenos Aires Contacto: Este documento forma parte de la colección de tesis doctorales y de maestría de la Biblioteca Central Dr. Luis Federico Leloir. Su utilización debe ser acompañada por la cita bibliográfica con reconocimiento de la fuente. This document is part of the doctoral theses collection of the Central Library Dr. Luis Federico Leloir. It should be used accompanied by the corresponding citation acknowledging the source. Fuente / source: Biblioteca Digital de la Facultad de Ciencias Exactas y Naturales - Universidad de Buenos Aires UNIVERSIDAD DE BUENS AIRES Facultad de Ciencias Exactas y Naturales Departamento de Química rgánica Aislamiento y elucidación estructural de metabolitos secundarios a partir de esponjas, corales, tunicados y briozoos del atlántico sur y la antártida. Tesis presentada para optar al título de Doctor de la Universidad de Buenos Aires en el área Química rgánica. Laura Patricia Patiño Cano Director de Tesis: Dr. Jorge A. Palermo Lugar de trabajo: UMYMFR-Departamento de Química rgánica, FCEyN-UBA Buenos Aires, Laura Patricia Patiño Cano Capítulo 1 2 AISLAMIENT Y ELUCIDACIÓN ESTRUCTURAL DE METABLITS SECUNDARIS A PARTIR DE ESPNJAS, CRALES, TUNICADS Y BRIZS DEL ATLÁNTIC SUR Y LA ANTÁRTIDA. Resumen En este trabajo se detalla el aislamiento y elucidación estructural de los metabolitos secundarios presentes en los extractos orgánicos de las esponjas Siphonochalina fortis y Tedania sp.; de los octocorales Anthomastus bathyproctus, Primnoella divaricata, Primnoella scotiae y Paramuricea sp.; de los tunicados Aplidium conicum y Aplidium sp. y del briozoo Aspidostoma giganteum. Todos los extractos de las especies estudiadas fueron fraccionados mediante distintas técnicas de cromatografía hasta la obtención de los metabolitos secundarios de interés puros. La elucidación estructural se realizó utilizando los experimentos de RMN 1D y 2D, espectrometría de masa y reacciones de derivatización. De la esponja Siphonochalina fortis, colectada en Bahía Bustamante, Chubut, se aislaron tres ácidos biliares acetilados (70-72). Este trabajo es el primer aislamiento de ácidos biliares acetilados a partir de esponjas. El compuesto 71 fue detectado por primera vez como producto natural. De la especie Tedania sp., recolectada en el Golfo de San José, Península Valdés, Chubut, se aislaron tres nucleósidos: 2 -desoxiuridina (85), 2 -desoxiadenosina (86) y timidina (87) y un A- nor esteroide (88). Del octocoral Anthomastus bathyproctus, recolectado en las islas Shetland del Sur, se aislaron 5 nuevos esteroides ( ). De los octocorales Primnoella divaricata y Primnoella scotiae, colectados en el Golfo de San Jorge, Chubut, se obtuvieron dos ácidos biliares oxidados ( ) y por último, del octocoral Paramuricea sp., recolectado cerca de las Islas Shetland del Sur, se aislaron 3 guayanólidos (110, 112 y 113). El compuesto 113 es nuevo. 3 Laura Patricia Patiño Cano Capítulo 1 Del tunicado Aplidium conicum, recolectado en la Península Valdés, Chubut, se aisló el meroterpenoide, (+)-conicol (144). Del tunicado Aplidium sp., colectado en la Península Valdés, Chubut, se aislaron los rubrólidos L (146) y (145). Del briozoo Aspidostoma giganteum, recolectado en el Golfo de San Jorge, Chubut, se aislaron 10 nuevos alcaloides bromados, las aspidostomidas A- (198, 207, , , 225, 227). Este es el primer reporte de este tipo de alcaloides en briozoos. Cinco de estas aspidostomidas, presentan una estructura derivada de tirosina unida a un anillo pirrólico altamente halogenado, a través de un enlace amida, mientras que otros 3 compuestos presentan una estructura derivada de triptofano unido a un anillo de pirrolocetopiperazina, altamente halogenado. Por ultimo, la diaspidostomida, es un ejemplo único de una estructura dimérica que exhibe una estructura N,N-diacil hidrazida en su esqueleto. Palabras clave: productos naturales marinos, Siphonochalina fortis, Tedania sp., Anthonomastus bathyproctus, Primnoella divaricata, Primnoella scotiae, Paramuricea sp., Aplidum conicum, Aplidium sp., Aspidostoma giganteum, ácidos biliares, nucleósidos, esteroides, guaianólidos, rubrólidos, alcaloides halogenados. 