Transcript
Tomasz Grzybowski 1 , Boris A. Malyarchuk 2 , Jarosław Bednarek 1 , Marcin Woźniak 1 ,Marta Papuga 1 , Katarzyna Stopińska 1 , Sylwia Łuczak 1 Zastosowanie analizy filogeograficznej w interpretacji wynikówsekwencjonowania mitochondrialnego DNA dla celów sądowych Phylogeographic approach in the interpretation of mitochondrial DNAsequencing results in forensics 1 Z Zakładu Genetyki Molekularnej i Sądowej Katedry Medycyny Sądowej Collegium Medicum im. LudwikaRydygiera w Bydgoszczy Uniwersytetu Mikołaja Kopernika w ToruniuKierownik: prof. dr hab. Karol Śliwka 2 Z Laboratorium Genetyki Instytutu Biologicznych Problemów Północy Rosyjskiej Akademii Nauk, Magadan,Rosja W ostatnim czasie badaniom sekwencji mitochondrial-nego DNA dla celów sądowych towarzyszy wyraźna per-spektywa ewolucyjna. Szczególnie przydatne w interpre-tacji wyników sekwencjonowania mtDNA w sprawachidentyfikacyjnych okazuje się podejście filogeograficzne,które obejmuje filogenetyczną analizę przestrzennegorozkładu haplotypów i haplogrup w populacjach. W ra-mach niniejszej pracy wykazano przydatność podejściafilogeograficznego w interpretacji trudniejszych przypad-ków identyfikacyjnych, w których obserwowano jedno-nukleotydowe, homoplazmatyczne różnice sekwencjimtDNA pomiędzy haplotypami dowodowymi i porównaw-czymi. Dodatkowo, w celu ustalenia przynależności ha-plogrupowej wybranych haplotypów przeprowadzonoanalizę pełnych sekwencji dwóch genomów mitochon-drialnych należących do podkladu J1b.In recent years, forensic mitochondrial DNA analysis has beenundertaken from an evolutionary perspective. In particular,the phylogeographic approach based on a phylogeneticanalysis of the spatial distribution of mitochondrial haplotypesand haplogroups appears to be a useful tool in theinterpretation of identification cases. In this study, thephylogeographic approach has been employed in theanalysis of three difficult forensic cases, where singlenucleotide, homoplasmic differences were found betweenthe reference and evidentiary haplotypes. mtDNA sequencevariation has been examined by the control region (HVS Iand HVS II) direct sequencing. Additionally, in order to clarifythe subhaplogroup status of the selected haplotypes, DNAsequences of entire mitochondrial genomes obtained fromtwo samples representing J1b subclade have been analyzed. WSTĘP Choć analiza sekwencji mitochondrialnego DNA(mtDNA) stała się jedną z dobrze ugruntowanychtechnologii badania polimorfizmu DNA dla potrzebwymiaru sprawiedliwości [1], niektóre zagadnieniadotyczące interpretacji wyników sekwencjonowaniamtDNA dla celów sądowych wciąż są przedmiotemożywionych dyskusji. Do zagadnień tych należąm.in. wielkość, zasięg geograficzny oraz jakośćpopulacyjnych baz danych mtDNA wykorzystywa-nych dla oceny częstości haplotypów, zróżnicowa-ne tempo mutacji dla różnych pozycji sekwencjiregionu kontrolnego i związane z nim różne kryte-ria statystycznej oceny wyników potwierdzającychlub wykluczających pochodzenie badanych próbekz tej samej linii matczynej, czy też ograniczona war-tość dowodowa analizy sekwencji regionu kontrol-nego, a stąd konieczność włączenia do badań wy-branych wariantów regionu kodującego [2, 3, 4].W ostatnim czasie analizom sekwencji mtDNA dlacelów sądowych towarzyszy wyraźna perspektywaewolucyjna [2]. W szczególności, dzięki podejściufilogeograficznemu, które obejmuje analizę prze- ARCH. MED. SĄD. KRYM., 2006, LVI, 191-197 