Transcript
Validatie van bestaande modellen voor hittebehandelde Listeria monocytogenes in kant-enklare maaltijden Sarah STROOBANTS Verhandeling ingediend tot het verkrijgen van de graad van Master in de Biomedische Wetenschappen Promotor: Prof. Dr. Ir. Frank Devlieghere Vakgroep Voedselveiligheid en voedselkwaliteit Faculteit Bio-ingenieurswetenschappen Universiteit Gent Academiejaar Validatie van bestaande modellen voor hittebehandelde Listeria monocytogenes in kant-enklare maaltijden Sarah STROOBANTS Verhandeling ingediend tot het verkrijgen van de graad van Master in de Biomedische Wetenschappen Promotor: Prof. Dr. Ir. Frank Devlieghere Vakgroep Voedselveiligheid en voedselkwaliteit Faculteit Bio-ingenieurswetenschappen Universiteit Gent Academiejaar De auteur en de promotor geven de toelating deze masterproef voor consultatie beschikbaar te stellen en delen ervan te kopiëren voor persoonlijk gebruik. Elk ander gebruik valt onder de beperkingen van het auteursrecht, in het bijzonder met betrekking tot de verplichting uitdrukkelijk de bron te vermelden bij het aanhalen van resultaten uit deze masterproef. 14 mei 2012 Sarah Stroobants Prof. Dr. Ir. Frank Devlieghere Voorwoord Ziekten veroorzaakt door voedselgerelateerde pathogene micro-organismen of virussen, zijn een belangrijk gezondheidsprobleem. Het toezien op voedselveiligheid en -kwaliteit is dan ook van uitermate belang. Het leek mij interessant om uit te zoeken hoe het productieproces nu precies in elkaar zit en hoe aan de hand van wiskundige modellen de groei van pathogene micro-organismen kan voorspeld worden. Allereerst wil ik graag mijn promotor professor dr. ir. Frank Devlieghere bedanken om mijn masterproef in zijn onderzoeksteam te laten doorgaan. Ik was meteen gemotiveerd om aan de stage te beginnen. In het laatste jaar heb ik dan ook veel bijgeleerd. Tijdens de stage in het labo van de Vakgroep Voedselveiligheid en Voedselkwaliteit kreeg ik de kans om een deel van mijn theoretische bagage in de praktijk om te zetten. Hierbij werd ik bijgestaan door een enthousiast en ervaren team van laboranten, waarvoor ik hen oprecht wil bedanken. Een speciaal woordje van dank wil ik richten aan Elien Verguldt: bij haar kon ik steeds terecht wanneer ik hulp of een tweede opinie nodig had over een praktische zaak in het labo. Mijn begeleiders ir. Jeff Daelman en dr. ir. An Vermeulen waren steeds bereid om de geschreven stukken van mijn masterproef na te lezen en te verbeteren. Waarvoor dank! Ir. Jeff Daelman heeft mij ook wegwijs gemaakt in het labo en mij enkele technieken aangeleerd. Dr. ir. An Vermeulen heeft mij begeleid bij het analyseren van de resultaten en toonde mij de werking van de verschillende modellen (softwarepakketten). Uiteraard wil ik mijn ouders bedanken voor de jarenlange steun in alle betekenissen van het woord. Ook bedankt aan mijn familie, zus en vrienden voor de nodige steun en ontspanning. Dank u wel, Sarah Inhoudstafel Inhoudstafel Lijst met afkortingen Samenvatting 1 1. Inleiding Listeria monocytogenes Eigenschappen van Listeria monocytogenes en insleep 4 in de productieomgeving Pathogeniteit en listeriosis Listeria monocytogenes in voedingsmiddelen Microbiologische criteria Verhittingsstap door de producent en consument Pasteurisatie door de producent Nabesmetting Verhittingsstap door de consument en consumentengedrag Verhittingsstap door de consument De relatie tussen consumentengedrag en voedselveiligheid Het bepalen van de groeipotentieel voor Listeria monocytogenes Predictieve microbiologie Materialen en methoden Gebruikte levensmiddelen in challenge testen Lasagne bolognaise Poisson Parmentier (Puree met visblokjes) Puree met rode kool en braadworst Bepaling van intrinsieke factoren Uitvoeren van de challenge testen volgens EU CRL for Listeria 16 monocytogenes Inoculumvoorbereiding Opkweek van stammen en bereiden van inoculum Inoculatie, bewaring en uitplating 18 2.4 Inactivatie van Listeria monocytogenes tijdens opwarming Temperatuursregistratie