Zestaw Do Izolacji Dna Z Krwi świeżej I Mrożonej

Transcript

Nr kat. EM05 Wersja zestawu: 1.2014 Zestaw do izolacji DNA z krwi świeżej i mrożonej EXTRACTME® jest zastrzeżonym znakiem towarowym firmy BLIRT S.A. www.dnagdansk.com Nr kat. EM05 I. PRZEZNACZENIE ZESTAWU Zestaw EXTRACTME DNA BLOOD przeznaczony jest do szybkiej i wydajnej izolacji genomowego DNA o wysokiej czystości z krwi świeżej lub mrożonej (ludzkiej lub ssaczej). Protokół izolacji i składy buforów zostały zoptymalizowane w celu osiągnięcia zarówno wysokiej wydajności, jak i czystości izolowanego DNA. Produkt przeznaczony jest wyłącznie do użytku w celach badawczych. II. SKŁAD I PRZECHOWYWANIE ZESTAWU 50 IZOLACJI 150 IZOLACJI 250 IZOLACJI 3 IZOLACJE (DEMO) EM05–050 EM05–150 EM05–250 EM05–D RBC Lysis Buffer 50 ml 150 ml 250 ml 3 ml WBC Lysis Buffer 10 ml 30 ml 50 ml 600 µl 1 szt. 3 szt. 5 szt. 1 szt. Proteinase Buffer 200 µl 600 µl 1 ml 200 µl BB Buffer (Binding Buffer) 20 ml 60 ml 100 ml 1,2 ml BW Buffer (Wash Buffer) 50 ml 150 ml 250 ml 3 ml Elution Buffer 10 ml 3 x 10 ml 5 x 10 ml 600 µl DNA Purification Columns 50 szt. 3 x 50 szt. 5 x 50 szt. 3 szt. Collection Tubes (2 ml) 50 szt. 3 x 50 szt. 5 x 50 szt. 3 szt. LICZBA IZOLACJI Nr katalogowy (Red Blood Cell Lysis Buffer) (White Blood Cell Lysis Buffer) Proteinase K (lyophilized) Proteinaza K dostarczana jest w postaci liofilizowanej. Każda probówka zawiera odpowiednią ilość proteinazy K do przeprowadzenia 50 izolacji. Liofilizat proteinazy K należy przechowywać w temp. +4°C. Przed pierwszym użyciem liofilizat należy rozpuścić w 200 µl buforu do proteinazy (Proteinase Buffer). Roztwór proteinazy K należy przechowywać w temp. -20°C! Pozostałe składniki zestawu należy przechowywać w temp. pokojowej (15-25°C). Wszystkie roztwory z zestawu należy przechowywać szczelnie zamknięte, aby uniknąć zmiany stężeń w wyniku parowania. Odpowiednio przechowywany zestaw zachowuje stabilność minimum przez okres 12 miesięcy. 3 III. WYMAGANE MATERIAŁY I SPRZĘT pp pp pp pp pp pp jałowe probówki wirownicze typu Eppendorf (1,5–2 ml) pipety automatyczne oraz odpowiednie końcówki do pipet rękawiczki jednorazowe mikrowirówka z rotorem na 1,5–2 ml probówki (> 11 tys. x g) termoblok lub łaźnia wodna (do 70°C) worteks IV. ZASADA IZOLACJI Procedura oczyszczania DNA składa się z 5 etapów i przeprowadzana jest z wykorzystaniem minikolumn wirowniczych, zawierających odpowiednie złoże krzemionkowe wydajnie i selektywnie wiążące kwasy nukleinowe. Pierwszym etapem jest liza erytrocytów, mająca na celu oddzielenie białych krwinek od liczniejszych bezjądrzastych krwinek czerwonych, które nie posiadają materiału genetycznego, a stanowią potencjalne źródło inhibitorów reakcji enzymatycznych. Następnie frakcja białych krwinek poddawana jest lizie enzymatycznej z wykorzystaniem zoptymalizowanego buforu WBC Lysis Buffer oraz silnej proteazy (proteinazy K). W tym etapie następuje degradacja błon i białek komórkowych. Po dodaniu soli chaotropowych, lizat przenoszony jest do minikolumny ze złożem. Dwuetapowe przemywanie DNA związanego do złoża ma na celu usunięcie pozostałych zanieczyszczeń i/lub inhibitorów reakcji enzymatycznych. Oczyszczone DNA eluowane jest ze złoża buforem o niskiej sile jonowej (Elution Buffer) lub wodą (pH 7,0–9,0) i jest gotowe do bezpośredniego wykorzystania w technikach biologii molekularnej (takich jak PCR, qPCR, Southern blotting, sekwencjonowanie