PRACE ORYGINALNE 192 Nr 3 strzennego, geograficznego rozkładu haplotypóww drzewie filogenetycznym mtDNA, podjęto próbyidentyfikacji regionu geograficznego, z którego po-chodzą badane haplotypy mtDNA oraz a posteriori dokonano kontroli jakości danych zdeponowanychw niektórych sądowych populacyjnych bazach profilimtDNA [2 oraz zawarte tam pozycje piśmiennictwa].Ponieważ rozdzielczość analiz filogenetycznychosiągnęła w ostatnim czasie maksymalny poziomdzięki badaniom populacyjnym wykorzystującymsekwencjonowanie pełnych genomów mitochon-drialnych [5 oraz zawarte tam pozycje piśmiennic-twa], znacznie łatwiejsze niż dotychczas stały sięposzukiwania dodatkowych markerów regionu ko-dującego, które mogą zwiększyć informatywnośćanaliz mtDNA dla celów sądowych. Ponadto, szcze-gółowa znajomość filogenezy mtDNA pozwala nabardziej wiarygodną ocenę częstości haplotypówregionu kontrolnego w populacjach zamieszkują-cych różne regiony geograficzne.Dane przedstawione w niniejszej pracy ilustrująużyteczność podejścia filogeograficznego w inter-pretacji trudniejszych przypadków identyfikacyjnychpochodzących z praktyki Zakładu Genetyki Mole-kularnej i Sądowej, w których zachodziła koniecz-ność analizy mtDNA. W przypadkach tych zanoto-wano jednonukleotydowe, homoplazmatyczne róż-nice pomiędzy haplotypami uzyskanymi dla próbekdowodowych i porównawczych. Interpretacji wyni-ków dokonano z wykorzystaniem własnych bazdanych regionu kontrolnego mtDNA szczegółowoscharakteryzowanych pod względem filogeograficz-nym. Dodatkowo, dla uaktualnienia filogenezy pod-haplogrupy J1b, z której pochodziły haplotypy uzy-skane w jednym z analizowanych przypadków orazdla uprawdopodobnienia interpretacji, przeprowa-dzono analizę sekwencji pełnych genomów mito-chondrialnych. MATERIAŁ I METODY Badany materiał biologiczny pochodził z trzechspośród około 225 przypadków, w których ZakładGenetyki Molekularnej i Sądowej w latach 1999--2006 wydał ekspertyzy na podstawie badań se-kwencji mtDNA. Przypadek 1 W sprawie identyfikacyjnej z terenu Małopolskizabezpieczono pięć włosów dowodowych pozbawio-nych cebulek włosowych (oznaczone numerami1-5). Materiałem porównawczym były włosy zabez-pieczone z odciętej głowy odnalezionej w niedale-kiej odległości od miejsca, w którym zabezpieczo-no włosy dowodowe. W wyniku wstępnej analizymorfologiczno – porównawczej przeprowadzonejz wykorzystaniem komputerowego systemu anali-zy obrazu stwierdzono, że włosy dowodowe mająswe odpowiedniki morfologiczne wśród włosów po-równawczych. Do badań mtDNA zakwalifikowanowszystkie włosy dowodowe oraz trzy włosy porów-nawcze (oznaczone jako P1-P3). Przypadek 2 W sprawie zabójstwa mężczyzny dokonanegona terenie Pomorza i Kujaw zabezpieczono czterywłosy dowodowe pozbawione cebulek włosowych,ujawnione na ubraniu ofiary (oznaczone numerami1-4). Materiałem porównawczym do badań identy-fikacyjnych była krew zabezpieczona podczas sek-cji zwłok denata (oznaczona jako SER_2). Przypadek 3 W sprawie identyfikacji zwłok nieznanego męż-czyzny, który zginął podczas pożaru na terenie Po-morza i Kujaw, zabezpieczono materiał w postacikrwi denata (oznaczony jako NN). Materiałem po-równawczym do badań identyfikacyjnych była krewuzyskana od matki osoby zaginionej (oznaczona jako SER_3). MOLEKULARNE ANALIZY mtDNA Wszystkie próbki materiału biologicznego pod-dano badaniom regionu kontrolnego mtDNA zgod-nie z procedurą opisaną we wcześniejszej pracy [6].Uzyskane