Utilizzo Ottimale Dei Test Di Ii° Livello Per Talassemia

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UTILIZZO OTTIMALE DEI TEST DI II° LIVELLO PER TALASSEMIA Dr.ssa Anna Ravani Laboratorio di Genetica Molecolare Servizio di Genetica Medica Azienda Ospedaliera-Universitaria S.Anna FERRARA EMOGLOBINOPATIE: EZIOPATOGENESI TALASSEMIE: PROTEINA ASSENTE PROTEINA RIDOTTA VARIANTI EMOGLOBINICHE: PROTEINA MODIFICATA FUNZIONE CONSERVATA FUNZIONE RIDOTTA O ASSENTE β- talassemia Diminuita o assente sintesi di catene β globiniche Eccesso di catene α globiniche Aggregati e precipitati di α globine nei precursori eritroidi Danno cellulare e distruzione dei precursori a livello midollare Eritropoiesi inefficace GENI GLOBINICI MUTAZIONI NEL GENE β−GLOBINICO LEGENDA: ROSSO: codone β°39 β° GIALLO: IVS I-110 VERDE: IVS I-6 BLU: IVS I-1 FUCSIA: Hb Lepore AZZURRO: Hb S NERO: IVS II-745 ARANCIO: IVS II-1 BIANCO: Altri difetti ß ° c o d .3 9 β ß + IV S 1 - n t 1 1 0 ß + IV S 1 - n t 6 ß ° IV S 1 - n t 1 ß + IV S 2 - n t 7 4 5 ß° c o d . 6 ß+ -8 7 ß ° IV S 2 - n t 1 ß T h tipo Sic ilia H b Le p o r e Hb S Hb C Hb E ß +I V S 2 n t 8 5 0 ß+ -1 01 ß+ -92 ß°c o d 3 0 ß°c o d 4 4 ß+ -86 ß +I V S 1 nt5 ß +I V S 2 n t 6 5 4 ß°c o d 5 1 ß°c o d 8 ß°c o d 5 9 ß°c o d 5 ß°c o d 7 6 ß + n t +2 2 ANEMIA FALCIFORME DELEZIONI del gene beta globinico o del cluster beta-like causa di talassemia DIAGNOSTICA RICHIESTA AL II° LIVELLO RISCHIO DI COPPIA: •CARATTERIZZAZIONE DEL DIFETTO MOLECOLARE •DIAGNOSI DIFFERENZIALE BETA/ALFA/DELTA TALASSEMIA DIAGNOSI INCERTA IN SOGGETTI SINGOLI: •DIAGNOSI DIFFERENZIALE BETA/ALFA/DELTA TALASSEMIA DIAGNOSI MOLECOLARE COMPLEMENTARE A QUELLA CLINICA, PER PROGRAMMAZIONE TERAPEUTICA IN SOGGETTI CON PATOLOGIA: •CARATTERIZZAZIONE DEL DIFETTO MOLECOLARE •IDENTIFICAZIONE FATTORI GENETICI MODIFICATORI DEL FENOTIPO CARATTERIZZAZIONE DEL DIFETTO MOLECOLARE CAUSA DI BETA TALASSEMIA METODICHE UTILIZZATE RDB SEQUENZIAMENTO DIRETTO GENE BETA GLOBINICO GAP – PCR per delezioni nel cluster beta globinico Diagnostica - PCR REVERSE DOT BLOT - Mutazioni gene β−globinico 1 2 3 4 5 C Campione n°1 - Eterozigote Cod. 39 Campione n°2 - Normale Campione n°3 - Eterozigote Cod. 39 Campione n°4 - Eterozigote IVS1-nt6 Campione n°5 - Eterozigote IVS2-nt745 Sequenziamento automatico Sequenza gene beta globinico: Mutazione in eterozigosi C→T cod.39 gene beta globinico GAP-PCR Delezioni di dimensioni variabili che rimuovono i geni β e δ globinici (es. δβ talassemia Sicilia). WM 1 2 3 4 5 b WM 1 2 3 4 5 b δ β TALASSEMIA Lane1, 3: Soggetti normali Lane 2, 4,5: Eterozigoti δβ° talassemia Gap-PCR: delezione Gene β: controllo DIAGNOSI DIFFERENZIALE METODICHE UTILIZZATE LONG RANGE PCR per delezioni nei geni alfa globinici SEQUENZIAMENTO DIRETTO per geni beta, delta, gamma ed alfa globinici GAP – PCR per delezioni nel cluster beta