DNA, trawienie enzymami restrykcyjnymi, ligacja DNA itp.) lub może być przechowywane do późniejszego użycia. V. KONTROLA JAKOŚCI Każda partia produkcyjna (LOT) zestawu EXTRACTME DNA BLOOD testowana jest według opracowanych procedur. Wydajność, czystość oraz stabilność wyizolowanego DNA analizowane są metodami spektrofotometrycznymi oraz elektroforetycznymi. Dodatkowo funkcjonalna jakość oczyszczonego DNA sprawdzana jest w reakcji PCR, qPCR oraz reakcji trawienia enzymami restrykcyjnymi. www.dnagdansk.com 4 Nr kat. EM05 VI. SPECYFIKACJA PRODUKTU MATERIAŁ WYJŚCIOWY krew świeża lub mrożona (do 1 ml) WYDAJNOŚĆ IZOLACJI 3–10 µg DNA z 200 µl ludzkiej krwi POJEMNOŚĆ ZŁOŻA ok. 27 µg DNA CZAS IZOLACJI ok. 25 minut CZYSTOŚĆ DNA A 260/A 280 = 1,7–1,9 VII. ŚRODKI OSTROŻNOŚCI pp pp pp pp pp pp 5 Krew jest materiałem niebezpiecznym ze względu na potencjalną zawartość mikroorganizmów patogennych lub substancji zagrażających zdrowiu, bądź życiu człowieka. Przy pracy z próbkami krwi należy stosować się do wymogów dotyczących biologicznych materiałów niebezpiecznych. Zaleca się przeprowadzać całą procedurę izolacji w komorze II klasy bezpieczeństwa biologicznego lub przy palniku laboratoryjnym, używać ochronnej odzieży laboratoryjnej oraz rękawiczek jednorazowych. Zalecane jest używanie jałowych końcówek z filtrami do pipet. Należy unikać dotykania ścianek minikolumn pipetą, aby nie przenosić śladowych ilości DNA pomiędzy kolejnymi minikolumnami. Odpady zawierające sole guanidyny mogą tworzyć wysoce reaktywne związki w połączeniu z substancjami utleniającymi. W przypadku rozlania buforu, powierzchnię zmyć wodą z detergentem. W przypadku rozlania cieczy zawierającej krew, zanieczyszczoną powierzchnię zmyć wodnym roztworem detergentu. VIII. SZCZEGÓLNE ZALECENIA I UWAGI Elucja DNA ze złoża Optymalną objętość buforu elucyjnego (Elution Buffer) należy dobrać w zależności od ilości materiału użytego do izolacji oraz od wymaganego poziomu stężenia DNA w eluacie. Zaleca się stosowanie 50–100 μl Elution Buffer przy izolacji ze 100–500 μl krwi oraz zwiększenie objętości buforu elucyjnego do 200 μl w przypadku izolacji z 500–1000 μl krwi. Ilość oczyszczonego DNA zależy od rodzaju próbki oraz ilości komórek w próbce (wieku pacjenta, stanu jego zdrowia, warunków transportu próbek, sposobu i czasu ich przechowywania). Zwykle wydajność izolacji z 200 µl krwi zdrowej osoby wynosi 3–10 µg DNA. Podczas izolacji DNA z próbek zawierających podwyższoną ilość białych krwinek (3 x 106 –1 x 107 komórek/ml) można otrzymać większą ilość DNA. Jeśli pożądane jest otrzymanie DNA o wysokim stężeniu, objętość buforu elucyjnego można zmniejszyć nawet do 20 μl. Należy mieć jednak na uwadze, że obniży to wydajność odzysku DNA. Istotne w tym przypadku jest dodanie buforu elucyjnego centralnie na powierzchnię złoża. W celu uzyskania maksymalnej wydajności elucji DNA, bufor elucyjny należy podgrzać do temp. 80°C i wydłużyć czas inkubacji złoża z buforem do 10 minut. Jeśli istotne jest odzyskanie całkowitego DNA z minikolumny można przeprowadzić dodatkową elucję (200 μl). W tym przypadku należy powtórzyć punkty 19–22 Protokołu izolacji, umieszczając minikolumnę w nowej probówce 1,5 ml typu Eppendorf. Elution Buffer zawiera 0,5 mM EDTA, którego obecność może przeszkadzać w niektórych reakcjach enzymatycznych (np. sekwencjonowanie DNA). Do elucji DNA można użyć także buforu 5-10 mM Tris-HCl, pH 