Tkanka Limfoidalna I Układ Limfatyczny

Transcript

Mechanizmy obronne organizmu: Odporność wrodzona: Tkanka limfoidalna i układ limfatyczny • bariery nabłonkowe • komórki fagocytujące • ostre stany zapalne (neutrofile, makrofagi, inne granulocyty, mastocyty) • limfocyty NK • układ dopełniacza Odporność adaptatywna (nabyta) • reakcje immunologiczne (limfocyty B, T, komórki prezentujące antygen, makrofagi) Antygen: substancja (zazwyczaj białko) wywołująca reakcję immunologiczną Epitop: fragment antygenu rozpoznawany przez receptory limfocytów i/lub wiążący się z przeciwciałem Przeciwciało (immunoglobulina): białko (produkowane głównie przez komórki plazmatyczne) swoiście wiążące epitop klasy: IgG, IgM, IgD, IgE, IgA - zmodyfikowane przez komórki wydzielnicze Antygeny: • własne (tolerowane przez układ immunologiczny; ważne: antygeny zgodności tkankowej MHC I i II) • obce (atakowane przez układ immunologiczny, np. bakteryjne, wirusowe, pasożytnicze, przeszczepu) Subpopulacje limfocytów: Limfocyty B - odpowiedzialne za humoralną reakcję immunologiczną, BCR receptor BCR (immunoglobulina powierzchniowa) Limfocyty T - odpowiedzialne za komórkową reakcję immunologiczną, receptor TCR TCR • limfocyty T pomocnicze (T H) • limfocyty T cytotoksyczne (T C) • limfocyty T regulatorowe (T reg) = supresyjne (T S) Limfocyty NK (natural killers) Specyficzne białka (antygeny) powierzchniowe limfocytów: • CD20, CD40 – limfocyty B • CD4 – limfocyty T H • CD8 – limfocyty T C • CD4, CD25 – limfocyty T reg • CD16, CD56 – limfocyty NK Komórki prezentujące antygen (APC): 1. „Profesjonalne” (działają spontanicznie) • makrofagi • komórki dendrytyczne - kom. dendrytyczne w tkance limfoidalnej - kom. splatające się w tkance limfoidalnej - kom. Langerhansa w naskórku i innych nabłonkach (jama ustna, drogi oddechowe) • limfocyty B 2. „Nieprofesjonalne” (wymagają stymulacji cytokinami) • komórki nabłonkowe zrębu grasicy • komórki śródbłonka naczyń • fibroblasty • komórki mikrogleju Komórki APC pochłaniają antygen, nadtrawiają go (w lizosomach, niekiedy w proteasomach) i wystawiają jego fragmenty (epitopy) na swoją błonę komórkową razem z antygenem MHC II - prezentując w ten sposób antygen limfocytom T. 1 Typy reakcji immunologicznych: odpowiedź humoralna 1. Przyłączenie obcego antygenu do receptora limfocytu B 2. Pobranie i prezentacja antygenu przez limfocyt B (pełni rolę APC) limfocytowi TH2 – aktywacja limfocytu TH2 (wydziela cytokiny) 3. Aktywacja limfocytu B przez cytokiny limfocytu TH2 4. Proliferacja limfocytu B (powstaje klon identycznych limfocytów B) 5. Transformacja limfocytów B w plazmocyty 6. Plazmocyty produkują przeciwciała (immunoglobuliny) skierowane przeciw antygenowi, który wywołał reakcję Typy reakcji immunologicznych: odpowiedź komórkowa 1. Rozpoznanie obcego antygenu (związanego z komórką) przez komórkę APC i aktywacja limfocytu TH1 2. Limfocyt TH1 aktywuje limfocyty TC 3. Proliferacja limfocytów TC 4. Kontakt limfocytów TC z komórkami obcymi antygenowo 5. Limfocyty TC zabijają obce antygenowo komórki, wydzielając specjalne białka: perforyny i granzymy ! Niektóre limfocyty TC pozostają jako limfocyty T pamięci ! Niektóre limfocyty B nie przekształcają się w komórki plazmatyczne, pozostając jako limfocyty B pamięci Perforyny wbudowują się w błonę komórkową atakowanej komórki i tworzą w niej stale otwarte kanały Granzymy wnikają do wnętrza atakowanej komórki i indukują proces apoptozy Limfocyty NK (natural killers): • nie mają cech limfocytów B ani T • duże (12 µm) • zawierają dość liczne, duże pęcherzyki hydrolazowe • stała „gotowość” cytotoksyczna • zabijają: - komórki obce antygenowo, zwłaszcza pokryte przeciwciałami (ADCC) - komórki bez „własnych” antygenów