globinico CLUSTER α−GLOBINICO: GRANDI DELEZIONI LONG RANGE PCR per identificazione di delezioni ed inserzioni del cluster alfa globinico WM6 1 2 3 4 b WM6 1 2 3 4 b DELEZIONE -(α)3.7 [A, B, C] TRIPLICAZIONE ααα anti 3.7 [T37,D,F,G] Lane 1: Soggetto normale Lane 1-2-3: Soggetti normali Lane 2 – 3: Soggetti eterozigoti Lane 4: Soggetto portatore della triplicazione Lane 4: Soggetto omozigote A D C L ζ 5’MED ψα G B L α2 F T37 α1 E 3’MED 5’-20.5 B WM 6 1 2 c 3 4 c WM6 1 2 3 c 4 5 6 c WM6 POINT MUTATIONS [α1: T37, B -- α2 : A, D] Lane 1-2: Wild type Lane 3: Heterozygote αNcoI ( α2 gene) Lane 4-5: Wild type Lane 6: Heterozygote αHphI (α2 gene) Lane 7-8: Wild type (α1 gene) LARGE MEDITERRANEAN DELETIONS Lane1: Wild type Lane 2: Heterozygote –MED [5’MED, 3’MED,L,D] Lane 3: Wild type Lane 4: Heterozygote -(α)20 [-20.5, B, L, D] A D C L ζ 5’MED ψα G T37 B L α2 F α1 E 3’MED 5’-20.5 7 8 c B Sequenza geni α−globinici: Mutazione puntiforme codon d’inizio gene α2-globinico DIAGNOSTICA RICHIESTA AL II° LIVELLO RISCHIO DI COPPIA: •CARATTERIZZAZIONE DEL DIFETTO MOLECOLARE •DIAGNOSI DIFFERENZIALE BETA/ALFA/DELTA TALASSEMIA DIAGNOSI INCERTA IN SOGGETTI SINGOLI: •DIAGNOSI DIFFERENZIALE BETA/ALFA/DELTA TALASSEMIA DIAGNOSI MOLECOLARE COMPLEMENTARE A QUELLA CLINICA, PER PROGRAMMAZIONE TERAPEUTICA IN SOGGETTI CON PATOLOGIA: •CARATTERIZZAZIONE DEL DIFETTO MOLECOLARE •IDENTIFICAZIONE FATTORI GENETICI MODIFICATORI DEL FENOTIPO RISCHIO DI COPPIA •ENTRAMBI PORTATORI ACCERTATI DI BETA TALASSEMIA: OCCORRE IDENTIFICARE IL DIFETTO MOLECOLARE PER DEFINIRE LA GRAVITA’ DEL RISCHIO PER LA PROLE E PER POTER EFFETTUARE UNA EVENTUALE DIAGNOSI PRENATALE •CONDIZIONE DI PORTATORE BETA DUBBIA IN UNO O ENTRAMBI I PARTNER: OCCORRE ANALIZZARE I VARI GENI GLOBINICI PER STABILIRE L’EFFETTIVO RISCHIO PER LA COPPIA •SOSPETTO DI ALFA TALASSEMIA IN ENTRAMBI I PARTNER: OCCORRE TIPIZZARE IL DIFETTO MOLECOLARE PER STABILIRE L’EVENTUALE RISCHIO DI IDROPE FETALE O EMOGLOBINOSI H NELLA PROLE DIAGNOSI INCERTA •MUTAZIONI GENE BETA GLOBINICO MILD O SILENTI •GENI ALFA GLOBINICI TRIPLICATI O QUADRUPLICATI •COSEGREGAZIONE ALFA E BETA TALASSEMIA •COSEGREGAZIONE BETA E DELTA TALASSEMIA •DELTA-BETA TALASSEMIE (BASSA HB A2 - ELEVATA HB F) •HPFH •VARIANTI BETA O ALFA GLOBINICHE •BETA TALASSEMIA DI TIPO DOMINANTE Spettro di variabilità fenotipica Talassemia Eterozigote (1 allele β coinvolto) Talassemia intermedia (1 o 2 alleli β coinvolti) Talassemia Major (2 alleli β coinvolti) DIAGNOSI INCERTA Mutazioni MILD o “SILENTI” Mutazione mild β+ nt –29 (A→G) in eterozigosi DIAGNOSI INCERTA Presenza di triplo o quadruplo gene α WM 1 2 3 4 b TRIPLICAZIONE ααα anti 3.7 Lane 1-2-3: Soggetti normali Lane 4: Soggetto portatore della triplicazione DIAGNOSI INCERTA COSEGREGAZIONE ALFA E BETA TALASSEMIA Il risultato fenotipico dipende dalle caratteristiche della β e dell’ α