8,0-9,0, innych buforów do specyficznych aplikacji, o pH i stężeniu soli zbliżonych do tego buforu lub wody (pH 7,0-9,0). Zanieczyszczenia RNA Obecność śladowych ilości RNA może niekorzystnie wpływać na niektóre reakcje enzymatyczne, ale nie wpływa na inhibicję PCR. Jeśli niezbędne jest otrzymanie oczyszczonego preparatu genomowego DNA wolnego od RNA należy dodać 4 μl roztworu RNazy A (10 mg/ml; nr kat. RP14, RP145) do próbki po zawieszeniu w WBC Lysis Buffer (pkt. 5 Protokołu izolacji). Wymieszać i inkubować przez 5 min w temp. 37°C, a następnie przejść do pkt. 6 Protokołu izolacji. www.dnagdansk.com 6 Nr kat. EM05 IX. PRZYGOTOWANIE PRÓBKI W przypadku krwi świeżej, przed przystąpieniem do izolacji próbkę należy zmieszać z odpowiednią ilością antykoagulantu (EDTA, cytrynian). Jeśli do próbki był już uprzednio dodany antykoagulant, ten etap należy pominąć. Próbkę krwi można przechowywać w obecności antykoagulantów (EDTA, cytrynian) w temp. +4°C (do 24 h) lub w postaci zamrożonej (preferowana temp.  -80°C). Należy unikać częstego rozmrażania i zamrażania próbek przed izolacją DNA. Przed pobraniem odpowiedniej objętości krwi do izolacji należy dokładnie wymieszać krew przez odwracanie probówki, z której materiał ma zostać pobrany. W przypadku krwi mrożonej należy odczekać kilka minut do całkowitego rozmrożenia próbki. W niektórych przypadkach możliwe jest powstanie trwałego skrzepu czerwonych komórek krwi. Skrzep należy dokładnie rozbić poprzez intensywne worteksowanie lub/i pipetowanie krwi zmieszanej z buforem RBC Lysis Buffer. Następnie należy prowadzić izolację zgodnie z protokołem, a przed naniesieniem lizatu na złoże minikolumny (pkt. 11 Protokołu izolacji) dodać dodatkowy etap wirowania 1 min przy 10–14 tys. rpm, a na złoże nanieść supernatant znad powstałego osadu. Gdy objętość próbki krwi jest mniejsza niż 200 μl, należy dodać Elution Buffer lub roztworu PBS (brak w zestawie) do całkowitej objętości 200 μl, a następnie przejść do pkt. 1 Protokołu izolacji. X. PRZED PRZYSTĄPIENIEM DO IZOLACJI 1. 2. Każdy z odczynników zestawu należy wymieszać. Należy pamiętać o rozpuszczeniu liofilizatu Proteinase K w odpowiedniej ilości buforu do proteinazy (200 µl Proteinase Buffer na jedną probówkę liofilizatu). W przypadku wytrącenia osadu w buforach, butelkę z roztworem należy ogrzać do temp. 37°C (BW Buffer) lub 50–60°C (pozostałe bufory) i inkubować, aż do całkowitego rozpuszczenia osadu, mieszając co kilka minut, a następnie schłodzić do temp. pokojowej. Nagrzać termoblok lub łaźnię wodną do temp. 65°C. 3. 4. 5. 6. 7. 7 Ogrzać odpowiednią ilość buforu elucyjnego do temp. 70°C. Należy pamiętać, aby wszystkie etapy izolacji przeprowadzać w temp. pokojowej, jeśli nie zalecono inaczej. Wszystkie etapy wirowania zostały zoptymalizowane z wykorzystaniem mikrowirówki Eppendorf 5417C. Prędkości wirowania podane w jednostkach rpm odnoszą się do tej mikrowirówki. XI. PROTOKÓŁ IZOLACJI 1. Pobrać 200–1000 μl krwi i przenieść do probówki typu Eppendorf (1,5–2 ml), a następnie dodać 1 objętość buforu do lizy erytrocytów RBC Lysis Buffer (np. pobierając 200 μl krwi do izolacji należy dodać 200 μl buforu RBC Lysis Buffer). Gdy objętość próbki jest mniejsza niż 200 µl, uzupełnić roztworem PBS lub Elution Buffer do 200 µl, a następnie dodać 200 µl RBC Lysis Buffer. 2. Dokładnie wymieszać przez odwracanie probówki, aż powstanie klarowny czerwony roztwór. 