sekwencje mtDNA, obejmujące fragmentregionu kontrolnego pomiędzy nukleotydem 15999a 16400 dla HVS I oraz 30-407 dla HVS II porówny-wano z sekwencją wzorcową CRS [7]. Analizie se-kwencji pełnych genomów mitochondrialnych pod-dano próbki pochodzące z przypadku 3 (NN orazSER_3). Pełne genomy amplifikowano metodą PCRw jedenastu nakładających się fragmentach, a na-stępnie sekwencjonowano za pomocą 32 opisanychpoprzednio wewnętrznych starterów, w warunkachpodanych we wcześniejszej pracy [6]. Uzyskanesekwencje mtDNA porównywano z poprawionąsekwencją wzorcową rCRS [8]. FILOGENETYCZNE I STATYSTYCZNE ANALIZY mtDNA Drzewo filogenetyczne pełnych genomów mito-chondrialnych zrekonstruowano manualnie meto-dą największej oszczędności i ukorzeniono za po-mocą sekwencji rCRS [8] jako grupy zewnętrznej, Tomasz Grzybowski, Boris A. Malyarchuk, Jarosław Bednarek, Marcin Woźniak Nr 3 193 a następnie sprawdzono z wykorzystaniem opro-gramowania Network v. 4.1.1.1 (A. Röhl; © FluxusTechnology; www.fluxus-engineering.com). W re-konstrukcji drzewa wykorzystano sekwencję pełne-go genomu mitochondrialnego należącego do pod-haplogrupy J1b, opublikowanego przez Palanicha-my i wsp. [9].Interpretację statystyczną wyników analizy mtD-NA dla celów sądowych przedstawiano za pomocąilorazu prawdopodobieństw warunkowych (LR) =P (E/H1) / P (E/H2), gdzie P (E/H1) oznacza praw-dopodobieństwo uzyskania wyniku przy założeniu,że materiał dowodowy pochodzi z linii matczynejreprezentowanej przez próbkę referencyjną, zaśP (E/H2) jest prawdopodobieństwem uzyskania wy-niku przy założeniu, że próbka dowodowa pocho-dzi z innej linii matczynej. W przypadku pełnej zgod-ności sekwencji pomiędzy próbką dowodową i po-równawczą, P (E/H1) = 1. W przypadku zaistnienia jednonukleotydowej różnicy pomiędzy sekwencjąpróbki dowodowej i porównawczej, P (E/H1) mapostać iloczynu częstości mutacji w pozycji sekwen-cji różniącej oba haplotypy oraz tempa mutacjiw regionie kontrolnym w czasie jednego pokole-nia. Z uwagi na znaczną wewnątrzosobniczą nie-stabilność szlaków polipirymidynowych regionówHVS I i HVS II oraz związaną z tym ograniczonąwartość identyfikacyjną mutacji w tych regionach,w analizach statystycznych pomijano polimorfizmydługości notowane w pozycjach 16180-16193 oraz303-315. Częstość substytucji w pozycjach 16357,16129 oraz 16319 obliczano na podstawie ilorazuliczby mutacji obserwowanych w tych pozycjachw bazie danych i całkowitej liczby mutacji w tej sa-mej bazie (7800). W obliczeniach wykorzystanowłasną bazę danych haplotypów HVS I i HVS II(n=1465) z obszaru zachodniej Eurazji (z populacjipolskiej, rosyjskiej, bośniackiej i słoweńskiej) [6, 10,11]. Wszystkie haplotypy umieszczone w bazie za-liczono do odpowiednich haplogrup i podhaplogrupmtDNA na podstawie syntetycznego systemu kla-syfikacji, uwzględniającego dotychczasowe daneuzyskane metodą PCR-RFLP oraz informacje po-chodzące z sekwencjonowania regionów HVS Ii HVS II. Uśrednione tempo mutacji w regionie kon-trolnym rzędu 0.0043 w czasie jednego pokolenia(lub 0.32 na pozycję sekwencji w czasie miliona lat)przyjęto za Sigur ð ardóttir i wsp. [12]. P (E/H2) obli-czano na podstawie liczby obserwacji haplotypuw bazie danych (w przypadku jednonukleotydowejróżnicy pomiędzy próbką dowodową i porównaw-czą była to suma liczby obserwacji haplotypu dowo-dowego oraz haplotypu różniącego się od dowodo-wego jedną mutacją). W sytuacji braku haplotypuw bazie danych, w