MHC lub z ich obniżoną ekspresją (np. komórki zainfekowane wirusami, komórki nowotworowe) • mechanizm zabijania taki jak limfocytów Tc atak... i zwycięstwo Umiejscowienie tkanki limfoidalnej: Tkanka limfoidalna = • tkanka łączna siateczkowa + • bardzo liczne limfocyty • narządy limfatyczne: węzły chłonne Tkanka łączna siateczkowa: • sieć włókien siateczkowych tworzących rusztowanie dla • komórek z wypustkami (fibroblasty, makrofagi, komórki dendrytyczne) śledziona grasica* • tkanka limfoidalna błon śluzowych: - migdałki - przewód pokarmowy wraz z wyrostkiem robaczkowym - drogi oddechowe 2 Formy tkanki limfoidalnej: Węzeł chłonny • zrąb łącznotkankowy: • grudkowa - torebka - beleczki/przegrody (głównie limfocyty B) • rozproszona (limfocyty T i B) Grudki chłonne: • pierwotne • wtórne (po kontakcie z obcym antygenem) - mankiet - ośrodek odczynowy (namnażanie limfocytów B, przekształcanie w komórki plazmatyczne) B T • obszary: - kora (grudki chłonne, głównie limfocyty B) - pas przykorowy (tkanka limfoidalna rozproszona, głównie limfocyty T) - rdzeń (sznury rdzenne, limfocyty B, T, komórki plazmatyczne) Węzły chłonne są „filtrami” na przebiegu naczyń limfatycznych, monitorują antygeny obecne w chłonce i w razie potrzeby inicjują reakcje immunologiczne Drogi przepływu chłonki przez węzeł chłonny 1. Naczynia chłonne doprowadzające 2. Zatoki brzeżne 3. Zatoki przybeleczkowe (promieniste) 4. Zatoki rdzenne 5. Naczynie chłonne wyprowadzające kora i pas przykorowy Zatoki: przestrzenie wyścielone nieciągłą warstwą komórek śródbłonkowych rdzeń zatoki brzeżne i przybeleczkowe Recyrkulacja limfocytów zatoki rdzenne Naczynia chłonne • tkanka limfoidalna węzła • zatoki przykorowe i rdzenne węzła • wyprowadzające naczynie chłonne • krew • żyłki o wysokim śródbłonku • tkanka limfoidalna węzła Żyłki o wysokim śródbłonku (HEV) – postkapilary wyścielone sześciennymi lub walcowatymi komórkami śródbłonkowymi – miejsce migracji limfocytów z krwi do tkanki limfatycznej Kapilary: • kom. śródbłonkowe (ściana ciągła, ale o znacznej przepuszczalności) • blaszka podstawna Większe naczynia chłonne: • budowa ściany jak w cienkościennych żyłach • obecne zastawki 3 Miazga biała: tkanka limfoidalna jest rozmieszczona na przebiegu Śledziona małych tętnic (tętniczek centralnych) i tworzy: • pochewki okołotętnicze (głównie limfocyty T) • lokalne zgrubienia pochewek - grudki chłonne śledzionowe (głównie limfocyty B) Zrąb łącznotkankowy: • torebka • beleczki TC Obszary: • miazga biała (tkanka limfoidalna) • miazga czerwona (tkanka łączna siateczkowa z licznymi cienkościennymi naczyniami krwionośnymi) Tkanka limfoidalna miazgi białej monitoruje skład antygenowy przepływającej krwi Miazga czerwona: • sznury śledzionowe: tkanka łączna siateczkowa z licznymi makrofagami, obecna krew (otwarte krążenie) • zatoki śledzionowe (kapilary o nieciągłej ścianie) • żyły miazgowe Zatoka śledzionowa: • wrzecionowate komórki śródbłonkowe (komórki pręcikowe) z szerokimi szczelinami międzykomórkowymi • okrężne włókna srebrochłonne • nieciągła blaszka podstawna Strefa brzeżna Makrofagi miazgi czerwonej fagocytują i trawią „stare” erytrocyty Strefa brzeżna (pogranicze miazgi białej i czerwonej) jest miejscem pierwszego kontaktu antygenów z tkanką limfoidalną śledziony • liczne niewielkie naczynia zatokowe • liczne komórki prezentujące antygeny miazga biała Otwarte krążenie krwi w śledzionie Miazga czerwona: tętnice beleczkowe (1) tętniczki centralne (2) tętniczki pędzelkowe (3) OTWARTE kapilary osłonkowe* (4) przestrzenie międzykomórkowe sznurów śledzionowych (5) OTWARTE zatoki śledzionowe (6) żyły miazgowe (7) żyły beleczkowe (8) 6 miazga czerwona 4 3 5 9 7 Miazga biała: tętnice beleczkowe (1) tętniczki