4 ISLATIN AND STRUCTURAL ELUCIDATIN F SECNDARY METABLITES FRM SUT ATLANTIC AND ANTARCTIC SPNGES, TUNICATES, CRALS AND BRYZANS. Abstract The isolation and structural elucidation of secondary metabolites from the organic extracts of the sponges Siphonochalina fortis and Tedania sp., from the octocorals Anthomastus bathyproctus, Primnoella divaricata, Primnoella scotiae and Paramuricea sp., from the tunicates Aplidium conicum and Aplidium sp and from the bryozoan Aspidostoma giganteum is described. All the extracts from the above-mentioned marine samples were fractionated using different chromatographic techniques, until the compounds of interest were purified. The structural elucidation was achieved by 1D and 2D NMR experiments, mass spectrometry and derivatization reactions. Three acetylated bile acids (70-72) were isolated from Siphonochalina fortis, collected at Bahia Bustamante, Chubut. This work represents the first isolation of acetylated bile acids from marine sponges. Compound 71 was isolated for the first time as a natural product. Three known nucleosides: 2 -deoxyuridine (85), 2 deoxyadenosine (86) and thymidine (87), together with an A-nor steroid (88) were isolated from Tedania sp, collected at San Jorge Gulf, Chubut. Five new steroids ( ) were isolated from the octocoral Anthomastus bathyproctus, collected near the Shetland Island. These steroids are closely related with a group of steroids previously isolated from this coral. Two oxidized bile acids ( ) were isolated from Primnoella divaricata and Primnoella scotiae, collected at San Jorge Gulf, Chubut. Three guainolides, linderazulene (110), a ketolactone (112) and a new brominated derivate (113) were isolated from the dark octocoral Paramuricea sp., collected at the Shetland Island. The known meroterpenoid (+)-conicol (144) was isolated from Aplidum conicum. The two known compounds, rubrolide L (146) and (145) were isolated from the tunicate Aplidium sp., collected at Peninsula Valdes, Chubut. 5 Laura Patricia Patiño Cano Capítulo 1 Ten new halogenated alkaloids, named aspidostomides A- (198, 207, , , 225, 227) were isolated from the bryozoan Aspidostoma giganteum, collected at San Jorge Gulf, Chubut. This is the first example of this class of alkaloids in bryozoans. Five of these alkaloids have a tyrosine residue linked to a pyrrolic acid by an amide bond. Three of the others have a tryptophane residue linked to a pirroloketopiperazine group. Diaspidostomide (222) is a unique example of a dimeric compound with an N,N-diacyl hydrazide structure. Key words: marine natural products, Siphonochalina fortis, Tedania sp., Anthomastus bathyproctus, Primnoella divaricata, Primnoella scotiae, Paramuricea sp., Aplidium conicum, Aplidium sp., Aspidostoma giganteum, bile acids, nucleosides, steroids, guaianolides, rubrolides, brominated alkaloids. 6 A MI PADRE, Que me enseñó a ser, a respetar, a vivir y que desde el cielo me guía. 7 Laura Patricia Patiño Cano Capítulo 1 8 A MI MADRE, por apoyarme y siempre estar presente. 9 Laura Patricia Patiño Cano Capítulo 1 10 A mi director de tesis, Dr. Jorge A. Palermo, por todos los conocimientos, por la calidad de persona que es, por ayudarme a crecer tanto en lo personal como lo profesional. 