obliczeniach wykorzystywanoczęstość „najmniejszej” (najmłodszej ewolucyjnie,czyli znajdującej się na obrzeżach drzewa filogene-tycznego) podhaplogrupy, do której można było za-liczyć uzyskany haplotyp, zgodnie z sugestią For-stera i wsp. [13]. W obliczeniach częstości rzad-kich haplotypów na podstawie przeszukiwania bazydanych stosowano przedział ufności 95 %, z wyko-rzystaniem logarytmu naturalnego częstości, przy-bliżenia normalnego do rozkładu dwumianowegooraz antylogarytmu [1, 14]. Dla zachowania ostroż-ności, w obliczeniach LR wykorzystywano maksy-malne częstości haplotypów (z górnej granicy prze-działu ufności). WYNIKI I OMÓWIENIE Haplotypy regionu kontrolnego mtDNA uzyska-ne dla próbek materiału dowodowego i porównaw-czego oraz ich przynależność haplogrupową przed-stawiono w tabeli I.Z przedstawionych danych wynika, że pomię-dzy sekwencjami mtDNA uzyskanymi z włosa do-wodowego oznaczonego numerem 4, a sekwencjąotrzymaną dla włosów porównawczych analizowa-nych w Przypadku 1 wystąpiły różnice w postacidodatkowej tranzycji T16357C oraz insercji 309.1C.Pozostałe haplotypy uzyskane dla włosów dowo-dowych wykazywały pełną zgodność wobec haplo-typu porównawczego (tabela I). Uzyskane haploty-py należą do podhaplogrupy J1c zdefiniowanejpoprzez tranzycje w pozycjach 228 i 14798 [9], naj-częstszego podkladu w obrębie haplogrupy J w po-pulacjach słowiańskich oraz w innych populacjacheuropejskich [6]. Haplotypów należących do J1cz tranzycjami w pozycjach 16086 i 16357 nie zano-towano jednak do tej pory w bazie danych [6, 10,11]. Na podstawie znajomości topologii drzewa fi-logenetycznego haplogrupy J1 [6] można stwier-dzić, że najmniejsza podgrupa w obrębie J1c, doktórej można zaliczyć haplotypy uzyskane w oma-wianym przypadku obejmuje sekwencje z motywemregionu kontrolnego 16069-16126-16261-185-228--295, a jej częstość w bazie danych wynosi 3/1465,czyli 2.055 x 10 -3 (wartość będąca górną granicąprzedziału ufności). Wartość LR dla obserwacji peł-nej zgodności pomiędzy haplotypami dowodowymii porównawczymi w przypadku pierwszym wynosi486. Dla obserwacji jednonukleotydowej różnicypomiędzy haplotypem uzyskanym z włosa numer4 a haplotypem porównawczym (tabela I), dokona-no oceny częstości substytucji T16357C z wyko-rzystaniem spektrum mutacji regionu kontrolnegoobserwowanego w bazie danych. Zanotowano tu-taj dwa przypadki substytucji w pozycji 16357 – na ANALIZA FILOGEOGRAFICZNA 194 Nr 3 tle haplogrup R* oraz U5a [10, 11]. Warto jednakzwrócić uwagę, że pozycja 16357 uważana jest za„gorące miejsce” mutacji w regionie kontrolnymmtDNA, co uzyskało potwierdzenie w co najmniejdwóch niezależnych analizach filogenetycznych [15,16]. Oznacza to, że substytucja T16357C może byćobserwowana na tle różnych haplogrup [16]. Praw-dopodobieństwo pojawienia się mutacji w pozycji16357 wynosi zatem 2/7800, czyli 2.5 x 10 -4 . Przyj-mując uśrednione tempo mutacji w czasie jednegopokolenia rzędu 0.0043, P (E/H1) dla obserwacjiróżnicy jednonukleotydowej pomiędzy próbką do-wodową i porównawczą wynosi 1 x 10 -6 , a wartośćLR w omawianym przypadku równa jest tylko 4.9 x10 -4 . Innymi słowy, przy zaistnieniu różnicy jedno-nukleotydowej w pozycji 16357, pochodzenie próbkidowodowej z innej linii matczynej niż próbka po-równawcza jest ok. 2040 razy bardziej prawdopo-dobne niż pochodzenie tych próbek z tej samej li-nii.Zakładając, że mutacja T16304C ma charaktermonofiletyczny w obrębie haplogrupy H [6] możnauznać, że haplotypy obserwowane w Przypadku2 należą do podkladu H5, zdefiniowanego poprzeztranzycje w pozycjach 456 i 16304 [17]. H-16304 jest drugim co do częstości motywem wśród haplo-typów HVS I należących do haplogrupy H w Euro-pie (ok. 4 %), choć występuje również na BliskimWschodzie, z częstościami rzędu 1-3 % [18]. W ba-zie danych odnaleziono jednak tylko jeden haplo-typ z motywem H-16129-16304 (częstość profiluw bazie 6.8 x 10 -4 ). Mimo to pozycja 16129 uważa-na jest za jedno z „najszybszych” miejsc w regioniekontrolnym [15, 16, 19]. Przykładowo, w wynikupopulacyjnych badań mtDNA Polaków i Rosjanstwierdzono równoległe występowanie tranzycjiG16129A w haplotypach należących do haplogrupH, U5, T*, T1, I, W oraz M* [10]. Na podstawie licz-by obserwacji tej mutacji w bazie danych (22/7800)określono częstość substytucji w pozycji 16129 na2.82 x 10 -3 . Wartości LR dla obserwacji pełnej zgod-ności (próbki oznaczone jako 1 i 2, tabela I) oraz jednonukleotydowej różnicy (próbki oznaczonenumerami 3 i 4, tabela I) pomiędzy haplotypamidowodowym i porównawczym wynoszą odpowied-nio 1470 oraz 1.047 x 10 -4 , a zatem w tym drugimprzypadku dowód genetyczny wskazuje aż na ok.9551-krotnie większe prawdopodobieństwo pocho-dzenia haplotypów z różnych linii matczynych.W wyniku sekwencjonowania regionów HVS Ii HVS II dwóch próbek badanych w ramach Przy-padku 3 stwierdzono, że uzyskane haplotypy, z mo-tywem 16069-16126-16145-16222-16261-271 nale-żą najprawdopodobniej do niezwykle rzadkiego Tabela I. Haplotypy regionu kontrolnego mtDNA (HVS I i HVS II) oraz ich przynależność haplogrupowa w materialedowodowym i porównawczym. Mutacje identyfikowano względem sekwencji wzorcowej CRS [7]. Brak zasady przyodpowiedniej pozycji sekwencji oznacza tranzycję. Insercje reszt cytozyny oznaczono przyrostkami „.1C”.Table I. mtDNA control region haplotypes and their subhaplogroup assignment in the evidentiary and referencesamples. Mutations are shown indicating positions relative to the mtDNA Cambridge reference sequence (CRS) [7].The nucleotide positions correspond to transitions; insertions of cytosines are referred to by “.1C” following thenucleotide position. PrzypadekNazwa próbkiPodhaplogrupa Sekwencja regionu kontrolnego mtDNAHVS IHVS II11J1c16069 16086 16126 1626173 185 228 263 295 315.1C216069 16086 16126 1626173 185 228 263 295 315.1C316069 16086 16126 1626173 185 228 263 295 315.1C416069 16086 16126 16261 1635773 185 228 263 295 309.1C 315.1C516069 16086 16126 1626173 185 228 263 295 315.1CP116069 16086 16126 1626173 185 228 263 295 315.1CP216069 16086 16126 1626173 185 228 263 295 315.1CP316069 16086 16126 1626173 185 228 263 295 315.1C21H516129 16304263 309.1C 315.1C216129 16304263 309.1C 315.1C316304263 309.1C 315.1C416304263 309.1C 315.1CSER_216129 16304263 309.1C 315.1C3NNJ1b216069 16126 16145 16222 16234 16261 1631964 73 152 263 271 295 315.1CSER_316069 16126 16145 16222 16234 1626164 73 152 263 271 295 315.1C Tomasz Grzybowski, Boris A. Malyarchuk, Jarosław Bednarek, Marcin Woźniak Nr 3 195 w populacjach europejskich podkladu w obrębie J1b.Przypuszczenie takie oparte jest na obserwacji mu-tacji C271T w HVS II, przy jednoczesnym braku tran-zycji w pozycji 242, diagnostycznej dla podhaplo-grupy J1b1 [9]. Do chwili obecnej opublikowanotylko jedną pełną sekwencję genomu mitochondrial-nego należącego do J1b z tranzycją w pozycji 271(z populacji Indii) [9]. W celu dokładnego