Modelselectie en validatie Resultaten Fysicochemische parameters Algemene microbiologische analyse Groei van L. monocytogenes tijdens bewaring Bepalen en standaardiseren van de opkweekcultuur Bepalen van groeipotentieel en verdubbelingstijd Validatie van groeimodellen Inactivatie van L. monocytogenes tijdens opwarming van REPFEDs Opwarming volgens voorschriften Bespreking Fysicochemische parameters Algemene microbiologische analyse Groei van L. monocytogenes tijdens bewaring Bepalen van groeipotentieel en verdubbelingstijd Validatie van groeimodellen Inactivatie van L. monocytogenes tijdens opwarming van REPFEDs Opwarming volgens voorschriften Validatie van inactivatiemodellen Algemeen besluit Referentielijst 43 Lijst met afkortingen AGES ALOA a w BHI EH EU CRL GfK GHP GMP HACCP IFIC kve/g L.monocytogenes L.m. LFMFP LMG MAP MRS MZB N 0 NaCl N max NVT P 0 PCA ph PPS RASFF RCA REPFEDs SSSP T Austrian Agency for Health and Food Safety Agar Listeria selon Ottaviani & Agosti Wateractiviteit Brain Heart Infusion Einde Houdbaarheid European Union Community Reference Laboratory Growth from Knowledge Goede Hygiënische Praktijken Good Manufacturing Practices Hazard Analysis and Critical Control Points International Food Information Council Kolonievormende eenheden/gram Listeria monocytogenes Listeria monocytogenes Laboratory of Food Microbiology and Food Preservation Lab of Microbiology UGent Modified Atmosphere Packaging Man Rogosa Sharpe Melkzuurbacteriën Initiële celdichtheid Zoutgehalte Maximale celdichtheid Niet Van Toepassing Pasteuristatiewaarde Plate Count Agar Zuurtegraad Peptone Physiological Solution Rapid Alert System for Food and Feed Reinforced Clostridial Agar Refrigerated Processed Foods of Extended Durability Seafood Spoilage and Safety Predictor Temperatuur t TAK TAnK TDT TSA W δ λ μ μ max Tijd Totaal Aëroob Kiemgetal Totaal Anaëroob Kiemgetal Thermale DodingsTijd Trypton Soy Agar Watt Groeipotentieel Lag Groeisnelheid Maximale groeisnelheid Samenvatting Steeds meer wordt een thuisbereide maaltijd ingeruild voor een snelle kant-en-klare maaltijd. Tegelijkertijd wordt de consument kritischer t.o.v. voedselveiligheid en kwaliteit. Voedselgerelateerde ziekten, veroorzaakt door pathogene micro-organismen of virussen, vormen een belangrijk gezondheidsprobleem. De voedselveiligheid voor Refrigerated Processed Foods of Extended Durability (REPFEDs) wordt verzekerd door een combinatie van hittebehandeling en koude bewaring. Door nabesmetting (= contaminatie na pasteuristatie) tijdens het productieproces (o.a. bij het versnijden, afvullen en verpakken van het product) kan nog Listeria monocytogenes op het product terechtkomen aangezien L. monocytogenes een omgevingsbacterie is. Indien het product gecontamineerd wordt, is de uitgroei van L. monocytogenes tijdens de bewaring in koeling (tot 0 C) mogelijk omwille van haar psychrotrofe eigenschap. Een infectie met L. monocytogenes veroorzaakt listeriosis, een zeldzame maar ernstige ziekte met een mortaliteitspercentage van 20-30%. Het zijn vooral jongeren, ouderen, zwangere vrouwen en personen met een onderdrukt immuunsysteem die tot de risicogroep behoren. In deze masterproef zal nagegaan worden wat het effect is van de hittebehandelingen door de consument (conform de etikettering op het levensmiddel) op het overleven van L. monocytogenes in kant-en-klare maaltijden en er zal geverifieerd worden of een afwijking van de huidige tolerantienorm (2 log 10 kve/g) kan onderbouwd worden indien rekening gehouden wordt met hittebehandeling door de consument. Daarvoor zal gebruik gemaakt worden van challenge testen, waarbij drie producten (met drie batchen per product) geïnoculeerd worden met een mix van L. monocytogenes en waarbij het proces van verpakken en bewaren gesimuleerd wordt. Aan de hand van staalnamen en uitplatingen gedurende de bewaring, kan de groei gevolgd worden. Op einde houdbaarheid worden de producten verhit met de magnetron en wordt de afdoding van L. monocytogenes nagegaan. De groeipotentieel is bij alle batchen groter dan 0,5 log 10 kve/g en laat dus de groei van L. monocytogenes toe in alle onderzochte producten. Bij de validatie van verschillende groeimodellen, kan gesteld worden dat Seafood Spoilage and Safety Predictor (SSSP) het meest geschikt is. De inactivatie wordt gevalideerd a.d.h.v. de P 0 -waarden aangezien er geen geschikte inactivatiemodellen voorhanden zijn. Het verband tussen afdoding en P 0 = 2 min. is correct voor alle onderzochte producten. P 0 = 2 min. daarentegen, werd niet altijd bereikt. 