11 Laura Patricia Patiño Cano Capítulo 1 12 AGRADECIMIENTS A la Secretaria Nacional de Ciencia y Tecnología de Panamá (SENACYT) y al Instituto para la Formación y aprovechamiento de Recursos umanos (IFARU), por el financiamiento de este trabajo. A UMYMFR (CNICET-FCEyN) por las determinaciones instrumentales realizadas. A la Dra Gabriela Cabrera y Sr. Gabriel Cases por los espectros de masa de alta resolución y toda la colaboración brindada. A la Dra Laura Schjeter (INIDEP, Mar del Plata) por la recolección y clasificación de muestras de invertebrados y por las fotografías de Siphonochalina fortis, Tedania sp., Anthomastus bathyproctus y Paramuricea sp. Al Dr. Marcos Tatían (Laboratorio de Ecología Marina, Universidad Nacional de Córdoba) por la clasificación y fotografías de Aplidium conicum y Aplidium sp. A la Dra Claudia Muniaín (Universidad Nacional de San Martín) por la recolección, clasificación y fotografías de Aspidostoma giganteum, Primnoella scotiae y Primnoella divaricata. Al Dr. Ricardo Furlán (Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmaceúticas, Universidad Nacional de Rosario) por algunos de los espectros de masa de alta resolución. A las Dras. Alicia Bartolotta y Marta Carballo (Laboratorio de Citogenética umana y Genética Toxicológica, Facultad de Farmacia y Bioquímica, Universidad de Buenos Aires) por los ensayos de genotoxicidad. A la Dra. Susana Zachinno (Universidad Nacional de Rosario) por los ensayos de actividad antifúngica. A la Dra Lydia Puricelli y la Lic. elen Knott (Instituto de ncología Angel Roffo, Buenos Aires) por los ensayos de citotoxicidad contra líneas celulares tumorales humanas. Al Dr Alejandro Tapia y la Dra Gabriela Feresin (Universidad Nacional de San Juan) por los ensayos de actividad antimicrobiana. Al Dr Guillermo Blustein, Dra. Miriam Pérez, Lic. Mirta Stupak y Lic. Mónica García (Grupo de Incrustaciones Biológicas del CIDEPINT, La Plata) por el ensayo de actividad antiincrustante. 13 Laura Patricia Patiño Cano Capítulo 1 Al Dr Adolfo Iribarren (Laboratorio de Química de Ácidos Nucleicos del INGEBI) por los patrones de nucleósidos suministrados. A mis compañeros de laboratorio Marian, Gastón, Aure, Lucía, María Izabel y Rodrigo, por toda su cooperación, su compañerismo y paciencia a lo largo de todos estos años compartidos. A mis amigas, que aunque lejos siempre cerca, Karen L. Lang y Elisabeth Zambrano, por su apoyo incondicional y todos los momentos disfrutados juntas. Al grupo extendido de compañeros de laboratorio, Adriana, Valeria, Alejandra, enda, Victoria, Matías, Inés, Ivana, Pau y Andrés, por la asistencia siempre desinteresada y los momentos alegres compartidos. A Flor y Vir, por todas las cosas divertidas, por el badminton, los viajes y todo lo demás. A todos los compañeros del Departamento de Química rgánica, con quienes compartí clases, congresos y un sinfín de actividades, que hicieron de esta una gran experiencia y a los profesores por los conocimientos brindados. A mis amigos, Fer y Pablo, a los cuales me une una amistad incondicional, gracias por estar siempre, por sus consejos, su ayuda y más. A la Dra. Alicia Couto, a Adriana, Juliana, Malena y Tamara, con quienes compartí laboratorio, por la convivencia amena existente. A la Sra María del Carme Ares y Srta Nancy Aguirre, por auxiliarme siempre con los trámites de forma eficiente y cordial. Al Sr. Sergio Jacobo por todas las veces que me ayudo con los pedidos, los solventes y cualquier otro inconveniente. A mi familia, mis hermanos y sobrinos, que siempre han estado presentes, dándome sus consejos y amor. A mis amigos salseros, en especial a mi partner Juan, con quienes he disfrutado tantos momentos de satisfacción y a los cuales me une una linda amistad. A los amigos que a pesar del tiempo y la distancia siguen estando presentes, Kellin, Gloria, David, Edith, Nathy, Martha y Javier. Al resto de amigos y conocidos, por sus consejos y experiencias de vida compartidas, me siento afortunada de contar con ustedes. A Diego, quien me hace feliz y con el que he compartido los mejores momentos, gracias por todo. 14 ÍNDICE Lista de abreviaturas usadas. 