3. Wirować 4 min przy 9 tys. rpm (8,6 tys. x g). Nie zaleca się zwiększania prędkości wirowania, gdyż może to utrudnić późniejsze zawieszanie powstałego osadu białych krwinek w buforze lizującym. 4. Ostrożnie usunąć pipetą supernatant znad osadu białych krwinek. 5. Dokładnie zawiesić osad komórek w 200 μl buforu do lizy leukocytów WBC Lysis Buffer poprzez pipetowanie. 6. Dodać 3 μl Proteinase K i wymieszać przez worteksowanie. 7. Inkubować 5 min w temp. 65°C. Jeśli osad białych krwinek nie został całkowicie zawieszony w buforze lizującym, należy przedłużyć czas inkubacji do momentu całkowitej lizy komórek, intensywnie worteksując co 1–2 min. 8. Dodać 400 μl buforu wiążącego BB Buffer i dokładnie wymieszać. 9. Inkubować kolejne 5 min w temp. 70°C. 10. Po inkubacji próbkę intensywnie worteksować przez 15–20 s. 11. Całość lizatu przenieść do minikolumny ze złożem, umieszczonej w probówce odbierającej i wirować 1 min przy 10–12 tys. rpm (11–15 tys. x g). www.dnagdansk.com 8 Nr kat. EM05 12. Przenieść minikolumnę do nowej probówki odbierającej (2 ml). 13. Dodać do minikolumny 600 μl buforu płuczącego BW Buffer i wirować 30 s przy 10–12 tys. rpm (11–15 tys. x g). 14. Wylać przesącz z probówki odbierającej i umieścić w niej z powrotem minikolumnę. 15. Dodać do minikolumny 400 μl BW Buffer i wirować 30 s przy 10–12 tys. rpm (11–15 tys. x g). 16. Wyjąć minikolumnę, wylać przesącz i umieścić ponownie minikolumnę w probówce odbierającej. 17. Wirować 1-2 min przy 12-14 tys. rpm (15-21 tys. × g). Bufor płuczący zawiera alkohol, który może powodować inhibicję niektórych reakcji enzymatycznych, a także obniżenie wydajności elucji, dlatego istotne jest jego całkowite usunięcie przed etapem elucji. 18. Ostrożnie wyjąć suchą minikolumnę z probówki odbierającej i umieścić ją w jałowej probówce 1,5 ml typu Eppendorf. 19. Nanieść 50-100 μl Elution Buffer uprzednio ogrzanego do temp. 70°C centralnie na złoże w minikolumnie. Możliwa jest zmiana objętości buforu elucyjnego w zakresie 20-200μl. Więcej wskazówek dotyczących tego etapu znajduje się w sekcji VIII. Szczególne zalecenia i uwagi. 20. Inkubować minikolumnę z buforem przez 2 min. 21. Wirować 1 min przy 10–12 tys. rpm (11–15 tys. x g). 22. Minikolumnę usunąć, a wyizolowane DNA przechowywać w temp. +4°C lub -20°C do czasu dalszych analiz. 9 XII. MOŻLIWE PROBLEMY I ICH ROZWIĄZYWANIE Problem Prawdopodobna przyczyna Rozwiązanie Niecałkowita liza czerwonych komórek krwi. Czerwone komórki krwi w materiale użytym do izolacji ulegają lizie w ograniczonym stopniu. Należy powtórzyć etap lizy erytrocytów po osuszeniu zanieczyszczonego osadu białych krwinek. Jednakże niewielka ilość czerwonych krwinek obecna w osadzie nie przeszkadza w dalszych etapach oczyszczania DNA. Powstał skrzep krwi, który nie jest lizowany przez RBC Lysis Buffer. Stary, niewłaściwie przechowywany materiał lub jego pochodzenie (np. krew szczura). Należy postępować według procedury opisanej w sekcji IX. Przygotowanie próbki (część dotycząca powstawania skrzepu). Została dodana niewystarczająca ilość antykoagulantu. Należy pobrać materiał ponownie, zwiększając dwukrotnie ilość dodawanego antykoagulantu lub postępować według procedury opisanej w sekcji IX. Przygotowanie próbki (część dotycząca powstawania skrzepu). Niewłaściwie przechowywany materiał. Zalecane jest przechowywanie próbek krwi w temp. -80°C. Należy unikać częstego rozmrażania i zamrażania próbek. Należy unikać