1 1. Inleiding Het aanbod van kant-en-klare maaltijden op de markt groeit. Steeds meer wordt een thuisbereide maaltijd ingeruild voor een snelle kant-en-klare maaltijd. Mogelijke oorzaken hiervan zijn onder meer socio-economische evoluties: hoge werkdruk, tijdsgebrek, een grotere participatie van de vrouw in het werkveld, [1] Tegelijkertijd wordt de consument ook steeds kritischer t.o.v. voedselveiligheid en kwaliteit en wordt verwacht dat de maaltijd voldoende nutriënten bevat en veilig is voor consumptie [2,3]. Ziekten veroorzaakt door voedselgerelateerde pathogene micro-organismen of virussen, zijn een belangrijk gezondheidsprobleem. Het toezien op voedselveiligheid en -kwaliteit is dan ook van uitermate belang. Het Rapid Alert System for Food and Feed (RASFF van de EU) wordt gestuurd door de Europese commissie en rapporteert voortdurend recalls en incidenten, gerelateerd aan voedselveiligheid. Wanneer een lidstaat informatie heeft over een voedselgerelateerde ziekte met een ernstig gezondheidsrisico of bij een recall, moet dit gemeld worden aan de RASFF. Het rapport van 2010 toont aan dat Salmonella het meest frequent gerapporteerde pathogene micro-organisme is (345 meldingen in 2010). Daarnaast zijn Listeria monocytogenes (100-tal) en Escherichia coli (50-tal) de meest belangrijke, zoals weergegeven in Figuur 1. Uit deze figuur kan ook worden afgeleid dat, naast vis en vlees, ook bereide maaltijden en snacks gecontamineerd kunnen zijn met L. monocytogenes [4]. Slechts een deel van de gerapporteerde incidenten en recalls werden opgenomen in wetenschappelijke publicaties. Zo werd in 2007 L. monocytogenes aangetroffen in een bereide maaltijd in Frankrijk, bestaande uit kaas en zalm [5]. Ook in Frankrijk was in 2010 L. monocytogenes aanwezig in een zuurkool-maaltijd [6]. De Public Health Agency of Canada and the Canadian Food Inspection Agency kreeg in 2008 een melding van een uitbraak van listeriosis, gelinkt aan een vleesproduct [7]. Ook in 2008 meldt de Austrian Agency for Health and Food Safety (AGES) een uitbraak van diarree, waarbij de stam afkomstig was van kopvlees bestaande uit varkensvlees [8]. Het jaarlijks rapport van RASFF (2010) signaleert twee belangrijke uitbraken: in Oostenrijk werden 24 personen getroffen met listeriosis door het consumeren van kwark. In Tsjechië werden twee personen ziek doordat vleesworst besmet was met meer dan 3 log 10 kve/g L. monocytogenes [4]. 2 Bovendien zijn reeds lethale uitbraken van listeriosis gerelateerd aan de aanwezigheid ervan in voedingsmiddelen [9]. Een zeer recente uitbraak (september 2011) in de VS in cantaloupemeloenen zorgde voor een dodental van 14 personen [10]. Figuur 1: Pathogene micro-organismen in voedingsmiddelen, gerapporteerd aan RASPF (jaarlijks rapport 2010) [4]. De voedselveiligheid voor Refrigerated Processed Foods of Extended Durability (REPFEDs) wordt verzekerd door een combinatie van hittebehandeling en koude bewaring. Door nabesmetting (= contaminatie na pasteurisatie) tijdens het productieproces (o.a. bij het versnijden, afvullen en verpakken van het product) kan nog L. monocytogenes op het product terechtkomen. Indien het product gecontamineerd wordt, is de uitgroei van L. monocytogenes tijdens de bewaring in koeling mogelijk. In deze masterproef zal nagegaan worden wat het effect is van de hittebehandelingen door de consument (conform de etikettering op het levensmiddel) op het overleven van L. monocytogenes