19 Lista de Figuras...21 Lista de Tablas.27 CAPÍTUL 1. INTRDUCCIÓN Introducción...33 Productos naturales marinos..35 Tendencias en el descubrimiento de nuevos productos naturales..40 Tendencia química...40 Tendencia taxonómica.41 Tendencia geográfica...42 Factores que influyen en la producción de metabolitos secundarios...44 Microorganismos simbiontes..44 Biofouling 46 Productos naturales marinos patagónicos...48 Esponjas.49 Cnidarios 52 Tunicados..53 tros invertebrados..53 Productos naturales marinos antárticos 55 Esponjas.56 Cnidarios 57 Algas...58 Tunicados..59 yozoa..60 bjetivos del Trabajo de Tesis...61 Metodología de trabajo con productos naturales 62 Recolección de muestras 62 Selección de muestras a analizar..64 Aislamiento y purificación de los metabolitos secundarios...65 Elucidación estructural de los compuestos..65 Referencias Laura Patricia Patiño Cano Capítulo 1 CAPÍTUL 2: ESPNJAS Aislamiento y elucidación estructural de metabolitos secundarios de esponjas..71 Phyllum Porífera 71 Clase Demospongiae...72 Productos naturales de Demospongiae 73 Clase Calcárea..75 Productos naturales de Calcárea...76 Clase omoscleromorpha...77 Productos naturales de omoscleromorpha 77 Clase exactinellida.79 Productos naturales de exactinellida..79 Aspectos relevantes del estudio químico de las esponjas.80 Esponjas del género Siphonochalina Aislamiento y elucidación estructural de metabolitos secundarios de la esponja Siphonochalina fortis.83 Elucidación estructural del compuesto Elucidación estructural del compuesto Elucidación estructural del compuesto Esponjas del género Tedania.93 Aislamiento y elucidación estructural de metabolitos secundarios de la esponja Tedania sp..96 Elucidación estructural del compuesto Elucidación estructural del compuesto Elucidación estructural del compuesto Elucidación estructural del compuesto Referencias..108 CAPÍTUL 3: CTCRALES Aislamiento y elucidación estructural de metabolitos secundarios de octocorales Phyllum Cnidaria.113 Clase Anthozoa Estudios químicos Gorgonácea Alcyonácea.117 Aislamiento y elucidación estructural de metabolitos secundarios aislados de Anthomastus bathyproctus..119 Elucidación estructural del compuesto Elucidación estructural del compuesto Elucidación estructural del compuesto Elucidación estructural del compuesto Elucidación estructural del compuesto Aislamiento y elucidación estructural de metabolitos secundarios aislados de octocorales del género Primnoella. 136 Elucidación estructural del compuesto Elucidación estructural del compuesto Aislamiento y elucidación estructural de metabolitos secundarios aislados del octocoral Paramuricea sp Elucidación estructural del compuesto Elucidación estructural del compuesto Elucidación estructural del compuesto Referencias 157 CAPÍTUL 4: TUNICADS Aislamiento y elucidación estructural de metabolitos secundarios de tunicados.161 Clase Ascidiacea Tunicados del género Aplidium.170 Aislamiento y elucidación estructural de metabolitos secundarios aislados del tunicado Aplidium conicum..173 Elucidación estructural del compuesto Aislamiento y elucidación estructural de metabolitos secundarios del tunicado Aplidium sp..179 Elucidación estructural del compuesto Elucidación estructural del compuesto Referencias Laura Patricia Patiño Cano Capítulo 1 CAPÍTUL 5: BRYZA Aislamiento y elucidación estructural de metabolitos secundarios de bryozoa Phyllum yozoa.189 Clasificación.190 Estudios químicos Metabolitos secundarios de la clase Stenolaemata..191 Metabolitos secundarios de la clase Gymnolaemata Aislamiento y elucidación estructural de los metabolitos secundarios del briozoo Aspidostoma giganteum 202 Elucidación estructural del compuesto Elucidación estructural del compuesto Elucidación estructural del compuesto Elucidación estructural del compuesto Elucidación estructural del compuesto Elucidación estructural de los compuestos 220 y Elucidación estructural del compuesto Elucidación estructural del compuesto Elucidación estructural del compuesto Elucidación estructural del compuesto Elucidación estructural de los compuestos Referencias. 261 CAPÍTUL 6: DATS EXPERIMENTALES Instrumentos y métodos empleados 267 Aislamiento de los ácidos biliares de Siphonochalina fortis 269 Aislamiento de los nucleósidos de Tedania sp..271 Aislamiento de los esteroides de Anthomastus bathyproctus Aislamiento de esteroides de corales del género Primnoella. 