centralne (2) OTWARTE gałązki tętniczek centralnych (9) przestrzenie międzykomórkowe strefy brzeżnej OTWARTE zatoki strefy brzeżnej (10) 2 10 8 strefa brzeżna 1 beleczka Beleczki: - tętnice i żyły beleczkowe Grasica różni się od innych narządów limfatycznych: • pochodzenie nabłonkowe • brak tkanki łącznej siateczkowej • brak grudek chłonnych • wyłącznie limfocyty T (tymocyty) • nie zachodzą reakcje immunologiczne skierowane przeciw obcym antygenom • funkcja: „szkoła” dla niedojrzałych limfocytów T Budowa pseudozrazikowa: • torebka łącznotkankowa • niekompletne przegrody łącznotkankowe dzielące miąższ na obszary (zraziki) o podobnej budowie Strefy zrazika grasiczego: • kora (bardzo liczne limfocyty) • rdzeń (mniej liczne limfocyty) *kapilary osłonkowe – otoczone warstwą fibroblastycznych komórek siateczkowych i makrofagów 4 1. Komórki gwiaździste prezentują własne antygeny MHC dojrzewającym limfocytom T Wewnętrzne rusztowanie zrazików grasicy budują komórki nabłonkowe (nabłonkowo-siateczkowe) różnych typów: komórka gwiaździsta • gwiaździste • barierowe • ciałek Hassalla 2. Komórki barierowe Są połączone strefami zamykającymi, tworząc bariery oddzielające korę zrazika od tkanki łącznej, naczyń krwionośnych (bariera krew-grasica) i od rdzenia. Bariera uniemożliwia dostęp obcych antygenów na teren kory (przedwczesna aktywacja limfocytów prowadziłaby do ich apoptozy). Komórki nabłonkowo-siateczkowe tworzą sieć, w jej przestrzeniach leżą: • limfocyty T • makrofagi • komórki dendrytyczne Dojrzewanie limfocytów w grasicy 3. Ciałka Hassalla • tylko w rdzeniu zrazików • koncentryczny układ komórek nabłonkowych, często degenerujacych (szkliwienie, rogowacenie) • wydzielają cytokiny kontrolujące dojrzewanie limfocytów Treg komórka gwiaździsta prezentująca MHC • ekspresja receptorów TCR receptory • ekspresja antygenów CD (różnicowanie w komórki TH, TC lubTreg) • selekcja: komórki gwiaździste i komórki dendrytyczne prezentują limfocytom własne niedojrzałe limfocyty T antygeny – limfocyty, które ich nie rozpoznają albo rozpoznają, ale atakują – giną na drodze apoptozy - przeżywa zaledwie ok. 2 %! selekcja słabe wiązanie przechodzą do krwi mocne wiązanie (atak) brak wiązania apoptoza i eliminacja przez makrofagi Przeżywają zatem te, które rozpoznają i tolerują własne antygeny organizmu. Grasica zanika po okresie pokwitania – zostaje zastąpiona przez tkankę tłuszczową. Limfocyty B dojrzewają w szpiku krwiotwórczym, gdzie ulegają podobnej selekcji – własne antygeny są im prezentowane przez komórki zrębowe Migdałki krypty • są wbudowane w błonę śluzową (należą do tzw. tkanki limfoidalnej błon śluzowych) • ich powierzchnię pokrywa nabłonek, który tworzy wpuklenia – krypty) • krypta otoczona tkanką limfoidalną = mieszek • obecne grudki chłonne i rozproszona tkanka limfoidalna • przeważają limfocyty B • brak doprowadzających naczyń chłonnych, obecne naczynia wyprowadzające Tkanka limfoidalna migdałków reaguje na antygeny obecne w jamie gardłowej (powietrze, pokarm), jeżeli przejdą one przez barierę nabłonkową 5 Migdałki podniebienne Migdałek gardłowy • największe • otoczone łącznotkankową torebką • liczne (ok. 20) głębokie krypty • nabłonek wielowarstwowy płaski • wpuklenia nabłonka (rowki oddzielające fałdy błony śluzowej) • nabłonek dróg oddechowych (wieloszeregowy z migawkami i komórkami kubkowymi) krypta Migdałki trąbkowe Migdałek językowy • zlokalizowane u ujścia trąbek słuchowych • brak wpukleń nabłonka • nabłonek dróg oddechowych • pojedyncza, rozgałęziona krypta • nabłonek wielowarstwowy płaski PODSTAWY IMMUNOHISTOCHEMII Determinanty antygenowe (epitopy) - fragmenty cząsteczki antygenu, z którymi reagują przeciwciała Metody immunohistochemiczne wykorzystują swoiste