przechowywania próbek krwi w temp. +4°C dłużej niż 24 h. Niecałkowita liza białych komórek krwi. Całkowicie zawiesić osad białych krwinek i/lub wydłużyć czas inkubacji w temp. 70°C, worteksując lizat co kilka minut. Materiał o niskiej zawartości białych komórek krwi. Zwiększyć objętość materiału do izolacji i/lub zmniejszyć objętość buforu elucyjnego do 20 μl. Niecałkowita liza białych komórek krwi. Całkowicie zawiesić osad białych krwinek i/lub wydłużyć czas inkubacji w temp. 65°C, worteksując lizat co kilka minut. Niecałkowite wysuszenie kolumny z resztek buforu płuczącego. Izolację należy powtórzyć, zwracając szczególną uwagę, aby po etapie wirowania (pkt.18) nie pozostało żadnych resztek buforu płuczącego w minikolumnie. Niecałkowita elucja DNA. Przed naniesieniem na złoże podgrzać Elution Buffer do temp. 80°C. Nanieść Elution Buffer centralnie na powierzchnię złoża. Wydłużyć czas inkubacji z Elution Buffer do 10 minut. Przeprowadzić powtórną elucję. Zwiększyć objętość Elution Buffer do 200 μl. Niewłaściwe pH buforu elucyjnego lub wody (pH <7,0). Do elucji użyć Elution Buffer. Niewłaściwe przechowywanie materiału. Zalecane jest przechowywanie próbek krwi w temp. -80°C. Należy unikać częstego rozmrażania i zamrażania próbek. Złoże minikolumny zapycha się. Niska wydajność izolacji DNA. Wyizolowane DNA jest podegradowane. Obecność RNA w Kolumna związała zarówno wyizolowanym DNA. DNA, jak i RNA. www.dnagdansk.com Jeśli obecność RNA przeszkadza w dalszych aplikacjach przeprowadzić trawienie RNA przy użyciu RNazy A (patrz sekcja VIII. Szczególne zalecenia i uwagi). 10 Nr kat. EM05 Wyizolowane DNA jest niskiej czystości. Niecałkowita degradacja białek w związku z obniżoną aktywnością proteinazy K. Sporządzić świeży roztwór proteinazy K. Upewnić się, że roztwór proteinazy K jest przechowywany w temp. -20°C. Pominięcie jednego z dwóch etapów płukania. Izolację należy powtórzyć, pamiętając o obu etapach płukania. Niecałkowite wysuszenie kolumny z resztek buforu płuczącego. Izolację należy powtórzyć, zwracając szczególną uwagę, aby po etapie wirowania (pkt.18) nie pozostało żadnych resztek buforu płuczącego w minikolumnie. XIII. BEZPIECZEŃSTWO I POSTĘPOWANIE Z PRODUKTEM RBC BUFFER, BB BUFFER Niebezpieczeństwo H302, H315, H318, H319, P280, P305+P351+P338 PROTEINASE K Niebezpieczeństwo H315, H319, H334, H335, P261, P305+P351+P338, P342+P311 BW BUFFER Niebezpieczeństwo H225, H319, H336, P210, P261, P305+P351+P338 H225 Wysoce łatwopalna ciecz i pary. H302 Działa szkodliwie po połknięciu. H315 Działa drażniąco na skórę. H318 Powoduje poważne uszkodzenie oczu. H319 Działa drażniąco na oczy. H334 Może powodować objawy alergii lub astmy lub trudności w oddychaniu w następstwie wdychania. H335 Może powodować podrażnienie dróg oddechowych. H336 Może wywoływać uczucie senności lub zawroty głowy. P210 Przechowywać z dala od źródeł ciepła/ iskrzenia/ otwartego ognia/ gorących powierzchni. Palenie wzbronione. P261 Unikać wdychania pyłu/ dymu/ gazu/ mgły/ par/ rozpylonej cieczy. P280 Stosować rękawice ochronne/ odzież ochronną/ ochronę oczu /ochronę twarzy. P305 + P351 + P338 W PRZYPADKU DOSTANIA SIĘ DO OCZU: Ostrożnie płukać wodą przez kilka minut. Wyjąć soczewki kontaktowe, jeżeli są i można je łatwo usunąć. Nadal płukać. P342 + P311 W przypadku wystąpienia objawów ze strony układu oddechowego: Skontaktować się z OŚRODKIEM ZATRUĆ lub z lekarzem. 11 www.dnagdansk.com