280 Aislamiento de guayanólidos del octocoral Paramuricea sp Aislamiento de (+)-conicol a partir del tunicado Aplidum conicum Aislamiento de rubrólidos de Aplidium sp..285 Aislamiento de las aspidostomidas de Aspidostoma giganteum Conclusiones..298 Total de compuestos aislados Listado de abreviaturas empleadas o AcEt o c.c.d o CSY o c o d o da o ddd o dddd o EM o Et o Et o ESI-EM o MBC o SQC o z o PLC o IR o J o m o m/z o Me o MTPA o µg o µl o NE o NPNM o nm o Me o Et o ppm o RMN- 13 C o RMN- 1 acetato de etilo cromatografía de capa delgada Correlation through long-range coupling cuarteto doblete doblete ancho doble doble doblete doble doble doble doblete espectrometría de masa etilo etanol espectrometría de masa por ionización por electrospray eteronuclear Multiple Bond Correlation eteronuclear Single-quantum Correlation hertz cromatografia líquida de alta resolución infrarrojo constante de acoplamiento multiplete relación masa/carga metilo ácido metoxi(trifluorometil) fenilacético microgramo microlitro Efecto Nuclear verhauser nuevos productos naturales marinos nanómetro metoxilo etoxilo parte por millón resonancia magnética nuclear de carbono-13 resonancia magnética nuclear de hidrogeno 19 Laura Patricia Patiño Cano Capítulo 1 o s o sa o t o UV singulete singulete ancho triplete ultravioleta 20 Lista de figuras Figura 1: Total de nuevas drogas aprobadas en el período , discriminadas según su origen Figura 2: Ecteinascidia turbinata...37 Figura 3: Grupos químicos de NPNM de invertebrados...41 Figura 4: Número de NPNM descubiertos de invertebrados marinos entre , según el grupo químico.. 43 Figura 5: Latrunculia brevis 50 Figura 6: Tyrinna nobilis.55 Figura 7: Dendrilla membranosa..56 Figura 8: Kirkipatrickia variolosa...57 Figura 9: Clavularia frankliniana, Alcyonium paessleri y Germesia antártica...57 Figura 10: Caberea Darwin y imatozoum antarticum.61 Figura 11: Porcentaje de invertebrados marinos provenientes de la Antártida...61 Figura 12: Localización de las zonas de muestreo en el Golfo de San Matías y San José, Chubut.63 Figura 13: Localización de las zonas de muestreo en Bahía Bustamante. 63 Figura 14: Localización de las estaciones de muestreo de Bentos durante la campaña Antártica. 63 Figura 15: Detalle de una cámara de coanocitos de Scopalina ruetzleri obtenida por SEM, b) Estructura interna de una esponja, c) Imagen de una sección del mesoilo de la esponja S. ruetzleri Figura 16: Porcentaje de contribución de las cuatro clases dentro de Porífera 72 Figura 17: Esponja de baño (Spongia officinalis), esponja excavadora (Cliona celata) y esponja gigante (Xestospongia testudinaria)...73 Figura 18:.Trachycladus laevispirulifer. 75 Figura 19: Guancha lacunosa y Pericharax heteroraphis.75 Figura 20: Plakortis simplex, Corticium candelabrum...77 Figura 21: Micrografía de escaneo de electrones de microescleras..79 Figura 22: Siphonochalina siphonella y Siphonochalina fortis.81 Figura 23: Esquema de fraccionamiento de la esponja Siphonochalina fortis..84 Figura 24: Espectro RMN- 1 del compuesto Figura 25: Espectro RMN- 13 C del compuesto Laura Patricia Patiño Cano Capítulo 1 Figura 26: Espectro RMN- 1 del compuesto Figura 27: Espectro RMN- 13 C del compuesto Figura 28: Espectro RMN- 1 del compuesto Figura 29: Espectro RMN- 13 C del compuesto Figura 30: Tedania ignis y Tedania sp.93 Figura 31: Tedania sp.96 Figura 32: Esquema de fraccionamiento de la esponja Tedania sp...97 Figura 33: Espectro RMN- 1 del compuesto Figura 34: Espectro RMN- 13 C del compuesto Figura 35: Espectro RMN- 1 del compuesto Figura 36: Espectro RMN- 1 del compuesto Figura 37: Espectro RMN- 13 C del compuesto Figura 38: Espectro RMN- 1 del compuesto Figura 39: Espectro RMN- 13 C del compuesto Figura 40: Espectro MBC del compuesto Figura 41: Anthosteronas y Phorbastheronas..