wiązanie antygenu przez przeciwciało Struktura cząsteczki immunonoglobuliny domeny Miejsce wiązania antygenu (Fab) Miejsce wiązania antygenu (Fab) Jednak potocznie mówi się o reakcji antygenu z przeciwciałem Przeciwciała poliklonalne monoklonalne Fab – 2x Wiążą różne epitopy antygenu Wiążą tylko jeden rodzaj epitopu 6 Otrzymywanie przeciwciał poliklonalnych Otrzymywanie przeciwciał monoklonalnych immunizacja zwierząt – kilkukrotne podanie parenteralne antygenu z adjuwantem pobranie krwi i uzyskanie oczyszczonej surowicy Reakcja antygen-przeciwciało stereospecyficzne łączenie przeciwciała i determinanty antygenowej - odległość pomiędzy cząsteczkami 0.2-0.3 nm sprzyja powstawaniu bardzo licznych wiązań van Der Waalsa i innych słabych oddziaływań nie powstają wiązania kowalencyjne Reakcja antygen-przeciwciało, a metoda IHC - każda substancja (białko) pochodzące od jednego gatunku jest antygenem dla osobnika innego gatunku - immunoglobuliny jednego gatunku stanowią antygen dla osobników innego gatunku Metody immunohistochemiczne • dzięki wykorzystaniu swoistych przeciwciał pozwalają na identyfikację w materiale histologicznym specyficznych białek (antygeny) • dzięki czułym metodom detekcji umożliwiają rozpoznanie bardzo małych ilości antygenu Znakowanie przeciwciał MIKROSKOPIA ŚWIETLNA enzymy fluorochromy MIKROSKOPIA ELEKTRONOWA ferrytyna złoto koloidalne 7 Znakowanie enzymami Enzymy stosowane w IHC SUBSTRAT E PRODUKT peroksydaza chrzanowa (HRP) alkaliczna fosfataza (AP) oksydaza glukozowa (Aspergillus niger) β-galaktozydaza (E. coli) Przeciwciała znakowane enzymami wymagają przeprowadzenia dodatkowej reakcji histochemicznej wykrywającej aktywność enzymu. Stosowane do tego celu odczynniki noszą nazwe chromogenów Chromogeny Znakowanie fluorochromami PEROKSYDAZA 3,3’diaminobenzydyna (DAB) 3amino-9etylokarbazol (AEC) 4chloro-1naftol (CN) FOSFATAZA ALKALICZNA new fuchsin fast red F Fluorochromy pochodne fluoresceiny (np. FITC), Cy2, AlexaFluor 488 pochodne rodaminy (np. TRITC), Cy3, Texas Red, AlexaFluor 555 pochodne kumaryny (np. AMCA), AlexaFluor 405 światło emisji ENERGIA ENERGIA światło wzbudzenia Fluorochromy - przykłady F Cy5, AlexaFluor 647 – emisja w widmie podczerwieni FITC wzbudzenie - max. 494 nm emisja - max. 520 nm Mikroskop epifluorescencyjny 8 Typy reakcji immunohistochemicznych Typy reakcji immunohistochemicznych reakcja pośrednia dwuetapowa reakcja bezpośrednia przeciwciało pierwotne przeciwciało wtórne przeciw immunoglobulinom (antyglobulina) - znakowane znacznik – np. fluorochrom Typy reakcji immunohistochemicznych Typy reakcji immunohistochemicznych reakcja pośrednia PAP reakcja pośrednia ABC (peroxidase anti-peroxidase) (avidin-biotin complex) SUBSTRAT HRP SUBSTRAT HRP PRODUKT przeciwciało wtórne - biotynylowane PRODUKT Reakcja z polimerami Typy reakcji immunohistochemicznych reakcja pośrednia LAB (labeled avidin*-biotin) reakcja dwuetapowa SUBSTRAT HRP przeciwciało wtórne - biotynylowane PRODUKT * ... lub streptavidin (LSAB) 9 Uwagi praktyczne Zawiązek kończyny – wzrastające włókna nerwowe GAP-43 HE utrwalanie materiału i odtwarzanie miejsc wiązania przeciwciał (metody przygotowania skrawków) preinkubacja z normalną, nieimmunogenną surowicą blokowanie endogennej aktywności enzymatycznej inkubacje z przeciwciałami (rozcieńczenia, czas) oraz płukanie w buforze pomiędzy etapami (przyklejanie skrawków) podwójne barwienia reakcje kontrolne tło i podbarwianie problemy z fluorochromami Mózg człowieka - astrocyty Migdałek podniebienny GFAP CD20 Płuca – ciałka neuroepitelialne (NEBs) w drogach oddechowych Unerwienie tętnicy w mięśniu szkieletowym CD3 GAP-43 PGP 9.5 CGRP PARV 10 Linia komórek HeLa Zwój międzykręgowy GAP-43 CGRP α− tubulina 11