ćwiczenie 11

Transcript

Ćwiczenie 5 T: Zasady doboru testów laboratoryjnych w diagnozowaniu i monitorowaniu cukrzycy Zagadnienia teoretyczne: Profil badań stosowanych w diagnostyce w cukrzycy: glikemia na czczo > 125 mg/dl , glikemia przygodna > 200 mg/dl, glikemia w 120 min DTTG > 200 mg/dl. Profil badań stosowanych w monitorowaniu leczenia cukrzycy - dobowy profil glikemii, hemoglobina HbA1c, fruktozamina (retrospektywna ocena poziomu glikemii), ciała ketonowe (ważne w monitorowaniu cukrzycowej cukrzycy typu 1). Profil badań stosowanych w różnicowaniu śpiączki (nieketonowa śpiączka hipermolarna, śpiączka ketonowa, śpiaczka mleczanowa, hipoglikemia) - poziom glikemii na czczo, glukoza w moczu (glukozuria), ciała ketonowe w surowicy (ketonemia) i w moczu (ketonuria), badanie gazometryczne (pH, HCO3-, luka anionowa), jonogram (Na, K), mleczany. Ćwiczenie praktyczne: Oznaczanie glukozy (krzywa cukrowa). Oznaczanie HbA1c. Oznaczanie transportu cewkowego glukozy. A. Oznaczanie stężenia glukozy w surowicy krwi metodą enzymatyczną Aparatura i sprzęt laboratoryjny:  spektrofotometr, probówki Eppendorf, pipety automatyczne Materiał badany i odczynniki:  surowica badana  wzorzec glukozy – 100 mg/dL  odczynnik roboczy do oznaczania stężenia glukozy (zestaw BioMaxima) Wykonanie:  opisać probówki, odmierzyć dokładnie odpowiednie objętości roztworów – jak podano w poniższej tabeli: Odczynnik Próba Próba Próba badana wzorcowa zerowa 1000 L 1000 L 1000 L 10 L - - - 10 L - roboczy Surowica badana Wzorzec Dokładnie wymieszać. Po 10 minutach odczytać absorbancję próby 1 badanej (AB) i wzorcowej (AW) (=500 nm) wobec próby zerowej. UWAGA! Oznaczenie wykonujemy jednocześnie we wszystkich próbach badanych => surowicach otrzymanych z krwi pobranej na czczo, po 1 i 2 godzinach od obciążenia glukozą. Obliczenia:  obliczyć stężenie glukozy ze wzoru:  stężenie glukozy [mg/dL] = ∙ stężenie wzorca W B. Oznaczanie HbA1c Aparatura i sprzęt laboratoryjny:  spektrofotometr, probówki Eppendorf, pipety automatyczne, mieszadło Materiał badany i odczynniki:  surowica badana  wzorzec hemoglobiny glikowanej  odczynnik A z żywicą  odczynnik B lizujący (zestaw BioMaxima) Wykonanie: A. Przygotowanie hemolizatu  opisać probówki – wzorzec, kontrola, badana i odmierzyć do każdej 500 L odczynnik lizującego (odczynnik B)  dodać 100 L dobrze wymieszanej próbki krwi, wzorca lub kontroli do odpowiednich probówek, wymieszać  pozostawić na 5 min. B. Izolowanie hemoglobiny glikowanej  dodać 70 L hemolizatu do probówki z żywicą (odczynnik A)  umieścić separatory z filtrem w probówkach tak, aby gumowy mankiet był na wysokości ok. 1 cm ponad poziomem płynu  mieszać bez przerwy 5 min. na mieszadle  wpychać separator z filtrem do probówki do momentu aż żywica będzie ściśle upakowana  przelać supernatant do nowej probówki 2  odczytać absorbancję próby badanej i wzorcowej i kontrolnej (= 415 nm) wobec wody dejonizowanej jako próby ślepej Te odczyty dotyczą hemoglobiny glikowanej C. Frakcja hemoglobiny całkowitej  odmierzyć 5,0 ml wody dejonizowanej do probówek (W, K, B)  dodać 20 L hemolizatu (z etapu A3), wzorca i kontroli do odpowiednich probówek  odczytać absorbancję próby badanej i wzorcowej i kontrolnej (= 415 nm) wobec wody dejonizowanej jako próby ślepej Te odczyty dotyczą hemoglobiny całkowitej Obliczenia: RB % Hb glik. (Pr. badanej) = x CW RW A Hb glik. (badanej) RB = A Hb całk. (badanej) A Hb glik. (wzorca) RW = A Hb całk. (wzorca) A. Oznaczanie transportu cewkowego glukozy Aparatura i sprzęt laboratoryjny:  spektrofotometr, probówki Eppendorf, pipety automatyczne, minutnik Materiał badany i odczynniki:  surowica  mocz z dobowej zbiórki (DZM)  wzorzec glukozy (100 mg/dL)  odczynnik roboczy (BioMaxima) Wykonanie: 3  opisać probówki, odmierzyć dokładnie odpowiednie objętości roztworów – jak podano w poniższej tabeli: Próba badana Próba badana Próba Próba - surowica - mocz wzorcowa zerowa 10 L - - - Mocz - 10 L - - Wzorzec glukozy - - 10 L - 1000 L 1000 L 1000 L 1000 L Surowica badana Odczynnik roboczy Zawartość probówek wymieszać i inkubować 10 minut w temperaturze pokojowej Zmierzyć absorbancję prób badanych i próby wzorcowej wobec próby zerowej ( = 500 nm) Obliczenia:  obliczyć stężenie glukozy w surowicy i moczu Apróby badanej ∙ Cwzorca [mg/dL] PG / UG= Awzorca PG / UG – stężenie glukozy w surowicy / moczu [mg/dL] Cwzorca – stężenie wzorca (100 mg/dL) Apróby badanej - absorbancja próby badanej (surowicy/moczu) Awzorca – absorbancja wzorca  obliczyć wartość transportu maksymalnego glukozy (TmG) TmG = PG ∙ CLkr - UG ∙ V PG – stężenie glukozy w surowicy [mg/mL] UG – stężenie glukozy w moczu [mg/mL] CLkr – klirens kreatyniny [mL/min] V – objętość minutowa moczu [mL/min] = DZM/1440 min 4