określe-nia statusu filogenetycznego haplotypów uzyska-nych w Przypadku 3, przeprowadzono analizę se-kwencji pełnych genomów mitochondrialnych pró-bek oznaczonych jako „NN” oraz „SER_3”, po czymdokonano rekonstrukcji filogenezy podhaplogrupyJ1b w wykorzystaniem nowych danych (rycina 1). Analiza sekwencji wykazała, że pełne genomy mi-tochondrialne próbki dowodowej i porównawczejróżnią się tylko w pozycji 16319.Z drzewa filogenetycznego przedstawionego narycinie 1 wynika, że genomy analizowane w Przy-padku 3 należą do podhaplogrupy J1b2, zdefinio-wanej poprzez tranzycje w pozycjach 271 i 16519.Należy zwrócić uwagę, że taka definicja może miećcharakter tymczasowy, gdyż włączenie do analizykolejnych danych o sekwencjach pełnych genomówmoże zmienić topologię drzewa filogenetycznego.W szczególności warto zauważyć, że pozycja 16519uważana jest za kolejne „gorące miejsce” mutacji.Częstość podhaplogrupy J1b2 jest w chwili obec-nej trudna do ustalenia, gdyż wiele zespołów ba-dawczych nie uwzględnia w swych badaniach po-pulacyjnych sekwencji regionu HVS II. We wcze-śniejszych badaniach własnych zidentyfikowanohaplotypy pozbawione tranzycji w pozycji 242,a jednocześnie posiadające mutację C271T (lub jejpozbawione) w populacjach Bliskiego Wschodu(Persowie z Iranu) oraz południowo-zachodnieji południowo-wschodniej Syberii (Ałtajczycy, Buriaci)[6]. Najwyższe częstości J1b2 zanotowano u Per-sów z Iranu (ok. 3.7 %) [6], jednak w populacji tejwszystkie haplotypy należące do J1b2 były pozba-wione tranzycji C1622T, zanotowanej w próbkachbadanych w ramach Przypadku 3 (tabela I). Biorącpod uwagę całokształt przytoczonych danych filo-geograficznych należy się spodziewać, że podha-plogrupa J1b2 osiąga najwyższe częstości i we-wnętrzne zróżnicowanie w populacjach północno-zachodniego Iranu. Zważywszy jednak na niewielkąliczebność baz danych sekwencji HVS I i HVS IIz tego regionu, ich zastosowanie do obliczeń czę-stości haplotypów w sprawach sądowych nie wy-daje się stosowne. Najmniejszym podkladem, doktórego można zaliczyć haplotypy uzyskane w ra-mach Przypadku 3 jest zatem podhaplogrupa J1b.Częstość tego podkladu w bazie danych wynosi 17/1465, czyli 1.2 x 10 -2 . Mutacja G16319A należy do ANALIZA FILOGEOGRAFICZNA Ryc. 1. Drzewo filogenetyczne podhaplogrupy J1b utwo-rzone metodą największej oszczędności, zrekonstruowa-ne z wykorzystaniem sekwencji pełnych genomów mito-chondrialnych i ukorzenione za pomocą poprawionejsekwencji referencyjnej (rCRS) [8] jako grupy zewnętrz-nej. Sekwencje uzyskane w ramach niniejszej pracy opi-sano jako „NN” i „SER_3”. Sekwencję mtDNA uzyskanąprzez Palanichamy i wsp. [9] z populacji Indii oznaczono jako „MGP#R80”. Gałęzie drzewa oznaczono za pomo-cą pozycji nukleotydowych sekwencji mtDNA, wedługnumeracji zastosowanej dla rCRS [8]. Brak zasady obokpozycji sekwencji oznacza tranzycję. Z analizy wyłączo-no polimorfizmy długości towarzyszące pozycjom 309i 315 regionu HVS II.Fig. 1. The most parsimonious tree of the complete sub-haplogroup J1b mtDNA sequences, rooted with the revi-sed Cambridge reference sequence (rCRS) [8] as anoutgroup. The tree includes 3 mtDNAs, out of which twoare novel (“NN” and “SER_3] and one (from the Indianpopulation, designated as “MGP#R80”) was reported byPalanichamy et al. [9]. Mutations are shown on the bran-ches and are transitions. The hypervariable nucleotides(the indels) at nucleotides 309 and 315 in HVS II wereexcluded.