in kant-en-klare maaltijden en er zal geverifieerd worden of een afwijking van de huidige tolerantienorm (2 log 10 kve/g) kan 3 onderbouwd worden indien rekening gehouden wordt met hittebehandeling door de consument (zie 1.1.4). Dit zal onder meer gebeuren a.d.h.v. de validatie van verscheidene groei- en inactivatiemodellen die in de literatuur beschikbaar zijn en het gedrag van L. monocytogenes voorspellen (zie 2.5). In geen enkele van deze modellen wordt echter rekening gehouden met de combinatie van groei en inactivatie. De meeste wetenschappelijke studies beschrijven immers het gedrag van L. monocytogenes in kant-en-klare maaltijden die geen verhittingsstap bij de consument vereisen, bv. gerookte zalm (Vermeulen et al. (2010) [11]) of mayonaisegebaseerde salades (Vermeulen et al. (2007) [12]). Anderzijds werd in een studie over frankfurters van Huang et al. [13] enkel een verhitting uitgevoerd, dit onmiddellijk na inoculatie met L. monocytogenes en zonder bewaring tussen beide stappen. De groei en inactivatie die worden voorspeld door de beschikbare predictieve modellen, moeten echter gevalideerd worden in levensmiddelen aangezien deze vaak ontwikkeld worden op basis van metingen uitgevoerd in homogene laboratoriamedia, waarbij groeifactoren optimaal zijn [14,15]. Tevens moet ook rekening gehouden worden met de achtergrondflora, die de uitgroei van L. monocytogenes ook sterk zou beïnvloeden. Bij het Jameson effect [16] wordt een verlaging van N max (maximale concentratie) vastgesteld van bacteriële populaties door een dominante stam. Zo werd aangetoond dat de concentratie L. monocytogenes afneemt door een groei van achtergrondflora zoals melkzuurbacteriën [17]. Verder kan het micro-organisme zich aanpassen aan de omgeving: bv. ph en temperatuursadaptatie. In deze masterproef zullen verschillende groeimodellen (bv. Combase [18]), en inactivatiemodellen (bv. het model van Fernandez et al.(2007) [19]) voor L. monocytogenes gevalideerd worden op hun toepasbaarheid in kant-en-klare levensmiddelen. 1.1 Listeria monocytogenes Eigenschappen van Listeria monocytogenes en insleep in de productieomgeving L. monocytogenes is een niet-sporenvormende Gram-positieve, facultatief anaërobe omgevingsbacterie, die pathogeen is voor mens en dier [20]. Het is een psychrotrofe bacterie die kan overleven en uitgroeien bij lage temperaturen (tot 0 C). Ze komt voornamelijk voor in vuil, grond, water, feces, maar ook in onbehandelde plantaardige en dierlijke grondstoffen. Deze bacterie kan op verschillende wijzen een productieomgeving binnenkomen: via grond 4 onder schoenen, kleding, transportmiddelen, dieren en mensen die drager zijn, machines etc. [20]. Eenmaal in de productieomgeving, blijven ze als omgevingsbacterie aanwezig. De L. monocytogenes cellen hechten zich vast aan werkoppervlakken, transportbuizen of afvoerbuizen en kunnen vervolgens aggregeren. Vooral in koele, vochtige omgevingen vermenigvuldigen ze zich snel. Dit zijn ideale omstandigheden voor biofilmvorming. Een biofilm is een driedimensionale structuur van micro-organismen, omgeven door een organische polymere matrix. Eens tot stand gekomen, vormt deze een hoge resistentie tegen desinfectantia [21]. De groeiparameters van L. monocytogenes worden weergegeven in Tabel 1. Tabel 1: Groeiparameters van Listeria monocytogenes [19,22] Minimum Optimum Maximum Temperatuur (T) 0 C 37 C 45 C ph 4,3 7 9,4 Wateractiviteit (a w ) 0, NaCl (%) Pathogeniteit en listeriosis Een infectie met L. monocytogenes veroorzaakt listeriosis, met meningo-encephalitis, sepsis en meningitis als de voornaamste klinische manifestaties [23]. Het is een zeldzame maar ernstige ziekte met een mortaliteitspercentage van 20-30% [21]. Tot de risicogroepen behoren jongeren, ouderen, zwangere vrouwen en personen met een onderdrukt immuunsysteem (bv. AIDS en kankerpatiënten) [24]. Listeriosis gedurende de zwangerschap kan aanleiding geven tot een miskraam, premature geboorte, neonatale infectie of neonatale dood [25] Listeria monocytogenes in voedingsmiddelen Verschillende soorten levensmiddelen kunnen gecontamineerd zijn met L. monocytogenes: (i) rauwe levensmiddelen, (ii) verwerkte, niet-verhitte levensmiddelen en (iii) verhitte producten onderhevig aan post-contaminatie. Niet-gepasteuriseerde zachte kaas (bv: Camembert) is een voorbeeld van verwerkte producten die geen verhittingsstap hebben ondergaan. Deze kant-en-klare levensmiddelen, die langere tijd in de koeling worden bewaard, zijn risico-producten omwille van de psychrotrofe eigenschap van de bacterie [26]. De pathogene bacterie kan ook aangetroffen worden in verwerkte producten die wel een verhittingsstap hebben ondergaan, maar welke onderhevig zijn aan nabesmetting tijdens bijvoorbeeld het verpakken (aangezien L. monocytogenes een omgevingsbacterie is). 5 Deze groepen van levensmiddelen werden dan ook specifiek in de wetgeving opgenomen (zie 1.1.4). Alle producten die een volledige maaltijd vormen en klaar zijn voor consumptie of door de consument met een eenvoudige behandeling (meestal een verhittingsstap) geschikt kunnen worden gemaakt voor consumptie, vallen onder de koepel kant-en-klare maaltijden of REPFEDs [27]. Meestal gaat het om een samengesteld product van verschillende maaltijdcomponenten (vb. vlees, puree en groenten), gemengd of in afzonderlijke eenheden verpakt (meervaksverpakking of gescheiden verpakkingscompartimenten). Deze REPFEDs worden ook wel cooked chilled foods genoemd. Voedselveiligheid wordt verzekerd door een milde hittebehandeling in combinatie met een gekoelde bewaring. Vaak worden ook andere conserveringsfactoren zoals een gemodificeerde atmosfeer verpakking (MAP) gebruikt om microbiële veiligheid en kwaliteit te waarborgen. Bij MAP wordt de lucht uit de verpakking gezogen en vervangen door het gewenste mengsel van N 2, CO 2 en O 2. De indeling van de verschillende REPFEDs gebeurt op basis van het al dan niet vereist zijn van een verhittingsstap door de consument en het al dan niet bereiken van P 0 =2 min. (P 0 = pasteurisatiewaarde). Bij een P 0 =2 min. wordt gedurende 2 minuten op 70 C verwarmd (of evenwaardig), wat een 6 log reductie geeft van L. monocytogenes [28, 29] (zie 1.2.1). In Figuur 2 wordt een overzicht gegeven van de verschillende soorten REPFEDs. De opsplitsing tussen ready-to-reheat en ready-to-heat maaltijden wordt gemaakt op basis van de pasteurisatiewaarde. Wanneer P 0 2 min., spreken we van een ready-to-reheat maaltijd; bij een ready-to-heat maaltijd is P 0 2 min. Deze indeling wordt dus bepaald door de verhittingsprocedure die vereist is voor het product (weergegeven op het etiket). 6 Ready-to-eat onmiddellijke consumptie zonder een verhittingsstap door de consument gerookte zalm, sandwiches en pastasalades REPFEDs Ready-toreheat consumptie na verhittingsstap door de consument P 0 2 min lasagne, drievaksmaaltijden Ready-toheat consumptie na verhittingsstap door de consument P 0 2 min pizza (bewaard in de koeling) Figuur 2: Indeling van de REPFEDs Naast de REPFEDs, bestaan ook ready-to-cook levensmiddelen. Hierbij worden geen tijdtemperatuurcombinaties toegepast bij de producent en wordt opwarming door de consument noodzakelijk geacht om het product te bereiden en om micro-organismen te elimineren of te reduceren tot een aanvaardbaar niveau. Voorbeelden zijn diepvriespizza en loempia [26, 30] Microbiologische criteria Een microbiologisch criterium wordt in de EU verordening nr. 2073/2005 [31] als volgt gedefinieerd: een criterium ter bepaling van de aanvaardbaarheid van een product, een partij levensmiddelen of een proces, dat berust op de af- of aanwezigheid van micro-organismen of het aantal daarvan, en/of de hoeveelheid toxinen/metabolieten ervan, per eenheid van massa, volume of oppervlakte dan wel per partij. Eén van de belangrijkste punten is het volgende: Levensmiddelen mogen geen micro-organismen of toxinen of metabolieten daarvan bevatten in dusdanige hoeveelheden dat er een onaanvaardbaar risico voor de menselijke gezo