talassemia cosegreganti L’ampio range di espressioni fenotipiche degli alleli α costituisce un ulteriore meccanismo di variabilità WM6 1 2 3 4 b Sequenza gene beta globinico: Mutazione in eterozigosi C→T cod.39 gene beta globinico DELEZIONE -(α)3.7 [A, B, C] Lane 1: Soggetto normale Lane 2 – 3: Soggetti eterozigoti Lane 4: Soggetto omozigote DIAGNOSI INCERTA COSEGREGAZIONE DI BETA E DELTA TALASSEMIA L’effetto fenotipico piu’ evidente è la normalizzazione della quota di Hb A2. I parametri emocromocitometrici restano alterati Hb A2 Yalousa δ Codon 27 (GCC->TCC) Mutazione frameshift β° Cod.6 (−Α) DIAGNOSI INCERTA DELTA-BETA TALASSEMIE (BASSA HB A2 - ELEVATA HB F) •Delezioni di dimensioni variabili che rimuovono i geni β e δ globinici (es. δβ talassemia Sicilia). WM 1 2 3 4 5 b WM 1 2 3 4 5 b δ β TALASSEMIA Lane1, 3: Soggetti normali Lane 2, 4,5: Eterozigoti δβ° talassemia Gap-PCR: delezione Gene β: controllo DIAGNOSI INCERTA •HPFH •Cosegregazione di HPFH dovuta a singole mutazioni puntiformi nel promotore di uno del geni γ globinici (es.: –158 G γ). Polimorfismo Gγ -158 C / T http://globin.cse.psu.edu/ Welcome to the Globin Gene Server Total entries in database: 1233 Total hemoglobin variant entries: 926 Total thalassemia entries: 355 Total entries in both variant and thalassemia categories: 48 VARIANTI EMOGLOBINICHE attualmente di maggior interesse patogenetico ed epidemiologico: Hb S – Hb C – Hb E – Hb Lepore – Hb Hasharon Eterozigosi per Hb E [GAG>AAG] Cod. 26 Glu > Lys Eterozigosi per Hb S [GAG > GTG] Cod. 6 Glu > Val Identificazione Hb Lepore mediante PCR + Gel di agarosio Amplificazione specifica per Hb Lepore WM 1 2 3 4 5 Amplificazione specifica per Hb A1, normale WM 1 2 3 4 5 1 - Soggetto normale 2, 4, 5 – Soggetti eterozigoti per Hb Lepore 3 - Soggetto omozigote per Hb Lepore Sequenza geni α−globinici: Sequenza gene di fusione α2α1: 1:sequenza normale - 2: sequenza con variante emoglobinica Hb Hasharon (Asp His) 1 2 DIAGNOSI INCERTA •Eterozigosi per mutazioni che producono una catena β-globinica altamente instabile (β-talassemia con trasmissione di tipo dominante) DIAGNOSTICA MOLECOLARE EMOGLOBINOPATIE mediante sequenziamento diretto su ABI PRISM 3100 TEMPI DI ATTESA DIAGNOSTICA BETA TALASSEMIA 48 ore DIAGNOSTICA ALFA TALASSEMIA 10 giorni (Estrazione PCR Sequenziamento Refertazione) (Estrazione PCR Sequenziamento Refertazione) DETECTION RATE 99% Mutazioni Note e Mutazioni Nuove 70% Mutazioni Puntiformi o piccole delezioni Note e Nuove LABORATORIO di GENETICA MOLECOLARE GENETICA MEDICA DI FERRARA Responsabile: Dr.ssa Alessandra Ferlini Dr.ssa Anna Ravani Dr.ssa Bernardetta Dolcini Dr.ssa Anna Venturoli Dr.ssa Marina Taddei Masieri Dr.ssa Alessandra Brandi Dr.ssa Francesca Gualandi Dr.ssa Paola Rimessi Dr.ssa Cecilia Trabanelli Dr.ssa Marcella Neri Dr. Pietro Spittali Dr. Matteo Bovolenta